Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مكملات غذائية من الأحماض الدهنية غير المشبعة في Published: November 29, 2013 doi: 10.3791/50879
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1School of Molecular Biosciences, Washington State University, 2Center for Reproductive Biology, Washington State University

Summary

<EM> انواع معينة elegan <م /> هو نموذج مفيدة لاستكشاف وظائف الأحماض الدهنية غير المشبعة في التنمية وعلم وظائف الأعضاء. يصف هذا البروتوكول وسيلة فعالة لالمكمل لC. <EM> ايليجانس <م /> اتباع نظام غذائي مع الأحماض الدهنية غير المشبعة.

Abstract

الأحماض الدهنية ضرورية للعديد من الوظائف الخلوية. كما أنها تخدم كفاءة جزيئات تخزين الطاقة، وتشكل جوهر مسعور من الأغشية، والمشاركة في مختلف مسارات الإشارات. يجمع جميع انواع معينة ايليجانس من الإنزيمات اللازمة لإنتاج مجموعة من الأحماض أوميغا 6 وأوميغا 3 الدهنية. هذا، جنبا إلى جنب مع علم التشريح بسيطة ومجموعة من الأدوات الجينية المتاحة، وجعلها نموذجا جذابا لدراسة الأحماض الدهنية وظيفة. من أجل التحقيق في مسارات الوراثية التي تتوسط الآثار الفسيولوجية من الأحماض الدهنية الغذائية، قمنا بتطوير طريقة لتكملة C. ايليجانس النظام الغذائي مع الأحماض الدهنية غير المشبعة. مكملات هو وسيلة فعالة لتغيير تكوين الأحماض الدهنية من الديدان، ويمكن أيضا أن تستخدم لانقاذ عيوب في المسوخ التي تعاني من نقص حمض الدهنية. يستخدم أسلوب لدينا الخيطية النمو المتوسطة أجار (NGM) تستكمل مع الأملاح acidsodium الدهنية. الأحماض الدهنية في لوحات تستكمل تصبح incorporaتيد في أغشية المصدر الغذائي البكتيري، والتي يتم بعد ذلك تناولها من قبل C. ايليجانس التي تتغذى على البكتيريا تستكمل. نحن أيضا وصف بروتوكول اللوني للغاز لرصد التغيرات في تكوين الأحماض الدهنية التي تحدث في الديدان تستكمل. هذا هو وسيلة فعالة لتكملة الوجبات الغذائية للسكان على حد سواء كبيرة وصغيرة من C. ايليجانس، والسماح لمجموعة من التطبيقات لهذا الأسلوب.

Introduction

الأحماض الدهنية هي المكونات الهيكلية الأساسية للأغشية وكذلك جزيئات تخزين الطاقة بكفاءة. بالإضافة إلى ذلك، والأحماض الدهنية يمكن المشقوق من الأغشية الخلوية عن طريق الليباز ويمكن تعديل إنزيمي لإنتاج إشارة المستجيبات 1. تحدث بشكل طبيعي الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (PUFAs) تحتوي على اثنين أو أكثر من روابط مزدوجة رابطة الدول المستقلة. وتتميز الأحماض الدهنية أوميغا 3 والأحماض الدهنية أوميغا 6 من بعضها البعض على أساس المواقف من السندات مزدوجة فيما يتعلق نهاية الميثيل للحمض الدهني. النظم الغذائية الصحية تتطلب كلا أوميغا 3 الأحماض الدهنية أوميغا 6 و. ومع ذلك، الوجبات الغربية غنية وخاصة في أحماض أوميغا 6 والأحماض الدهنية والفقراء في أحماض أوميغا 3 الدهنية. ويرتبط أوميغا 6 ارتفاع نسبة أوميغا 3 الأحماض الدهنية لمع زيادة مخاطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية والتهابات، ولكن، وظائف محددة المفيدة والضارة من الأحماض الدهنية محددة وغير مفهومة جيدا 2. الدودة رائع والذوا انواع معينةنانوثانية مفيد في دراسة الدهنية حمض ظيفة لأنه يجمع كل من الإنزيمات اللازمة لإنتاج مجموعة من الأحماض أوميغا 6 وأوميغا 3 الدهنية، بما في ذلك desaturase أوميغا 3، وهو نشاط غير موجودة في معظم الحيوانات 3،4. المسوخ التي تفتقر إلى الانزيمات الدهنية حمض desaturase تفشل لإنتاج PUFAs محددة، مما يؤدي إلى مجموعة من العيوب التنموية والعصبية 4-6.

لدراسة الآثار الفسيولوجية من الأحماض الدهنية الغذائية، وقد وضعنا مقايسة البيوكيميائية متوافقة مع التحليل الجيني باستخدام كل متحولة ورني تقنيات تدق إلى أسفل في C. ايليجانس. ويتحقق مكملات مع PUFAs معينة عن طريق إضافة الأحماض الدهنية الحل ملح الصوديوم إلى المتوسطة أجار قبل صب. هذه النتائج في بوفا امتصاص من قبل E. مصدر الغذاء القولونية، حيث يتراكم في الأغشية البكتيرية. C. ايليجانس استيعاب البكتيريا التي تحتوي على بوفا، وهذه المكملات الغذائية هي كافية لانقاذ defecTS من المسوخ بوفا التي تعاني من نقص. مكملات معظم الأحماض الدهنية ليس له أي آثار ضارة على نوع الحيوانات البرية، ومع ذلك، أوميغا 6 والأحماض الدهنية محددة، وخاصة dihomo غاما حمض اللينولينيك (DGLA، 20:03 ن 6) يسبب الدمار الدائمين في C. الخلايا الجرثومية ايليجانس 7،8.

ويستخدم الغاز اللوني لمراقبة امتصاص الأحماض الدهنية تستكمل في مصدر الغذائي الجرثومي (إما OP50 أو HT115)، وكذلك في الديدان الخيطية. إضافة إلى Tergitol المنظفات (NP-40) في وسائل الإعلام حتى يسمح لتوزيع الأحماض الدهنية من خلال لوحة كاملة وأكثر كفاءة امتصاص الأحماض الدهنية من قبل E. القولونية والديدان الخيطية. لقد وجدنا أن الأحماض الدهنية غير المشبعة تؤخذ بسهولة من قبل البكتيريا وC. ايليجانس، ولكن امتصاص الأحماض الدهنية المشبعة أقل كفاءة بكثير. هذه المادة سوف تصف خطوة بخطوة كيفية استكمال وسائل الإعلام أجار مع الأحماض الدهنية، وكذلك كيفية مراقبة امتصاص الأحماض الدهنية في اله الديدان الخيطية باستخدام كروماتوغرافيا الغاز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة هي حساسة للحرارة والضوء والأكسجين. لذا، يجب توخي الحذر عند إعداد لوحات مكملات الأحماض الدهنية الأحماض الدهنية بحيث لا يتعرض للحرارة الزائدة وضوء. وسائل الإعلام NGM تحتوي على 0.1٪ Tergitol (NP-40) وتعقيمها وتبريده بشكل جزئي، وبعد ذلك تضاف أملاح الصوديوم الأحماض الدهنية مع التحريك المستمر. ويسمح لوحات لتجف في الظلام. امتصاص الأحماض الدهنية بواسطة C. مثقف ايليجانس على هذه اللوحات ومن ثم يمكن رصدها من قبل اللوني للغاز.

1. إعداد الأحماض الدهنية تستكمل وسائل الإعلام

  1. قياس من مكونات وسائل الإعلام إلى قارورة بحجم مناسب. لكل 1 لتر، إضافة 17 غرام Bacto أجار، 2.5 غرام تريبتون، 3 غرام كلوريد الصوديوم، 1 مل 5 ملغ / مل الكولسترول الذائبة في الايثانول، و 10 مل 10٪ Tergitol المذاب في الماء.
  2. إضافة 80٪ من حجم المطلوب النهائي من الماء ميليبور والأوتوكلاف وسائل الإعلام جنبا إلى جنب مع الزجاجات الفارغة (مساو لعدد من مختلفتركيزات الأحماض الدهنية لفحصها)، وكذلك مناسبة تخرج اسطوانات.
  3. وسائل الاعلام بارد في حمام مائي تعيين إلى 55 درجة مئوية. في حين أن وسائل الإعلام والتبريد إعداد محلول المخزون عمل ملح الصوديوم الأحماض الدهنية عن طريق كسر فتح قارورة زجاجية، وذلك باستخدام احتياطات السلامة وضمان جزيئات الزجاج لا خلط في مع الأحماض الدهنية. تزن بها ما يكفي من الأحماض الدهنية لجعل مخزون العمل 100 ملم.
  4. تحقيق الحل الأحماض الدهنية إلى تركيز النهائي من 100 ملم مع الماء النقي. حل تماما الأحماض الدهنية ملح الصوديوم عادة يستغرق حوالي 20-30 دقيقة. تطهير الأسهم العمل من الأحماض الدهنية مع الأرجون أو النيتروجين، لأن الاتصال مع غاز خامل يمنع الأكسدة. قبعة القارورة وتخزين الأوراق المالية تعمل في الظلام حتى يبرد وسائل الإعلام.
  5. (اختياري) إذا كان المطلوب رني وسائل الإعلام، وقياس الأمبيسلين والآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) الحلول هنا.
  6. عندما تبرد آغار إلى 55 درجة مئوية إضافة لكل 1 L: 1مل من 1 M MgSO 4، 1 مل من 1 M و CaCl 2، و 25 مل من العازلة الفوسفات (108.3 ز KH 2 PO 4 و 35.6 ز K 2 هبو 4 في 1 L تعقيمها). إضافة عامل تصفية تعقيمها الأمبيسلين والحلول IPTG إذا صنع لوحات رني. لجميع أنواع لوحات، إضافة الماء المعقم لتبرزي حجم وسائل الاعلام النهائية إلى 1 L.
  7. بالقرب من لهب، ونقل وسائل الإعلام لتعقيمها ومناسب الحجم الاسطوانة ثم إضافة الماء المعقم الدافئ لحجم المطلوب. نقل وسائل الإعلام إلى القارورة الأولي وتخلط بواسطة التحريك.
  8. بالقرب من لهب، ونقل وسائل الإعلام إلى عدد من زجاجات مساو لعدد من تركيزات لفحصها عن طريق قياس مع تعقيمها وبحجم مناسب اسطوانة تخرج. الحفاظ على وسائل الإعلام aliquoted كسائل باستخدام حمام مائي حتى يذوب الأسهم تعمل الأحماض الدهنية تماما.
  9. وضع زجاجة واحدة على طبق من ضجة وضجة حتى وسائل الاعلام هو لمسة دافئة، ولكن ليس الساخن. تأكد من أن تترك نفسك بما فيه الكفايةالوقت لاثارة في حل الأسهم الأحماض الدهنية وتصب لوحات قبل أن تبدأ وسائل الإعلام لترسيخ. إذا وحة ضجة لديه التحكم في درجة الحرارة، وضبطها إلى 55 درجة مئوية.
  10. تمييع الأسهم العمل 100 ملم الأحماض الدهنية إلى وسائل الإعلام للتركيز النهائي المطلوب. وسائل الاعلام ضجة حتى راسب أبيض في حل (حوالي 1 دقيقة). قد تكون وسائل الاعلام لا تزال غائمة قليلا بعد ذلك.
  11. (اختياري) إذا كان المطلوب رني وسائل الاعلام الوظيفة الأمبيسلين إلى 0.1 ملغ / مل وIPTG إلى 2 ملي تركيز النهائي.
  12. صب سائل الإعلام باستخدام المساعدات ماصة الآلي ومعقم 25 مل ماصة، مضيفا 8 مل من وسائل الإعلام في 60 ملم لوحة أو 25 مل من وسائل الإعلام لكل 100 ملم لوحة. تكرار الدهنية حمض بالإضافة لوحة وسكب خطوات لزجاجات المتبقية.
  13. بعد أن عزز آغار، وتغطي لوحات تستكمل الأحماض الدهنية مع مربع أو تخزينها في درجة حرارة الغرفة في درج تنفيس جيدا للحماية من الأكسدة الخفيفة.
  14. البذور E. القولونية OP50 على لوحات بعد يومين جفت لوحات.لوحات 60 مم، ماصة 300 ميكرولتر من ثقافة OP50 بين عشية وضحاها (نمت عند 37 درجة مئوية). إذا تم سكب وحات رني، البذور مع 300 ميكرولتر من البكتيريا رني بعد أن جفت لوحات لمدة أربعة أيام. قد تحتاج لوحة وقت التجفيف لتعديلها بسبب الاختلافات في نسبة الرطوبة في البيئات المختبر المختلفة.
  15. احتضان لوحات في بيئة مظلمة في درجة حرارة الغرفة في حين أن العشب البكتيرية والتجفيف.

2. حمل جرثومة تدمير الخلايا بواسطة مكملات من DGLA

  1. C. ايليجانس نمت على لوحات تحتوي على 0.3 ملي DGLA (20:03 ن 6) تصبح عقيمة بسبب تدمير الخلايا الجرثومية في كل مرحلة اليرقات والديدان الخيطية الكبار.
    1. إعداد السكان متزامنة من L1 اليرقات عن طريق علاج المنحرفين حامل مع محلول هيبوكلوريت القلوية (عن حل 10 مل: 0.5 مل من هيدروكسيد الصوديوم 5M، 2.5 مل من التبييض المنزلي، و 7 مل H 2 O). صخرة بلطف حامل المنحرفين في هذا الحل حتى الدودةق حل. سيتم الحفاظ البيض، ويمكن من خلال مكعبات انخفاض سرعة الطرد المركزي.
    2. غسل إعداد البيض 3 مرات في المنطقة العازلة M9 (3 غ KH 2 PO 4، 6 ز نا 2 هبو 4، 5 غرام كلوريد الصوديوم، 1 مل 1 M MgSO 4، H 2 O إلى 1 L. إضافة MgSO 4 بعد التعقيم). لتوفير ما يكفي من الأوكسجين، resuspend والبيض في 15 مل أنبوب بلاستيكي إلى الحجم النهائي من 5 مل من العازلة M9 والصخور على شاكر بين عشية وضحاها.
    3. وينبغي أن يضاف L1 اليرقات إلى لوحات تستكمل بعد يومين من البذر مع OP50، أو يوم واحد بعد الطلاء البكتيريا رني. احتضان الديدان عند 20 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام أو حتى تصل إلى مرحلة البلوغ.
  2. الديدان البالغة يمكن سجل للعقم باستخدام مجهر تشريح مع التكبير عالية بما يكفي لتصور الأجنة النامية في الرحم. ستظهر ناجحة فقدان الخلية الجرثومية كما فراغا الرحم واضحة من البيض.
  3. ويمكن أيضا أن الديدان سجل عن طريق تحديد وتلطيخ مع النووي وإدارة البحث الجنائي صبغ diamindinophenylindole (دابي)، مما يسهل التصور من النوى في الخلايا الجرثومية والأجنة النامية. ويتحقق وصمة عار دابي السريع عن طريق التقاط الديدان إلى قطرة من العازلة M9 على زجاجة ساعة 9.
    1. الفيضانات ساعة من الزجاج مع 1 مل من 0.2 نانوغرام / م. دابي في 95٪ من محلول الإيثانول، واسمحوا الجلوس لمدة حوالي 5 دقائق.
    2. اختيار الديدان إلى قطرة من VectaShield على شريحة، ومن ثم تغطية مع ساترة.
    3. ختم ساترة وتخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام ليلة وضحاها لتلطيخ الأمثل، ولكن الشرائح ويمكن أيضا أن ينظر إليها على الفور. يسجل لوجود أو عدم وجود نواة الخلية الجرثومية باستخدام المجهر مضان مجهزة مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية والتصفية.

3. مؤكدا امتصاص الأحماض الدهنية بواسطة اللوني للغاز

عموما تكوين الأحماض الدهنية من C. يمكن تحديد ايليجانس من خلال إنتاج استرات الميثيل الأحماض الدهنية (جوع) والتي يتم فصلها وكميا باستخدام مركز حقوق الإنسان الغازomatography 4.

  1. جمع 500-1،000 الديدان البالغة عن طريق غسل أجبرتها على الفرار من لوحات بالماء ونقل إلى silanized 13 مم × 100 مم الزجاج أنبوب رأس المسمار.
  2. اسمحوا الديدان تسوية عن طريق الجاذبية، ثم قم بإزالة الماء قدر الإمكان مع ماصة باستير الزجاج.
  3. غسل الديدان مرة واحدة مع الماء، ثم مرة أخرى إزالة الماء قدر الإمكان.
  4. تتشكل جوع بإضافة 1 مل من 2.5٪ H 2 SO 4 في الميثانول، ومن ثم التدفئة على 70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حمام مائي.
  5. إزالة أنابيب من حمام الماء وتبرد لمدة 1 دقيقة.
  6. استخراج جوع عن طريق إضافة 1.5 مل من الماء و 0.25 مل من الهكسان.
  7. أنابيب خلاصة ويهز بقوة.
  8. أنابيب الطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي السريرية الطاولة لمدة 1 دقيقة في أقصى سرعة لفصل الهكسان من المذيبات المائية.
  9. نقل الهكسان (الطبقة العليا) إلى إدراج قارورة GC داخل قارورة GC، والحرص على عدم نقل أي من المرحلة المائية. لGC لnalysis، يتم حقن 1-2 ميكرولتر من جوع في الهكسان الصعود إلى القطبية الشعرية العمود اللوني للغاز مناسبة لتحليل جوع. يتم تعيين حاقن GC اجيلنت 7890 في 250 درجة مئوية، مع معدل تدفق 1.4 مل / دقيقة، ومبرمجة الفرن GC لدرجة الحرارة الأولية من 130 درجة مئوية، الذي يقام لمدة 1 دقيقة. في وقت لاحق، ورفعت درجة حرارة 10 ° C / دقيقة حتى 190 درجة مئوية، ثم رفعت مرة أخرى في 5 ° C / دقيقة حتى 210 درجة مئوية واحتجز لمدة 1 دقيقة اضافية.
  10. لضمان أن حدث امتصاص DGLA وتحليل جوع بواسطة اللهب كشف التأين (ااا) أو مطياف الكتلة (MS) كشف، وذلك باستخدام معايير أصيلة لتحديد C. ايليجانس الأحماض الدهنية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مكملات من C. ايليجانس نظام غذائي محدود بسبب قدرة المصدر الغذائي الجرثومي لامتصاص ودمج الأحماض الدهنية في غشاء البكتيريا. لتحديد قدرة E. القولونية OP50 لاستيعاب مختلف الأحماض الدهنية في الأغشية لها، ومطلي OP50 على وسائل الإعلام مع عدم وجود ملحق، 0.1 ملم و 0.3 ملم تركيزات من حمض دهني (18:00)، أوليئات الصوديوم (18:01 N-9)، والصوديوم DGLA (20 : 3N-6). تم تجفيفها لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 يوما في الظلام، وحضنت في 20 درجة مئوية لمدة 3 أيام. تم جمع المروج البكتيرية عن طريق كشط بلطف العشب في الماء مع ملعقة تعقيم اللهب. تم مكعبات البكتيريا عن طريق الطرد المركزي، وتعامل مع 2.5٪ H 2 SO 4 في الميثانول لإنتاج الأحماض الدهنية استرات الميثيل، والتي تم تحليلها بواسطة GC / MS التالية الأساليب المذكورة في الإجراءات، الخطوة 3. تثبت النتائج أن الأحماض الدهنية غير المشبعة (أوليئات وDGLA) تدرج في OP50 بكميات أعلى من ر انه المشبعة الأحماض الدهنية حمض دهني (الشكل 1A).

بالإضافة إلى ذلك، كانت تزرع L1 المرحلة N2 اليرقات على نفس دفعة من لوحات تستكمل وحصادها بعد نمو ثلاثة أيام في 20 درجة مئوية. تم غسلها الديدان الخروج من لوحات والأحماض الدهنية في مجموع محضرات دودة تم تحليلها بواسطة GC / MS. ورسوم بيانية التغير في الأحماض الدهنية تستكمل في الشكل 1B. وتبين هذه الدراسات أن مكملات الأحماض الدهنية المشبعة لا يغير الكمية النسبية من الأحماض الدهنية المشبعة في الأنسجة دودة، بينما مكملات الأحماض الدهنية غير المشبعة وزيادة المبالغ النسبية من الأحماض الدهنية غير المشبعة في C. الدهون ايليجانس. أخذت معا، فإن البيانات هو مبين في الشكل 1A و 1B الشكل تثبت أن تراكم النسبي من الأحماض الدهنية تستكمل في C. ايليجانس يرتبط بشكل مباشر مع تراكم النسبي من الأحماض الدهنية في النظام الغذائي E. القولونية.

e_content "> لقد أظهرنا سابقا أن يسبب العقم DGLA الغذائية في C. ايليجانس 10. الشكل 2 يوضح الاستجابة للجرعة من DGLA تحريض العقم في C. ايليجانس. تركيز DGLA في الدهون الدودة التي 50٪ من السكان سيكون العقيمة ما يقرب من 12٪. ومن المثير للاهتمام، واستجابة لDGLA يمكن تغييرها عن طريق الطفرات الوراثية في C. ايليجانس. والنتيجة الأخيرة هي أن النمو الأنسولين التي تعتمد على عامل مسارات الإجهاد يمكن قمع تدمير الخلايا الجرثومية التي يسببها DGLA 8. المكمل لنظام غذائي من الديدان التي تحتوي على الطفرات الضارة سواء في داف 2 الانسولين / IGF مستقبلات، داف 2 (e1370)، أو عامل النسخ daf-16/FOXO، داف 16 (mu86)، يوضح مدى فائدة هذه الطريقة لكشف المسارات الجينية التي تؤثر على الآثار الفسيولوجية للدهون الغذائية. تم pipetted المتزامنة L1 اليرقات على وسائط DGLA تستكمل بعد 3-4 أيام من النمو، وسجل الديدانللعقم، على النحو الذي يحدده غياب البيض في الرحم من الديدان البالغة. DGLA تستكمل DAF-2 كانت (e1370) المسوخ خصبة، مع قليل من دون فقدان الخلية الجرثومية التي يسببها مقارنة مع النوع البري (N2) الديدان في كل من 0.15 ملم و 0.3 ملم supplementations (الشكل 3). في المقابل، على أن تستكمل DGLA الديدان مع FOXO غير نشط (داف 16 (mu86)) عرض نسبة مئوية أعلى من الديدان المعقمة مقارنة نوع البرية عندما يتغذى على لوحات تحتوي على 0.15 ملي DGLA (الشكل 3).

الشكل 1
الشكل 1. امتصاص ودمج الأحماض الدهنية تكملها E. القولونية OP50 وC. ايليجانس. كانت تزرع A. كولاي OP50 على لوحات تحتوي على 0.1 ملي أو 0.3 ملي حمض دهني، أوليئات الصوديوم، أو DGLA الصوديوم وكذلك لوحات تستكمل الامم المتحدة. بعد FIVأيام (ه) من النمو على لوحات عند 20 درجة مئوية، E. تم حصادها القولونية وتم إنشاؤها استرات الميثيل الأحماض الدهنية لتحليلها من قبل GC / MS. لأن OP50 لا تنتج حمض الأوليك أو DGLA، وتنتج كميات ضئيلة فقط من حمض دهني، النسبة المئوية لكل الأحماض الدهنية تستكمل في E. الدهون القولونية يكشف عن قدرة OP50 لدمج الأحماض الدهنية تستكمل. أشرطة الخطأ هي SD. B. التغيير في C. ايليجانس الأحماض الدهنية في البالغين الشباب نمت لمدة ثلاثة أيام، بدءا في مرحلة L1، على E. القولونية لوحات تحتوي على 0.1 ملي أو 0.3 ملي حمض دهني، أوليئات الصوديوم، أو DGLA. تم الحصول على القيم من أجل التغيير في حامض دهني وDGLA عن طريق طرح المبلغ النسبي لل18:00 أو 20:03 في الديدان نمت على لوحات تستكمل من تلك الديدان نمت على لوحات unsupplmented. لرصد امتصاص حمض الأوليك، ومبلغ من حمض الأوليك بالإضافة إلى المصب C20 PUFAs (20:03، 20:04 ن 6، 20:04 ن 3، و20:05) حسبت في استكمال وunsupplemented جيش التحرير الشعبى الصينى قسم التدريب والامتحانات، وذلك لأن حامض الأوليك أدرجت أيضا مشبع وممدود. أشرطة الخطأ هي SD. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 2
الشكل 2. زيادة تركيزات DGLA في الدهون دودة ترتبط مع زيادة العقم في C. ايليجانس، وعولجوا نوع البرية (N2) الديدان مع تركيزات مختلفة من DGLA. يتم رسم DGLA٪ في إجمالي الدهون دودة و٪ من السكان وهذا هو معقمة ليتم رسم ل17 نقطة البيانات من خمس تجارب مستقلة التغذية باستخدام تركيزات DGLA الغذائية تتراوح 0-0،3 ملم DGLA. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

ether.within صفحة = "دائما"> الرقم 3
الرقم 3. الآثار الفسيولوجية للالمكمل C. ايليجانس مع DGLA. كانت مطلية جوعا L1 النوع البري اليرقات، داف 2 (e1370)، أو داف 16 (mu86) على أن تستكمل تستكمل الامم المتحدة، 0.15 ملم أو 0.3 ملم DGLA وسائل الإعلام، وتنمو إلى مرحلة الكبار. وبعد ذلك وسجل ما لا يقل عن 150 فرد الديدان للعقم. كانت داف 2 (e1370) المسوخ تقريبا خصبة تماما، حتى في 0.3 ملي DGLA، في حين عرض DAF-16 (mu86) المسوخ زيادة عدد الديدان عقيمة مقارنة مع النوع البري في 0.15 ملي DGLA. أشرطة الخطأ هي SEM. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن هنا تصف طريقة مكملات من C. ايليجانس مع الأحماض الدهنية غير المشبعة الغذائية. كما ذكر أعلاه، يجب توخي الحذر في إعداد لوحات بوفا تستكمل بسبب طبيعة رد الفعل من سندات مزدوجة في PUFAs يسبب هذه الأحماض الدهنية أن تكون حساسة للأكسدة من خلال الحرارة والضوء 11. لتجنب الأكسدة، فمن المهم لإضافة بوفا إلى المتوسطة أجار السائل بعد أن يبرد وسائل الإعلام إلى 55 درجة مئوية ومخازن لوحات في بيئة مظلمة.

أدخلت الآخرين الأحماض الدهنية الحرة إلى C. ايليجانس باستخدام DMSO الإيثانول أو الناقل، وإلا بإضافة مباشرة الأحماض الدهنية بواسطة microinjection في الفرج 12-14. وقد تحقق الإنقاذ الجزئي من الظواهر متحولة عن طريق مكملات الأحماض الدهنية من لوحات النمو من دون استخدام Tergitol (NP40) 14-15. هناك على ما يبدو مجموعة متنوعة من الطرق الفعالة لتقديم الأحماض الدهنية في C. ايليجانس، على الرغم من أنه هو ديfficult لمقارنة كفاءة أساليب مختلفة، لأنه في معظم التجارب، لم تتم مراقبة امتصاص الأحماض الدهنية في الديدان الخيطية. نجد أن لدينا وسيلة تسمح مكملات متسقة وفعالة من الأحماض الدهنية غير المشبعة إلى أحجام السكان من عدد قليل من الديدان الخيطية إلى عشرات الآلاف.

وقد وجدنا أنه من الضروري مراقبة امتصاص الأحماض الدهنية تستكمل في C. ايليجانس للمساعدة في تفسير النتائج التجريبية. على سبيل المثال، امتصاص الأحماض الدهنية من الغذاء البكتيريا يعتمد على E. سلالة بكتيريا تستخدم كمصدر للغذاء لالديدان الخيطية. لقد وجدنا أن OP50 يستغرق فترة تصل كميات أكبر من الأحماض الدهنية غير المشبعة من E. القولونية HT115 سلالات، HB101، أو NA22، والسلالات التي يشيع استخدامها لتغذية التجارب رني (HT115) أو استخدامها لكثافة عالية النمو الخيطية (HB101 وNA22). بسبب الاختلاف في امتصاص بعض الأحماض الدهنية، فمن المهم لاختبار عدة تركيزات الأحماض الدهنية ولرصد امتصاص باستخدام كروماتوغرافيا الغاز. حققت معظم مختبرات إنقاذ الظواهر متحولة باستخدام تركيزات الأحماض الدهنية في مجموعة من 0،08-،2 ملي 5،6،15-18، ومع ذلك، تم الإبلاغ عن الآثار على عمر مع مكملات حمض الأراكيدونيك بتركيز منخفضة مثل 0.01 ملم 14 ، والبعض الآخر قد استخدمت جرعات عالية مثل 0.6 ملم لإنقاذ النمط الظاهري الناجمة عن التغذية رني باستخدام HT115 E. كولاي سلالة 19. في أيدينا، مكملات من E. القولونية OP50 مع تركيزات عالية جدا من PUFAs، أكبر من 0.4 ملم، يؤدي الإفراط في تراكم الدهون في النظام الغذائي بوفا دودة، وتصل إلى 50٪ من مجموع الأحماض الدهنية. وهذا يؤدي إلى نمو غير محددة وتشوهات بطء الفرج.

وجود قيود على الأسلوب هو عدم القدرة على استكمال بكفاءة مع الأحماض الدهنية المشبعة. قضايا الذوبان في وقت بإضافة ملحق إلى وسائل الإعلام، فضلا عن عدم كفاءة امتصاص ودمج السبتالأحماض الدهنية urated في E. القولونية ترك هذه الطريقة أكثر ملاءمة لاستكمال الأحماض الدهنية غير المشبعة (الشكل 1).

يوفر طريقة لدينا مكملات استنساخه من الأحماض أحادية والدهنية غير المشبعة، بما في ذلك الأحماض الدهنية لا تنتج عادة من قبل C. ايليجانس، مثل حمض الدوكوساهيكسانويك (DHA، 22:06 ن 3). النمو والعيوب العصبية في المسوخ بوفا التي تعاني من نقص مثل الدهون-3 يمكن انقاذهم من قبل مستويات منخفضة نسبيا من 5 بوفا الغذائية. حمض الدهنية مكملات يمكن استخدامها من قبل الباحثين الذين يرغبون في تغيير تكوين الأحماض الدهنية من C. ايليجانس عن طريق الغذائية من أجل دراسة مجموعة من العمليات الفسيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

نشكر كريس بستر لأداء التجارب الأولية هو مبين في الشكل (3) من نتائج ممثل وجيسون كريس واتس ويبستر لتعليقات مفيدة على المخطوطة. تم توفير التمويل لهذه الدراسة عن طريق منحة من المعاهد الوطنية للصحة (الولايات المتحدة الأمريكية) (R01DK074114) لJLW. وقدمت بعض سلالات النيماتودا المستخدمة في هذا العمل من قبل مركز علم الوراثة انواع معينة، والذي يتم تمويله من قبل المعاهد الوطنية للصحة مكتب برامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto-Agar Difco 214010
Tryptone Difco 211705
NaCl J.T. Baker 3624-05
Tergitol Sigma NP40S-500mL
Cholesterol Sigma C8667-25G (5 mg/mL in ethanol)
MgSO4 J.T. Baker 2504-01
CaCl2 J.T. Baker 1311-01
K2HPO4 J.T. Baker 3254-05
KH2PO4 J.T. Baker 3246-05
Sodium dihomogamma linolenate NuCHEK S-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solution Ambion AM9932
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25 100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology 12481C100 1 M in water (for RNAi plates)
HSO4 J.T. Baker 9681-03
Methanol Fisher Scientific A452-4
Hexane Fisher Scientific H302-4
diamindinophenylindole (DAPI) Sigma D9542
VectaShield Vector Laboratories H-1000
Glass Flask Corning 4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbars Fisherbrand FB-800
Autoclaveable Glass Graduated Cylinder Fisherbrand 08-557
Stir Plate VWR 97042-642
Waterbath at 55+ °C Precision Scientific Inc. 66551
Screwcap Brown Glass Vial Sun SRI 200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aid Pipette-Aid P-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml) Corning 4489
Bunsen Burner VWR 89038-534
Dissection microscope Leica TLB3000
Silanized glass tube Thermo Scientific STT-13100-S for FAMEs derivitization
PTFE Screw caps Kimble-Chase 1493015D
Clinical tabletop centrifuge IEC
GC Crimp Vial SUN SRi 200 000
GC Vial Insert SUN SRi 200 232
GC Vial cap SUN SRi 200 100
Gas Chromatograph Agilent 7890A
Mass Spectrometry Detector Agilent 5975C
Column for gas chromatography Suppelco SP 2380 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
  2. de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids. BMC Med. 10, 50 (2012).
  3. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).
  4. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
  5. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants. Genetics. 163, 581-589 (2003).
  6. Kahn-Kirby, A. H., et al. Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo. Cell. 119, 889-900 (2004).
  7. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PLoS Genet. 2, e108 (2006).
  8. Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).
  9. Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line. Genetics. 145, 111-121 (1997).
  10. Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).
  11. Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 11, 370-379 (1976).
  12. Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26, 554-566 (2012).
  13. Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
  14. O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes Dev. 27, 429-440 (2013).
  15. Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans. Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).
  16. Lesa, G. M., et al. Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).
  17. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, 865-875 (2007).
  18. Goudeau, J., et al. Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans. PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).
  19. Yang, F., et al. An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis. Nature. 442, 700-704 (2006).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 81،
مكملات غذائية من الأحماض الدهنية غير المشبعة في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deline, M. L., Vrablik, T. L.,… More

Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (81), e50879, doi:10.3791/50879 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter