Summary
<em> Caenorhabditis elegan </ em> er en nyttig model til at udforske funktionerne i flerumættede fedtsyrer i udvikling og fysiologi. Denne protokol beskriver en effektiv metode til at supplere <em> C. elegans </ em> kost med flerumættede fedtsyrer.
Abstract
Fedtsyrer er essentielle for mange cellulære funktioner. De tjener som effektive energilagring molekyler, gøre op den hydrofobe kerne af membraner, og deltage i forskellige signalveje. Caenorhabditis elegans syntetiserer alle de enzymer, der er nødvendige for at producere en række af omega-6 og omega-3 fedtsyrer. Dette, kombineret med det enkle anatomi og vifte af tilgængelige genetiske redskaber, gør det til en attraktiv model for at studere fedtsyre funktion. For at undersøge den genetiske veje, der medierer de fysiologiske virkninger af kosten fedtsyrer, har vi udviklet en metode til at supplere C. elegans kost med umættede fedtsyrer. Tilskud er et effektivt middel til at ændre fedtsyresammensætningen af orme og kan også anvendes til at redde defekter i fedtsyrer-deficient mutanter. Vores metode anvender nematodevækst medium agar (NGM) suppleret med fedtsyre acidsodium salte. Fedtsyrerne i suppleret pladerne bliver integreringented i membraner i bakterielle fødekilde, som derefter taget op af C. elegans, der lever af de suppleret bakterier. Vi beskriver også en gaskromatografi protokol til at overvåge ændringer i fedtsyresammensætningen som opstår i suppleret orme. Dette er en effektiv måde at supplere kosten til både store og små bestande af C. elegans, der giver mulighed for en række applikationer til denne metode.
Introduction
Fedtsyrer er essentielle strukturelle komponenter af membraner samt en effektiv energilagerindretning molekyler. Derudover kan fedtsyrer spaltes fra cellemembranerne af lipaser og enzymatisk modificeret til at producere signalerer effektorer 1. Naturligt forekommende polyumættede fedtsyrer (PUFA) indeholder to eller flere cis-dobbeltbindinger. Omega-3-fedtsyrer og omega-6 fedtsyrer er skelnes fra hinanden baseret på positionerne af dobbeltbindinger med hensyn til methylenden af fedtsyren. Sund kost kræver både omega-6 og omega-3 fedtsyrer. Men vestlige kost er særligt rige på omega-6 fedtsyrer og fattig på omega-3 fedtsyrer. En høj omega-6 omega-3 fedtsyre-forhold er forbundet med øget risiko for hjerte-kar-og inflammatoriske sygdomme, er imidlertid de præcise gavnlige og skadelige funktioner af specifikke fedtsyrer ikke godt forstået 2. Spolorm Caenorhabditis Elegans er nyttig i at studere fedtsyre funktion, fordi det syntetiserer alle de enzymer, der er nødvendige for at producere en række af omega-6 og omega-3-fedtsyrer, herunder en omega-3 desaturase, en aktivitet, der er fraværende i de fleste dyr 3,4. Mutanter, der mangler fedtsyredesaturase-enzymer ikke producere specifikke PUFA'er, hvilket fører til en række udviklingsmæssige og neurologiske defekter 4-6.
At studere de fysiologiske effekter af kosten fedtsyrer, har vi udviklet et biokemisk assay kompatibel med genetisk analyse ved hjælp af både mutant og RNAi knock-down teknikker i C. elegans. Tilskud af specifikke PUFA'er er opnået ved tilsætning af en fedtsyre natriumsaltopløsning til agarmediet før udhældning. Dette resulterer i PUFA optagelse af E. coli fødekilde, når den akkumuleres i bakterielle membraner. C. elegans indtager de PUFA-holdige bakterier, og dette kosttilskud er tilstrækkelig til at redde defekttværsnit af PUFA-mutanter. Tilskud af de fleste fedtsyrer har ingen skadelige virkninger på vildtype dyr dog specifikke omega-6 fedtsyrer, især dihomo-gamma linolensyre (DGLA, 20:03 n-6) forårsage en permanent ødelæggelse af C. elegans kønsceller 7,8.
Gaschromatografi bruges til at overvåge udbredelsen af det supplerede fedtsyre i bakterielle fødekilde (enten OP50 eller HT115) samt i nematoder. Tilsætningen af detergent Tergitol (NP-40) i medierne giver mulighed for jævn fordeling af fedtsyrer gennem hele pladen og mere effektiv optagelse af fedtsyrer ved E. coli og nematoder. Vi har fundet, at umættede fedtsyrer let optages af bakterier og C. elegans, men optagelsen af mættede fedtsyrer er meget mindre effektiv. Denne artikel vil beskrive trin-for-trin, hvordan man supplere agar medier med fedtsyrer, samt hvordan man kan overvåge fedtsyre optagelse i the nematode hjælp gaskromatografi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Flerumættede fedtsyrer er følsomme over for varme, lys og oxygen. Derfor skal der udvises forsigtighed ved udarbejdelsen af fedtsyrer tilskud plader, således at fedtsyrer, ikke udsættes for overskydende varme og lys. NGM medier indeholdende 0,1% Tergitol (NP-40) autoklaveres og afkøles delvist, hvorefter fedtsyre natriumsalte tilsættes under konstant omrøring. Pladerne får lov til at tørre i mørke. Optagelse af fedtsyrer ved C. elegans dyrket på disse plader kan derefter blive overvåget ved gaskromatografi.
1.. Udarbejdelse af Fatty Acid Suppleret Media
- Afmål medier komponenter i en passende størrelse kolbe. Pr. 1 L, tilsættes 17 g Bacto-agar, 2,5 g trypton, 3 g NaCl, 1 ml 5 mg / ml cholesterol opløst i ethanol, og 10 ml 10% Tergitol opløst i vand.
- Tilsæt 80% af det endelige ønskede volumen Miliporevand og autoklavere medier med tomme glasflasker (svarende til antallet af forskelligefedtsyre-koncentrationer, der skal testes), samt passende graduerede cylindre.
- Cool medier i vandbad indstillet på 55 ° C. Mens medierne er køling forberede arbejdet stamopløsning af fedtsyre-natriumsalt ved at bryde åbne hætteglas hjælp sikkerhedsforanstaltninger og sikre glaspartikler ikke blandes ind med fedtsyrer. Afvejes nok fedtsyre til at lave en 100 mM arbejder materiel.
- Bring fedtsyre opløsning til en endelig koncentration på 100 mM med renset vand. Fuldt opløse fedtsyren natriumsaltet tager typisk omkring 20-30 min. Rense arbejdslager fedtsyre med argon eller nitrogen, fordi kontakt med en inert gas forhindrer oxidation. Luk hætteglasset og opbevare arbejdslager i mørke, indtil mediet er afkølet.
- (Valgfrit) Hvis der ønskes RNAi medier, måle ampicillin og isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) løsninger her.
- Når agaren er afkølet til 55 ° C tilsættes pr 1 L: 1ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, og 25 ml phosphatpuffer (108,3 g KH 2PO 4 og 35,6 g K 2 HPO 4 per 1 L autoklaveret). Tilsæt filtersteriliseret ampicillin og IPTG løsninger, hvis gøre RNAi plader. For alle typer af plader, tilsæt sterilt vand for at bringe det endelige medie volumen til 1 L.
- Nær en flamme, overføre medier til en autoklaveret og passende størrelse måleglas og derefter tilføje varmt sterilt vand til den ønskede volumen. Overfør medier tilbage til den oprindelige kolbe og blandes ved omrøring.
- Nær en flamme, overføre medier i et antal flasker svarende til antallet af fusioner skal testes ved at måle med et autoklaveret og passende størrelse måleglas. Bevar de alikvoteret medier som væske ved hjælp af et vandbad, indtil fedtsyren arbejder bestand er helt opløst.
- Placer en flaske på en omrøringsplade og rør indtil mediet er varm at røre ved, men ikke varmt. Sørg for at forlade dig selv noktid til at røre i fedtsyre stamopløsning og hæld tallerkener før mediet begynder at størkne. Hvis omrøringsplade har temperaturkontrol, skal den indstilles til 55 ° C.
- Fortynd 100 mM fedtsyre arbejdslager til mediet ved den endelige koncentration ønskes. Stir medier indtil det hvide bundfald i opløsning (ca. 1 min.) Medier kan stadig være lidt uklar bagefter.
- (Valgfrit) Hvis RNAi medier ønskes add ampicillin til 0,1 mg / ml og IPTG til 2 mM endelig koncentration.
- Hæld medier ved hjælp af en automatiseret pipette hjælp og en steril 25 ml pipette, tilføjer 8 ml medier pr 60 mm plade eller 25 ml af medier pr 100 mm plade. Gentag fedtsyre tilsætning og plade hælde trin for de resterende flasker.
- Efter at agaren er størknet, dække fedtsyren-suppleret plader med en kasse eller opbevares ved stuetemperatur i et godt ventileret skuffe til at beskytte mod lys oxidation.
- Seed E. coli OP50 på plader to dage efter plader har tørret.For 60 mm plader, pipette 300 pi af en overnatning OP50 kultur (dyrket ved 37 ° C). Hvis RNAi plader blev hældt, frø med 300 pi RNAi bakterier efter pladerne har tørret i fire dage. Plate tørretiden kan være nødvendigt at justere på grund af forskelle i fugt i forskellige lab miljøer.
- Pladerne inkuberes i mørke omgivelser ved stuetemperatur, mens den bakterielle plænen tørrer.
2. Kønscellemutation Cell Ødelæggelse ved Tilskud af DGLA
- C. elegans dyrket på plader indeholdende 0,3 mM DGLA (20:03 n-6) bliver sterile som følge af ødelæggelse af kimceller i både larvestadiet og voksne nematoder.
- Forbered en synkroniseret population af L1 larver ved at behandle Gravid hermafroditter med alkalisk hypochloritopløsning (for en løsning 10 ml: 0,5 ml 5 M NaOH, 2,5 ml blegemiddel, og 7 ml H 2 O). Vip forsigtigt af den gravide hermafroditter i denne løsning, indtil den voksne orms opløses. Æg vil blive bevaret og kan pelleteres ved centrifugering med lav hastighed.
- Vask forberedelse æg 3 gange i M9 buffer (3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H 2 O til 1 L. Tilføj MgSO4 efter autoklavering). At give tilstrækkelig ilt, resuspendere æg i et 15 ml plastrør til en endelig volumen på 5 ml M9-puffer og rock på et rysteapparat natten over.
- L1 larver bør føjes til de suppleret pladerne to dage efter såning med OP50, eller en dag efter udpladning af RNAi bakterier. Inkuber orme ved 20 ° C i tre dage, eller indtil de er udvoksede.
- Voksne orme kan scores for sterilitet ved hjælp af et dissektionsmikroskop med høj nok forstørrelse at visualisere fostre udvikler sig i livmoderen. Vellykket tab kønsceller vil fremstå som en klar livmoder tomrum af æg.
- Orme kan også scoret af fastsættelse og farvning med nukleinsyre encid farvestof diamindinophenylindole (DAPI), hvilket letter visualiseringen af kerner i kimceller og fostre. En hurtig DAPI-farvet opnås ved at udvælge orme i en dråbe af M9-puffer på et urglas 9.
- Flood watch-glas med 1 ml af en 0,2 ng / m. DAPI i 95% ethanol-opløsning, lad det sidde i ca 5 min.
- Pick orme ind i en dråbe Vectashield på et dias og derefter dække med et dækglas.
- Seal dækglas og opbevares ved 4 ° C i mørke natten over for optimal farvning, men slides kan også ses med det samme. Score for nærvær eller fravær af kim cellekerner ved hjælp af et fluorescensmikroskop udstyret med en UV-lampe og filtreres.
3. Bekræftelse Fatty Acid Optagelse ved gaskromatografi
Samlet fedtsyresammensætningen C. elegans kan bestemmes ved at fremstille fedtsyremethylestere (FAMEs), som derefter adskilles og kvantificeres ved hjælp af gas chromatography 4..
- Saml 500-1.000 voksne orme ved at vaske dem ud af pladerne med vand og overførsel til en silaniserede 13 mm x 100 mm glas skruelåg rør.
- Lad orme bosætte af tyngdekraften, og derefter fjerne så meget vand som muligt med et glas Pasteur pipette.
- Vask orme en gang med vand, og derefter igen at fjerne så meget vand som muligt.
- FAMEs dannes ved at tilsætte 1 ml 2,5% H 2 SO 4 i methanol, og derefter opvarmning ved 70 ° C i 1 time i et vandbad.
- Fjern rørene fra vandbadet og afkøles i 1 min.
- Uddrag FAMEs ved tilsætning af 1,5 ml vand og 0,25 ml hexan.
- Rekapitulere rør og rystes kraftigt.
- Centrifugerør i en bordplade klinisk centrifuge i 1 min ved maksimal hastighed til at adskille hexan fra vandigt opløsningsmiddel.
- Overfør hexan (øverste lag) til en GC hætteglas insert i en GC hætteglas, være omhyggelig med ikke at overføre nogen af den vandige fase. For GC aNALYSE er 1-2 ul FAMEs i hexan injiceres på en polær kapillargaskromatografi kolonne egnet til FAMEs analyse. Agilent 7890 GC injektoren er indstillet på 250 ° C med en strømningshastighed på 1,4 ml / min, og GC-ovnen er programmeret til en indledende temperatur på 130 ° C, som holdes i 1 min. Efterfølgende temperaturen ramped 10 ° C / min indtil 190 ° C, og trappes derefter igen ved 5 ° C / min indtil 210 ° C og holdes i yderligere 1 min.
- For at sikre, at optagelsen af DGLA er sket, analysere FAMEs af flammeioniseringsdetektor (FID) eller massespektrometri (MS) detektion, med autentiske standarder for identifikation af C. elegans fedtsyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Supplering af C. elegans diæt er begrænset af evnen af den bakterielle fødekilde til optagelse og indarbejde fedtsyre i det bakterielle membran. At bestemme evnen af E. coli OP50 at assimilere forskellige fedtsyrer i sine membraner, OP50 blev udpladet på medier uden tillæg, 0,1 mM og 0,3 mM koncentrationer af stearinsyre (18:00), natriumoleat (18:01 n-9), og natrium-DGLA (20 : 3n-6). Pladerne blev tørret ved stuetemperatur i 2 dage i mørke, og inkuberet ved 20 ° C i 3 dage. Bakterielle græsplæner blev indsamlet ved forsigtigt at skrabe plænen i vand med en flamme-steriliseret spatel. Bakterier blev pelleteret ved centrifugering og behandlet med 2,5% H 2 SO 4 i methanol for at fremstille fedtsyremethylestere, som blev analyseret ved GC / MS efter de metoder, der er anført i proceduren, trin 3. Resultaterne viser, at umættede fedtsyrer (oleat og DGLA) indarbejde OP50 i højere mængder end T han mættet fedtsyre stearinsyre (figur 1A).
Derudover blev L1 stadie N2 larver dyrket på samme parti suppleret plader og høstet efter tre dages vækst ved 20 ° C. Worms blev vasket væk af pladerne og fedtsyrer i alt orm preps blev analyseret ved GC / MS. Ændringen i suppleret fedtsyrer er afbildet i figur 1B. Disse undersøgelser viser, at tilskud af mættede fedtsyrer, ikke ændrer den relative mængde af mættede fedtsyrer i ormen væv, medens tilskud af umættede fedtsyrer steg de relative mængder af umættede fedtsyrer i C. elegans lipider. Tilsammen dataene vist i figur 1A og 1B viser, at den relative akkumulering af suppleret fedtsyrer i C. elegans korrelerer direkte med relative akkumulering af fedtsyrer i kosten E. coli.
e_content "> Vi har tidligere vist, at kosten DGLA medføre sterilitet i C. elegans 10. Figur 2 viser dosis-respons DGLA induktion af sterilitet i C. elegans. Koncentrationen af DGLA orm lipider, hvor 50% af befolkningen vil være steril er cirka 12%. interessant, kan reaktionen på DGLA ændres af genetiske mutationer i C. elegans. En nylig konklusion er, at insulin vækstfaktor-afhængige stress veje kan undertrykke DGLA-induceret ødelæggelse 8 kønscelle. supplere kosten orme, der indeholder skadelige mutationer i enten daf-2 insulin / IGF-receptoren, daf-2 (e1370) eller daf-16/FOXO transkriptionsfaktoren daf-16 (mu86) illustrerer anvendeligheden af denne metode til at trævle genetiske pathways der påvirker de fysiologiske effekter af fedt i kosten. Synchronized L1 larver blev pipetteret på DGLA suppleret medier. Efter 3-4 dages vækst blev orme scoretfor sterilitet, som bestemt ved fravær af æg i livmoderen hos voksne orme. DGLA suppleret daf-2 (e1370) mutanter var frugtbare, med lidt at ingen induceret kimcelle tab sammenlignet med vildtype (N2) orme både 0,15 mM og 0,3 mM supplementering (figur 3). Derimod DGLA suppleret orme med inaktiv FOXO (daf-16 (mu86)), der vises en højere procentdel af sterile orme sammenlignet med vildtype når fodret med plader indeholdende 0,15 mM DGLA (Figur 3).
Figur 1.. Optagelse og inkorporering af suppleret fedtsyrer ved E. coli OP50 og C. elegans. A. E. coli OP50 blev dyrket på plader indeholdende 0,1 mM eller 0,3 mM stearinsyre, natriumoleat, eller natrium-DGLA samt un-suppleret plader. Efter FIVe dages vækst på plader ved 20 ° C, E. coli blev høstet og fedtsyremethylestere blev genereret til analyse ved GC / MS. Fordi OP50 ikke producerer oliesyre eller DGLA, og producerer kun spormængder af stearinsyre, procentdelen af hver suppleret fedtsyre i E. coli lipider afslører evne OP50 til at optage suppleret fedtsyre. Fejllinjer er SD. B. Ændring i C. elegans fedtsyrer hos unge voksne, der dyrkes i tre dage, startende på L1 stadium, på E. coli-plader indeholdende 0,1 mM eller 0,3 mM stearinsyre, natriumoleat eller DGLA. Værdierne for forandring i stearinsyre og DGLA blev opnået ved at subtrahere den relative mængde af 18:00 eller 20:03 i orme dyrket på suppleret plader fra de orme dyrket på unsupplmented plader. At overvåge optagelse af oliesyre, summen af oliesyre plus downstream C20 PUFA (20:3, 20:4 n-6, 20:4 n-3 og 20:5), blev beregnet i suppleret og usuppleret plates, fordi indarbejdet oliesyre yderligere umættede og langstrakt. Fejllinjer er SD. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Stigende koncentrationer af DGLA i ormen lipider korrelerer med stigende sterilitet i C. elegans. Vildtype (N2) orme blev behandlet med forskellige koncentrationer af DGLA. Den% DGLA i alt ormen lipider og% af befolkningen, der er steril er plottet for plottet i 17 datapunkter fra fem uafhængige fodring eksperimenter ved hjælp af kosten DGLA koncentrationer 0-0,3 mM DGLA. Klik her for at se større billede .
Figur 3. Fysiologiske virkninger af at supplere C. elegans med DGLA. Starved L1 larve vildtype, daf-2 (e1370) eller daf-16 (mu86) udpladedes på un-suppleret, 0,15 mM eller 0,3 mM DGLA supplerede medier og vokset til det voksne stadium. Mindst 150 individuelle orme blev derefter scoret til sterilitet. Daf-2 (e1370) mutanter var næsten helt frugtbar, selv ved 0,3 mM DGLA, mens daf-16 (mu86) mutanter viser et øget antal af sterile orme i forhold til vildtype på 0,15 mM DGLA. Fejllinjer er SEM. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en fremgangsmåde til supplering af C. elegans med kosten umættede fedtsyrer. Som nævnt ovenfor, skal man passe på i udarbejdelsen af PUFA suppleret plader fordi den reaktive karakter af dobbeltbindinger i flerumættede fedtsyrer forårsager disse fedtsyrer for at være følsomme over for oxidation gennem varme og lys 11. For at undgå oxidation, er det vigtigt at tilsætte PUFA'en til væsken agarmedium, når mediet er afkølet til 55 ° C og lagrer plader i et mørkt miljø.
Andre har indført frie fedtsyrer til C. elegans ved hjælp af en DMSO eller ethanol bærer eller andet ved direkte tilsætning af fedtsyrer ved mikroinjektion i vulva 12-14. Delvis redning af mutante fænotyper blev opnået ved fedtsyre tilskud af vækstzoner uden brug af Tergitol (NP40) 14-15. Der er tilsyneladende en række effektive måder at indføre fedtsyre i C. elegans, selv om det er difficult at sammenligne effektiviteten af forskellige metoder, fordi i de fleste eksperimenter blev optagelsen af fedtsyrer i nematoder ikke overvåget. Vi finder, at vores metode giver mulighed for konsekvent og effektivt tilskud af umættet fedtsyre til befolkningstal størrelser af nogle få nematoder til titusinder.
Vi har fundet det vigtigt at overvåge optagelsen af suppleret fedtsyrer i C. elegans at støtte i fortolkningen af eksperimentelle resultater. For eksempel optagelse fedtsyre af bakterien fødevarer afhænger af E. coli-stamme, der anvendes som en fødekilde for nematoder. Vi har fundet, at OP50 optager større mængder af umættede fedtsyrer end E. coli stammer HT115 HB101 eller NA22, stammer, der almindeligvis anvendes til fodring RNAi forsøg (HT115) eller anvendes til high density nematodevækst (HB101, og NA22). På grund af den variation i optagelsen af visse fedtsyrer, er det vigtigt at teste flere koncentrationer af fedtsyre ogat overvåge optagelse anvendelse af gaskromatografi. De fleste laboratorier har opnået redning af mutant fænotyper anvender fedtholdige koncentrationer syre i intervallet 0,08-0,2 mM 5,6,15-18 imidlertid blevet rapporteret effekter på levetid med tilskud af arachidonsyre ved en koncentration så lav som 0,01 mm 14 , og andre har brugt doser så høje som 0,6 mM for redning af en fænotype induceret ved fodring RNAi hjælp af HT115 E. coli stamme 19. I vores hænder, tilskud af E. coli OP50 med meget høje koncentrationer af PUFA, større end 0,4 mM, resultere i en overdreven kosten PUFA ophobning i ormen lipider op til 50% af de samlede fedtsyrer. Dette fører til uspecifikke langsom vækst og abnormiteter af vulva.
En begrænsning af den teknik er den manglende evne til effektivt at supplere med mættede fedtsyrer. Opløselighed spørgsmål på tidspunktet for at tilføje supplement til medierne samt den ineffektive optagelse og integration af SATUmærke fedtsyrer i E. coli forlade denne fremgangsmåde mere velegnet til at supplere umættede fedtsyrer (figur 1).
Vores metode giver reproducerbar tilskud af mono-og flerumættede fedtsyrer, herunder fedtsyrer, der normalt ikke produceres af C. elegans, såsom docosahexaensyre (DHA, 22:06 n-3). Vækst og neurologiske defekter i PUFA-mutanter såsom fedt-3 kan reddes ved relativt lave niveauer af kosten PUFA 5.. Fedtsyrer tilskud kan bruges af forskere, der ønsker at ændre fedtsyresammensætningen i C. elegans ved kosten midler for at studere en række fysiologiske processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Chris Webster til at udføre de indledende forsøg er vist i figur 3 i de repræsentative resultater, og Jason Watts og Chris Webster for nyttige kommentarer til manuskriptet. Finansieringen af denne undersøgelse blev leveret af en bevilling fra National Institutes of Health (USA) (R01DK074114) til JLW. Nogle nematode stammer, der anvendes i dette arbejde blev leveret af Caenorhabditis Genetik Center, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programmer (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| Tryptone | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | (5 mg/mL in ethanol) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| Sodium dihomogamma linolenate | NuCHEK | S-1143 | |
| Warm sterile Millipore water | |||
| Sterile water for collecting worms | |||
| Nuclease-free Water for DGLA stock solution | Ambion | AM9932 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | 100 mg/ml in water (for RNAi plates) |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 1 M in water (for RNAi plates) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H302-4 | |
| diamindinophenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glass Flask | Corning | 4980-2L | |
| Autoclaveable Glass bottles with stirbars | Fisherbrand | FB-800 | |
| Autoclaveable Glass Graduated Cylinder | Fisherbrand | 08-557 | |
| Stir Plate | VWR | 97042-642 | |
| Waterbath at 55+ °C | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| Screwcap Brown Glass Vial | Sun SRI | 200 494 | |
| Argon gas tank | |||
| Automated Pipette aid | Pipette-Aid | P-90297 | |
| Sterile Serological Pipettes (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| Dissection microscope | Leica | TLB3000 | |
| Silanized glass tube | Thermo Scientific | STT-13100-S | for FAMEs derivitization |
| PTFE Screw caps | Kimble-Chase | 1493015D | |
| Clinical tabletop centrifuge | IEC | ||
| GC Crimp Vial | SUN SRi | 200 000 | |
| GC Vial Insert | SUN SRi | 200 232 | |
| GC Vial cap | SUN SRi | 200 100 | |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890A | |
| Mass Spectrometry Detector | Agilent | 5975C | |
| Column for gas chromatography | Suppelco | SP 2380 | 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column |
References
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
- Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
- Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetics. 163, 581-589 (2003).
- Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
- Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
- Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetics. 145, 111-121 (1997).
- Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
- Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
- Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
- Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
- Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, 865-875 (2007).
- Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
- Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).
