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Biology

में पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड की आहार अनुपूरण Published: November 29, 2013 doi: 10.3791/50879
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1School of Molecular Biosciences, Washington State University, 2Center for Reproductive Biology, Washington State University

Summary

<em> Caenorhabditis elegan </ em> विकास और शरीर विज्ञान में पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड के कार्यों का पता लगाने के लिए एक उपयोगी मॉडल है. इस प्रोटोकॉल <em> सी. सप्लीमेंट का एक कारगर विधि का वर्णन एलिगेंस </ em> पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड के साथ आहार.

Abstract

फैटी एसिड कई सेलुलर कार्यों के लिए आवश्यक हैं. वे झिल्ली के हाइड्रोफोबिक मूल श्रृंगार, और विभिन्न संकेत दे रास्ते में भाग लेने के रूप में कुशल ऊर्जा भंडारण अणुओं की सेवा. Caenorhabditis एलिगेंस ओमेगा -6 और ओमेगा -3 फैटी एसिड की एक श्रृंखला का उत्पादन करने के लिए आवश्यक एंजाइमों के सभी synthesizes. इस सरल, शरीर रचना और उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की श्रृंखला के साथ संयुक्त, यह फैटी एसिड समारोह का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल बनाते हैं. आहार फैटी एसिड का मनोवैज्ञानिक प्रभाव मध्यस्थता कि आनुवंशिक रास्ते की जांच करने के लिए, हम सी. पूरक करने के लिए एक विधि विकसित की है असंतृप्त वसीय अम्लों के साथ एलिगेंस आहार. पूरकता कीड़े के फैटी एसिड की संरचना में परिवर्तन करने के लिए एक प्रभावी का मतलब है और भी फैटी एसिड की कमी म्यूटेंट में दोष के बचाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे विधि फैटी acidsodium लवण के साथ पूरक निमेटोड मध्यम विकास अग्रवाल (एन जी एम) का उपयोग करता है. पूरक प्लेटों में फैटी एसिड incorpora बनटेड तो सी. द्वारा लिया जाता है, जो जीवाणु खाद्य स्रोत, की झिल्ली में पूरक बैक्टीरिया पर फ़ीड कि एलिगेंस. हम यह भी पूरक कीड़े में होते हैं कि फैटी एसिड की संरचना में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए एक गैस क्रोमैटोग्राफी प्रोटोकॉल का वर्णन. यह सी. के बड़े और छोटे दोनों आबादी का आहार पूरक करने के लिए एक कारगर तरीका है एलिगेंस, इस विधि के लिए आवेदनों की एक श्रृंखला के लिए अनुमति देता है.

Introduction

फैटी एसिड आवश्यक संरचनात्मक झिल्लियों के घटकों के साथ ही कुशल ऊर्जा भंडारण अणु होते हैं. इसके अतिरिक्त, फैटी एसिड lipases द्वारा सेलुलर झिल्ली से cleaved किया जा सकता है और enzymatically संकेत effectors 1 का उत्पादन करने के लिए संशोधित किया. स्वाभाविक रूप से होने वाली पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड (PUFAs) दो या अधिक सीआईएस डबल बांड होते हैं. ओमेगा -3 फैटी एसिड और ओमेगा -6 फैटी एसिड फैटी एसिड की मिथाइल अंत करने के लिए सम्मान के साथ डबल बांड की स्थिति के आधार पर एक दूसरे से प्रतिष्ठित हैं. स्वस्थ आहार ओमेगा -6 और ओमेगा -3 फैटी एसिड दोनों की आवश्यकता है. हालांकि, पश्चिमी आहार ओमेगा -6 फैटी एसिड और ओमेगा -3 फैटी एसिड में गरीब में विशेष रूप से समृद्ध हैं. एक उच्च ओमेगा -6 ओमेगा -3 फैटी एसिड अनुपात को हृदय और भड़काऊ रोगों का खतरा बढ़ा है, तथापि, विशिष्ट फैटी एसिड की सटीक लाभदायक और हानिकारक कार्यों में अच्छी तरह से 2 समझ नहीं रहे हैं के साथ जुड़ा हुआ है. roundworm Caenorhabditis elegaयह एक ओमेगा -3 desaturase, ज्यादातर जानवरों 3,4 में अनुपस्थित है कि एक गतिविधि सहित ओमेगा -6 और ओमेगा -3 फैटी एसिड की एक श्रृंखला का उत्पादन करने के लिए आवश्यक एंजाइमों के सभी synthesizes क्योंकि एनएस फैटी एसिड समारोह का अध्ययन करने में उपयोगी है. फैटी एसिड desaturase एंजाइमों की कमी म्यूटेंट विकास और मस्तिष्क संबंधी दोषों 4-6 की एक श्रृंखला के लिए अग्रणी विशिष्ट PUFAs उत्पादन करने में विफल.

आहार फैटी एसिड का मनोवैज्ञानिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हम सी में उत्परिवर्ती और आरएनएआई तोड़े नीचे तकनीकों का उपयोग कर दोनों आनुवांशिक विश्लेषण के साथ संगत एक जैव रासायनिक परख विकसित किया है एलिगेंस. विशिष्ट PUFAs के साथ पूरकता पूर्व डालने का कार्य करने के लिए अगर मध्यम करने के लिए एक फैटी एसिड सोडियम नमक समाधान जोड़कर हासिल की है. इस ई. द्वारा PUFA तेज में परिणाम यह जीवाणु झिल्ली में जम जाता है जहां कोली खाद्य स्रोत,. सी. एलिगेंस PUFA युक्त बैक्टीरिया निगलना, और इस आहार पूरकता defec बचाव करने के लिए पर्याप्त हैPUFA की कमी म्यूटेंट के टीएस. सबसे फैटी एसिड की पूरकता, तथापि, विशिष्ट ओमेगा -6 फैटी एसिड होता है, विशेष रूप से dihomo गामा लिनोलेनिक एसिड (DGLA, 20:03 N-6) सी. की एक स्थायी विनाश का कारण जंगली जानवरों पर कोई हानिकारक असर पड़ता है एलिगेंस जर्म कोशिकाओं 7,8.

गैस क्रोमैटोग्राफी जीवाणु खाद्य स्रोत (OP50 या HT115 या तो) के साथ ही नेमाटोड में पूरक फैटी एसिड की तेज नजर रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. मीडिया में डिटर्जेंट Tergitol (एनपी 40) के अलावा पूरी थाली और ई. से फैटी एसिड की अधिक कुशल तेज के माध्यम से फैटी एसिड का भी वितरण के लिए अनुमति देता है कोली और नेमाटोड. हम असंतृप्त वसा अम्ल आसानी से बैक्टीरिया और सी. द्वारा लिया जाता है कि मिल गया है एलिगेंस, लेकिन संतृप्त फैटी एसिड का तेज बहुत कम कुशल है. यह लेख फैटी एसिड के साथ अगर मीडिया के पूरक के लिए कैसे कदम दर कदम का वर्णन है, साथ वीं में फैटी एसिड तेज नजर रखने के लिए के रूप में कैसे होगागैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग ई निमेटोड.

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Protocol

पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड गर्मी, प्रकाश और ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील हैं. फैटी एसिड पूरकता प्लेटों की तैयारी करते हैं, इसलिए, ध्यान रखा जाना चाहिए फैटी एसिड अतिरिक्त गर्मी और प्रकाश के संपर्क में नहीं कर रहे हैं कि इस तरह के. 0.1% Tergitol (एनपी 40) युक्त एन जी एम मीडिया फैटी एसिड सोडियम लवण लगातार सरगर्मी के साथ जोड़ रहे हैं, जिसके बाद autoclaved और आंशिक रूप से ठंडा किया जाता है. प्लेटों अंधेरे में सूखे की अनुमति दी जाती है. सी. द्वारा फैटी एसिड की तेज फिर गैस क्रोमैटोग्राफी द्वारा नजर रखी जा सकती एलिगेंस इन प्लेटों पर सुसंस्कृत.

1. फैटी एसिड के पूरक मीडिया की तैयारी

  1. एक उचित आकार कुप्पी में मीडिया घटकों बाहर उपाय. 1 एल प्रति 17 ग्राम Bacto-अग्रवाल, 2.5 ग्राम tryptone, 3 जी NaCl, इथेनॉल में भंग 1 मिलीलीटर 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल, और पानी में भंग 10 मिलीलीटर 10% Tergitol जोड़ें.
  2. Millipore पानी की अंतिम यात्रा की मात्रा का 80% जोड़ें और अलग की संख्या के बराबर (खाली कांच की बोतलों के साथ साथ मीडिया आटोक्लेवफैटी एसिड परीक्षण किया जाना सांद्रता), साथ ही उचित सिलेंडर स्नातक किया.
  3. 55 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक पानी के स्नान में शांत मीडिया मीडिया, कांच की शीशी खुला तोड़ने सुरक्षा सावधानियों का उपयोग करने और कांच के कणों फैटी एसिड के साथ में मिश्रण नहीं है सुनिश्चित करने के द्वारा फैटी एसिड सोडियम नमक का काम कर रहे शेयर समाधान तैयार ठंडा रहा है. एक 100 मिमी काम कर स्टॉक बनाने के लिए पर्याप्त फैटी एसिड वजन.
  4. शुद्ध पानी के साथ 100 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए फैटी एसिड समाधान लाने. पूरी तरह से फैटी एसिड सोडियम नमक भंग आमतौर पर के बारे में 20-30 मिनट लगते हैं. एक आभ्यांतरिक गैस के साथ संपर्क ऑक्सीकरण से बचाता है, आर्गन या नाइट्रोजन के साथ फैटी एसिड का काम कर रहे शेयर पर्ज. शीशी टोपी और मीडिया ठंडा है जब तक अंधेरे में काम कर स्टॉक की दुकान.
  5. (वैकल्पिक) आरएनएआई मीडिया वांछित है, एम्पीसिलीन उपाय और यहाँ इसोप्रोपाइल β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) समाधान.
  6. अगर 55 डिग्री तक ठंडा है 1 एल प्रति जोड़ने C: 11 एम MgSO 4 मिलीलीटर, 1 एम 2 CaCl के 1 मिलीलीटर, और फॉस्फेट बफर के 25 एमएल (1 एल प्रति 108.3 ग्राम के.एच. 2 पीओ 4 और 35.6 ग्राम कश्मीर 2 4 HPO autoclaved). फिल्टर निष्फल एम्पीसिलीन और IPTG समाधान आरएनएआई प्लेट बनाने अगर जोड़ें. प्लेटों के सभी प्रकार के लिए, 1 एल को अंतिम मीडिया मात्रा लाने के लिए बाँझ पानी जोड़ें
  7. एक लौ के पास, एक autoclaved को मीडिया स्थानांतरण और उचित रूप से स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर के आकार और उसके बाद वांछित मात्रा के लिए गर्म बाँझ पानी जोड़ें. वापस प्रारंभिक कुप्पी मीडिया हस्तांतरण और सरगर्मी से मिश्रण.
  8. एक लौ के पास, एक autoclaved साथ मापने के द्वारा परीक्षण किया जाना सांद्रता की संख्या के बराबर की बोतलों की संख्या में मीडिया स्थानांतरण और उचित रूप से स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर आकार. फैटी एसिड काम कर स्टॉक पूरी तरह से भंग कर दिया है जब तक एक पानी के स्नान का उपयोग तरल रूप में aliquoted मीडिया बनाए रखें.
  9. मीडिया छूने के लिए गर्म है, लेकिन गर्म नहीं है जब तक हलचल प्लेट और हलचल पर एक बोतल रखें. पर्याप्त अपने आप को छोड़ने के लिए सुनिश्चित करेंफैटी एसिड शेयर समाधान में हलचल और मीडिया जमना शुरू होने से पहले प्लेटों डालना समय. हलचल प्लेट तापमान नियंत्रण नहीं है, तो 55 डिग्री सेल्सियस के लिए यह सेट
  10. वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए मीडिया में 100 मिमी फैटी एसिड काम कर रहे शेयर पतला. हलचल मीडिया सफेद वेग तक समाधान (लगभग 1 मिनट) में है. मीडिया अभी भी बाद में थोड़ा बादलमय हो सकता है.
  11. (वैकल्पिक) आरएनएआई मीडिया 2 मिमी अंतिम एकाग्रता मिलीलीटर और IPTG 0.1 मिलीग्राम / डालिए एम्पीसिलीन वांछित है.
  12. 8 60 मिमी प्लेट प्रति मीडिया की मिलीलीटर या 100 मिमी प्लेट प्रति मीडिया के 25 मिलीलीटर जोड़ने, एक स्वचालित पिपेट सहायता और एक बाँझ 25 एमएल पिपेट का उपयोग मीडिया डालो. शेष बोतलों के लिए कदम घनघोर फैटी एसिड के अलावा और थाली को दोहराएँ.
  13. अगर जम जाने के बाद, प्रकाश ऑक्सीकरण से बचाने के लिए एक अच्छी तरह से निकाल दराज में कमरे के तापमान पर एक बॉक्स या दुकान के साथ फैटी एसिड के पूरक प्लेटों को कवर किया.
  14. बीज ई. कोलाई OP50 प्लेटें सूख गए दो दिनों के बाद प्लेटों पर.60 मिमी प्लेटों के लिए, (37 डिग्री सेल्सियस से बढ़ी) एक रात OP50 संस्कृति की पिपेट 300 μl. आरएनएआई प्लेटें डाला गया तो प्लेटें चार दिनों के लिए सूखे के बाद, आरएनएआई बैक्टीरिया के 300 μl के साथ बीज. प्लेट समय सुखाने के कारण विभिन्न प्रयोगशाला वातावरण में आर्द्रता में अंतर करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.
  15. बैक्टीरियल लॉन सूख रहा है, जबकि कमरे के तापमान पर एक अंधेरे वातावरण में प्लेटें सेते हैं.

2. DGLA की पूरकता से रोगाणु सेल विनाश उत्प्रेरण

  1. सी. 0.3 मिमी DGLA (20:03 N-6) युक्त प्लेटों पर हो एलिगेंस के कारण दोनों ही मंच और वयस्क नेमाटोड में जर्म कोशिकाओं के विनाश के लिए बाँझ हो जाते हैं.
    1. क्षारीय hypochlorite समाधान के साथ गर्भवती hermaphrodites इलाज से एल 1 लार्वा की एक सिंक्रनाइज़ जनसंख्या तैयार (10 एमएल समाधान के लिए: 5M NaOH, घरेलू ब्लीच के 2.5 मिलीलीटर, और 7 एमएल एच 2 ओ के 0.5 मिलीलीटर). धीरे वयस्क कृमि जब तक इस समाधान में गर्भवती hermaphrodites रॉकएस भंग. अंडे संरक्षित किया जाएगा, और कम गति centrifugation द्वारा pelleted किया जा सकता है.
    2. (3 जी के.एच. 2 पीओ 4, 6 ग्राम HPO 4, 5 ग्राम NaCl, 1 एमएल 1 एम MgSO 4, एच 2 ओ एल autoclaving के बाद 4 MgSO जोड़ें 1 से 2 ना) M9 बफर में अंडा तैयारी 3 बार धोएं. पर्याप्त ऑक्सीजन प्रदान करते हैं, रात भर एक प्रकार के बरतन पर M9 बफर और चट्टान के 5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए एक 15 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब में अंडे resuspend.
    3. एल 1 लार्वा दो दिनों आरएनएआई बैक्टीरिया चढ़ाना के बाद OP50, या एक दिन के साथ बोने के बाद पूरक प्लेटों को जोड़ा जाना चाहिए. वे वयस्क अवस्था तक पहुंचने तक तीन दिन के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े सेते हैं या.
  2. वयस्क कीड़े गर्भाशय में भ्रूण के विकास की कल्पना करने के लिए पर्याप्त उच्च वृद्धि के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग बाँझपन के लिए रन बनाए जा सकते हैं. सफल रोगाणु सेल नुकसान अंडे की स्पष्ट गर्भाशय शून्य के रूप में दिखाई देगा.
  3. कीड़े भी फिक्सिंग और न्यूक्लिक एक साथ धुंधला हो जाना द्वारा बनाए जा सकते हैंजर्म कोशिकाओं में नाभिक के दृश्य और विकासशील भ्रूण की सुविधा जो सीआईडी ​​डाई diamindinophenylindole (DAPI),. एक तेजी से DAPI दाग एक watchglass 9 पर M9 बफर की एक बूंद में कीड़े उठा द्वारा हासिल की है.
    1. एक 0.2 एनजी / एम के 1 एमएल के साथ बाढ़ पहरा गिलास. DAPI 95% इथेनॉल के समाधान में, लगभग 5 मिनट के लिए बैठते हैं.
    2. एक स्लाइड पर Vectashield की एक बूंद में कीड़े उठाओ, और फिर एक coverslip के साथ कवर किया.
    3. इष्टतम धुंधला के लिए अंधेरे में रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर सील coverslip और दुकान, हालांकि स्लाइड्स भी तुरंत देखा जा सकता है. उपस्थिति या एक यूवी लैंप और फिल्टर से लैस एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग रोगाणु सेल नाभिक के अभाव के लिए स्कोर.

3. गैस क्रोमैटोग्राफी द्वारा फैटी एसिड तेज अनुरुप

सी. की समस्त फैटी एसिड संरचना एलिगेंस तो अलग और गैस CHR का उपयोग मात्रा रहे हैं जो फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (fames) उत्पादक द्वारा निर्धारित किया जा सकता हैomatography 4.

  1. पानी के साथ प्लेटों के बंद उन्हें धोने और एक silanized 13 मिमी x 100 मिमी कांच पेंच शीर्ष ट्यूब को स्थानांतरित करके 500-1,000 वयस्क कीड़े लीजिए.
  2. कीड़े गंभीरता से व्यवस्थित करते हैं, और फिर एक गिलास पाश्चर विंदुक के साथ जितना संभव हो उतना पानी निकाल दें.
  3. पानी के साथ एक बार कीड़े धो लें, और उसके बाद फिर से जितना संभव हो उतना पानी निकाल दें.
  4. Fames एक नहाने के पानी में 1 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर 1 2.5% एच 2 मिलीलीटर मेथनॉल में तो 4, और तब हीटिंग जोड़कर बनते हैं.
  5. पानी के स्नान से ट्यूबों निकालें और 1 मिनट के लिए शांत करते हैं.
  6. 1.5 मिलीलीटर पानी और हेक्सेन के 0.25 मिलीलीटर जोड़कर fames निकालें.
  7. हालात ट्यूब और सख्ती से हिला.
  8. जलीय विलायक से हेक्सेन अलग करने के लिए अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए एक tabletop नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र में अपकेंद्रित्र ट्यूबों.
  9. जलीय चरण के किसी भी हस्तांतरण करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, एक जीसी शीशी के भीतर एक जीसी शीशी डालने के लिए हेक्सेन (ऊपर परत) स्थानांतरण. जीसी A के लिएnalysis, हेक्सेन में fames 1-2 μl fames विश्लेषण के लिए उपयुक्त एक ध्रुवीय केशिका गैस क्रोमैटोग्राफी स्तंभ पर इंजेक्ट किया जाता है. Agilent 7890 जीसी लगानेवाला 1.4 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर के साथ 250 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया जाता है, और जीसी ओवन 1 मिनट के लिए आयोजित किया जाता है, जो 130 डिग्री सेल्सियस के एक प्रारंभिक तापमान, के लिए प्रोग्राम है. बाद में, तापमान 10 डिग्री सेल्सियस / मिनट तक 190 डिग्री सेल्सियस ramped है, और फिर 210 डिग्री सेल्सियस तक 5 डिग्री सेल्सियस / मिनट पर फिर से ramped और एक अतिरिक्त 1 मिनट के लिए आयोजित की.
  10. , DGLA की कि तेज हुई है सुनिश्चित सी. की पहचान के लिए प्रामाणिक मानकों का प्रयोग लौ ionization का पता लगाने (खूंटी) या मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) का पता लगाने, द्वारा fames का विश्लेषण करने के लिए फैटी एसिड एलिगेंस.

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Representative Results

सी. की पूरकता एलिगेंस आहार बैक्टीरियल झिल्ली में फैटी एसिड तेज और शामिल करने के लिए जीवाणु खाद्य स्रोत की क्षमता द्वारा सीमित है. ई. की क्षमता निर्धारित करने के लिए इसकी झिल्ली में विभिन्न फैटी एसिड आत्मसात करने कोलाई OP50, OP50 कोई पूरक, 0.1 मिमी और stearic एसिड (18:00), सोडियम oleate (18:01 N-9), और सोडियम DGLA (20 की 0.3 मिमी सांद्रता के साथ मीडिया पर चढ़ाया गया था : 3n-6). प्लेट्स अंधेरे में 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर सूखे, और 3 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे. बैक्टीरियल लॉन धीरे एक लौ निष्फल रंग के साथ पानी में लॉन scraping द्वारा एकत्र किए गए थे. बैक्टीरिया centrifugation द्वारा pelleted, और 2.5% एच 2 के साथ इलाज किया गया इसलिए प्रक्रिया में सूचीबद्ध विधियों, चरण 3 निम्नलिखित जीसी / एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया है, जो फैटी एसिड मिथाइल एस्टर, निर्माण करने के लिए मेथनॉल में 4. परिणाम असंतृप्त वसीय अम्लों (oleate और DGLA) टी से अधिक मात्रा में OP50 में शामिल दिखाना है कि वह फैटी एसिड Stearic एसिड (चित्रा 1 ए) संतृप्त.

साथ ही, एल 1 चरण 2 एन लार्वा 20 डिग्री सेल्सियस पर पूरक प्लेटों के एक ही बैच पर वृद्धि हुई है और तीन दिनों के विकास के बाद काटा गया कीड़े जीसी / एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया कुल कीड़ा preps में प्लेटें और फैटी एसिड का धुल गया. पूरक फैटी एसिड में परिवर्तन चित्रा 1 बी में रेखांकन है. असंतृप्त वसीय अम्लों की पूरकता सी. में असंतृप्त वसीय अम्लों के रिश्तेदार मात्रा में वृद्धि हुई है, जबकि इन अध्ययनों, संतृप्त फैटी एसिड की पूरकता कीड़ा ऊतकों में संतृप्त फैटी एसिड के रिश्तेदार राशि परिवर्तन नहीं करता है कि दिखाना एलिगेंस लिपिड. साथ में ले ली, चित्रा 1 ए और चित्रा 1 बी में दिखाया गया डेटा दिखाना है कि सी में पूरक फैटी एसिड के सापेक्ष संचय एलिगेंस आहार ई. में फैटी एसिड के सापेक्ष संचय के साथ सीधे संबद्ध है कोलाई.

e_content "> हम पहले आहार DGLA सी. में बाँझपन 10 एलिगेंस का कारण बनता है कि पता चला है. 2 सी. एलिगेंस में बाँझपन का DGLA प्रेरण की खुराक प्रतिक्रिया दिखाता है चित्रा. जनसंख्या का 50% होगा जिसमें कीड़ा लिपिड में DGLA की एकाग्रता बाँझ लगभग 12% है. दिलचस्प है, DGLA के जवाब एलिगेंस में आनुवंशिक परिवर्तन से बदला जा सकता है. एक ताजा खोज इंसुलिन वृद्धि कारक पर निर्भर तनाव रास्ते DGLA प्रेरित रोगाणु सेल विनाश 8 को दबा सकते हैं. आहार का सप्लीमेंट या तो DAF-2 इंसुलिन / IGF रिसेप्टर, DAF-2 (e1370), या daf-16/FOXO प्रतिलेखन कारक, DAF-16 (mu86), आनुवंशिक रास्ते को जानने के लिए इस पद्धति की उपयोगिता दिखाता में हानिकारक म्यूटेशन युक्त कीड़े की उस प्रभाव आहार वसा का मनोवैज्ञानिक प्रभाव. सिंक्रनाइज़ एल 1 लार्वा विकास के 3-4 दिनों के बाद. DGLA पूरक मीडिया पर pipetted गया, कीड़े रन बनाए थेबाँझपन के लिए, वयस्क कीड़े के गर्भाशय में अंडे की अनुपस्थिति से निर्धारित होता है. DGLA (e1370) म्यूटेंट 0.15 मिमी और 0.3 मिमी supplementations (चित्रा 3) दोनों में जंगली प्रकार (एन 2) कीड़े की तुलना में कोई प्रेरित रोगाणु सेल घटाने के लिए थोड़ा के साथ, उपजाऊ थे DAF-2 पूरक. इसके विपरीत, DGLA निष्क्रिय FOXO साथ कीड़े पूरक (DAF-16 (mu86)) 0.15 मिमी DGLA (चित्रा 3) युक्त प्लेटों पर खिलाया जब जंगली प्रकार की तुलना में बाँझ कीड़े की एक उच्च प्रतिशत प्रदर्शन किया.

चित्रा 1
चित्रा 1. तेज और ई. के पूरक फैटी एसिड का समावेश कोलाई OP50 और सी. एलिगेंस. ए ई. कोलाई OP50 0.1 मिमी युक्त प्लेटों या 0.3 मिमी stearic एसिड, सोडियम oleate, या सोडियम DGLA के साथ ही संयुक्त राष्ट्र के पूरक प्लेटों पर हो गया था. FIV के बाद20 डिग्री सेल्सियस, ई. पर प्लेटों पर विकास की ई दिन जीसी / एमएस द्वारा विश्लेषण के लिए कोलाई काटा गया और फैटी एसिड मिथाइल एस्टर उत्पन्न किया गया. OP50 ओलिक एसिड या DGLA उत्पादन, और stearic एसिड की ही मात्रा का पता लगाने, ई. में प्रत्येक पूरक फैटी एसिड का प्रतिशत का उत्पादन नहीं करता है कोली लिपिड पूरक फैटी एसिड शामिल करने की OP50 की क्षमता का पता चलता है. त्रुटि सलाखों एसडी. बी हैं. सी. में बदलें ई. पर, एल 1 स्तर पर शुरू होने वाले तीन दिनों के लिए उगाया युवा वयस्कों में फैटी एसिड एलिगेंस 0.1 मिमी या 0.3 मिमी stearic एसिड, सोडियम oleate, या DGLA युक्त कोलाई प्लेटें. Stearic एसिड और DGLA में बदलाव के लिए मूल्यों unsupplmented प्लेटों पर बड़े कीड़े के उन लोगों से पूरक प्लेटों पर बड़े कीड़े में 18:00 या 20:03 के रिश्तेदार राशि घटाकर प्राप्त किया गया. ओलिक एसिड की तेज, ओलिक एसिड प्लस डाउनस्ट्रीम C20 PUFAs की राशि पर नजर रखने के लिए (20:03, 20:04 N-6, 20:04 N-3, और 20:05) पूरक और unsupplemented पीएलए में गणना की गई हैTEs, शामिल ओलिक एसिड आगे desaturated और लम्बी है. त्रुटि सलाखों एसडी हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. कीड़ा लिपिड में DGLA की बढ़ती सांद्रता सी. में बढ़ती बाँझपन के साथ सहसंबंधी एलिगेंस. जंगली प्रकार (एन 2) कीड़े DGLA के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया गया. कुल कीड़ा लिपिड में% DGLA और बाँझ है कि जनसंख्या का% 0-0.3 मिमी DGLA से लेकर आहार DGLA सांद्रता का उपयोग कर पांच स्वतंत्र खिला प्रयोगों से 17 डेटा बिंदुओं के लिए साजिश रची है के लिए साजिश रची है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 3. सी. सप्लीमेंट के मनोवैज्ञानिक प्रभाव DGLA साथ एलिगेंस. भूखे एल 1 लार्वा जंगली प्रकार, DAF-2 (e1370), या DAF-16 (mu86) संयुक्त राष्ट्र के पूरक, 0.15 मिमी या 0.3 मिमी DGLA मीडिया पूरक और वयस्क अवस्था हो गई पर चढ़ाया गया. कम से कम 150 व्यक्ति कीड़े तो बाँझपन के लिए रन बनाए थे. DAF-16 (mu86) म्यूटेंट 0.15 मिमी DGLA में जंगली प्रकार की तुलना में बाँझ कीड़े की बढ़ती संख्या को प्रदर्शित करते हुए DAF-2 (e1370) म्यूटेंट, यहां तक 0.3 मिमी DGLA में, लगभग पूरी तरह से उपजाऊ थे. त्रुटि सलाखों SEM हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

यहाँ हम सी. की पूरकता की एक विधि का वर्णन आहार असंतृप्त वसीय अम्लों के साथ एलिगेंस. जैसा कि ऊपर कहा PUFAs में डबल बांड की प्रतिक्रियाशील प्रकृति इन फैटी एसिड गर्मी और प्रकाश के माध्यम से 11 ऑक्सीकरण के प्रति संवेदनशील होने का कारण बनता है, क्योंकि देखभाल PUFA पूरक प्लेटों की तैयारी में लिया जाना चाहिए. ऑक्सीकरण से बचने के लिए, यह मीडिया के एक अंधेरे वातावरण में 55 डिग्री सेल्सियस और दुकानों प्लेटों को ठंडा होने के बाद तरल अगर मध्यम करने PUFA जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है.

दूसरों सी. मुक्त फैटी एसिड पेश किया एलिगेंस एक DMSO या इथेनॉल वाहक का उपयोग कर, या फिर सीधे योनी 12-14 में microinjection द्वारा फैटी एसिड जोड़कर. उत्परिवर्ती phenotypes की आंशिक बचाव Tergitol (NP40) 14-15 के उपयोग के बिना विकास प्लेटों के फैटी एसिड पूरकता द्वारा प्राप्त किया गया था. सी. में फैटी एसिड लागू करने के लिए प्रभावी तरीकों की एक किस्म जाहिरा तौर पर कर रहे हैं यह di है एलिगेंस, हालांकिसबसे प्रयोगों में, नेमाटोड में फैटी एसिड की तेज निगरानी नहीं किया गया था, क्योंकि विभिन्न तरीकों की दक्षता की तुलना करने fficult. हम हमारे विधि हजारों के लिए कुछ नेमाटोड की आबादी के आकार को असंतृप्त वसीय अम्ल की संगत और कुशल पूरकता की अनुमति देता है कि लगता है.

हम यह आवश्यक सी. में पूरक फैटी एसिड की तेज नजर रखने के लिए मिल गया है प्रयोगात्मक परिणामों की व्याख्या करने में सहायता करने के लिए एलिगेंस. उदाहरण के लिए, बैक्टीरिया भोजन से फैटी एसिड की तेज ई. पर निर्भर करता है कोलाई तनाव नेमाटोड के लिए एक खाद्य स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया. हम OP50 ई. से असंतृप्त वसीय अम्लों का अधिक से अधिक मात्रा में लेता है कि मिल गया है कोलाई HT115, HB101, या NA22 उपभेदों, सामान्यतः आरएनएआई प्रयोगों (HT115) खिला या उच्च घनत्व निमेटोड विकास (HB101 और NA22) के लिए इस्तेमाल के लिए इस्तेमाल किया उपभेदों. क्योंकि कुछ फैटी एसिड के तेज में भिन्नता के कारण, यह फैटी एसिड के कई सांद्रता का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है औरगैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर तेज नजर रखने के लिए. अधिकांश प्रयोगशालाओं 0.08-0.2 मिमी 5,6,15-18 की रेंज में फैटी एसिड सांद्रता का उपयोग उत्परिवर्ती phenotypes का बचाव हासिल किया है, हालांकि, जीवन पर प्रभाव 0.01 मिमी 14 जितनी कम एकाग्रता में arachidonic एसिड की पूरकता के साथ सूचित किया गया है , और दूसरों HT115 ई. का उपयोग आरएनएआई खिलाने से प्रेरित एक phenotype के बचाव के लिए 0.6 मिमी के रूप में उच्च खुराक का इस्तेमाल किया है कोली 19 तनाव. ई. के हमारे हाथ, पूरकता में PUFAs की बहुत उच्च सांद्रता, अधिक से अधिक 0.4 मिमी के साथ कोलाई OP50, कीड़ा लिपिड में अत्यधिक आहार PUFA संचय में कुल फैटी एसिड के ऊपर से 50% परिणाम. इस योनी की धीमी गति से विकास और असामान्यताएं nonspecific की ओर जाता है.

तकनीक की एक सीमा कुशलता से संतृप्त फैटी एसिड के साथ पूरक की अक्षमता है. मीडिया के लिए पूरक जोड़ने के साथ ही अक्षम तेज और शनि के एकीकरण के समय में घुलनशीलता मुद्दोंई. में urated फैटी एसिड कोली असंतृप्त वसीय अम्लों (चित्रा 1) सप्लीमेंट के लिए अधिक उपयुक्त इस विधि को छोड़ दें.

हमारे विधि सामान्य रूप से सी. द्वारा उत्पादित नहीं फैटी एसिड सहित, मोनो और पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पूरकता प्रदान करता है ऐसे docosahexaenoic एसिड (डीएचए, 22:06 N-3) के रूप में एलिगेंस,. इस तरह के वसा के रूप में 3 PUFA की कमी म्यूटेंट में वृद्धि और मस्तिष्क संबंधी दोषों आहार PUFA 5 की अपेक्षाकृत निम्न स्तर से बचाया जा सकता है. फैटी एसिड पूरकता सी. के फैटी एसिड की संरचना में परिवर्तन करने की इच्छा रखने वाले शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है शारीरिक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला का अध्ययन करने के क्रम में आहार भी तरह से एलिगेंस.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के लिए प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 और जेसन वत्स और क्रिस वेबस्टर में दिखाया प्रारंभिक प्रयोगों प्रदर्शन के लिए क्रिस वेबस्टर धन्यवाद. इस अध्ययन के लिए अनुदान JLW के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (यूएसए) (R01DK074114) से अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी. इस काम में इस्तेमाल कुछ निमेटोड उपभेदों रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर कार्यक्रम के एनआईएच कार्यालय (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित है जो Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर, द्वारा प्रदान किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto-Agar Difco 214010
Tryptone Difco 211705
NaCl J.T. Baker 3624-05
Tergitol Sigma NP40S-500mL
Cholesterol Sigma C8667-25G (5 mg/mL in ethanol)
MgSO4 J.T. Baker 2504-01
CaCl2 J.T. Baker 1311-01
K2HPO4 J.T. Baker 3254-05
KH2PO4 J.T. Baker 3246-05
Sodium dihomogamma linolenate NuCHEK S-1143
Warm sterile Millipore water
Sterile water for collecting worms
Nuclease-free Water for DGLA stock solution Ambion AM9932
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25 100 mg/ml in water (for RNAi plates)
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology 12481C100 1 M in water (for RNAi plates)
HSO4 J.T. Baker 9681-03
Methanol Fisher Scientific A452-4
Hexane Fisher Scientific H302-4
diamindinophenylindole (DAPI) Sigma D9542
VectaShield Vector Laboratories H-1000
Glass Flask Corning 4980-2L
Autoclaveable Glass bottles with stirbars Fisherbrand FB-800
Autoclaveable Glass Graduated Cylinder Fisherbrand 08-557
Stir Plate VWR 97042-642
Waterbath at 55+ °C Precision Scientific Inc. 66551
Screwcap Brown Glass Vial Sun SRI 200 494
Argon gas tank
Automated Pipette aid Pipette-Aid P-90297
Sterile Serological Pipettes (25 ml) Corning 4489
Bunsen Burner VWR 89038-534
Dissection microscope Leica TLB3000
Silanized glass tube Thermo Scientific STT-13100-S for FAMEs derivitization
PTFE Screw caps Kimble-Chase 1493015D
Clinical tabletop centrifuge IEC
GC Crimp Vial SUN SRi 200 000
GC Vial Insert SUN SRi 200 232
GC Vial cap SUN SRi 200 100
Gas Chromatograph Agilent 7890A
Mass Spectrometry Detector Agilent 5975C
Column for gas chromatography Suppelco SP 2380 30 m x 0.25 mm fused silica capillary column

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 81, एलिगेंस पोषण चिकित्सा जेनेटिक्स (पौधे और पशु) पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड ओमेगा -6 ओमेगा -3 आहार वसा dihomo-गामा लिनोलेनिक एसिड जर्म कोशिकाओं
में पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड की आहार अनुपूरण<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em
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Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (81), e50879, doi:10.3791/50879 (2013).

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