Summary
Celletransplantation repræsenterer en strategi for behandling af nethinde degeneration karakteriseret ved fotoreceptor tab. Her beskriver vi en metode til berigelse af transplantable fotoreceptorer og deres subretinale podning i voksne mus.
Abstract
Synsnedsættelse og blindhed som følge af tabet af nethindens lysfølsomhedsceller, dvs. Udskiftning af degenererede fotoreceptorer med celletransplantation udgør en mulig behandlingsmulighed i fremtidige kliniske anvendelser. Faktisk viste nylige prækliniske undersøgelser, at umodne fotoreceptorer, isoleret fra neonatal musehinden på postnatal dag 4, har potentiale til at integrere sig i den voksne musehinden efter subretinal transplantation. Donorceller genererede en moden fotoreceptormorfologi, herunder indre og ydre segmenter, et rundt cellelegeme placeret ved det ydre atomlag og synaptiske terminaler i nærheden af endogene bipolære celler. Faktisk viste nylige rapporter, at donorfotoreceptorer funktionelt integreres i værtsmusens neurale kredsløb. For en fremtidig klinisk anvendelse af en sådan celle udskiftning tilgang, rensede suspensioner af de foretrukne celler skal genereres og placeres på den korrekte position for korrekt integration i øjet. Til berigelse af fotoreceptorprækursorer bør sorteringen baseres på specifikke celleoverfladeantigener for at undgå genetisk reportermodifikation af donorceller. Her viser vi magnetisk-associeret cellesortering (MACS) - berigelse af transplanterbare stang fotoreceptor prækursorer isoleret fra neonatal nethinden af photoreceptor-specifikke reporter mus baseret på cellen overflade markør CD73. Inkubation med anti-CD73 antistoffer efterfulgt af mikroperlekonjugerede sekundære antistoffer gjorde det muligt at berige MACS med stangfotoreceptorprækursorer til ca. 90%. I sammenligning med flowcytometry har MACS den fordel, at det lettere kan anvendes på GMP-standarder, og at store mængder celler kan sorteres i relativt korte tidsperioder. Injektion af berigede celleaffjedring i det subretinaale rum af voksne mus af vildtype resulterede i en 3 gange højere integrationshastighed sammenlignet med usorterede celleaffjedring.
Introduction
Vision er en af de vigtigste sanser af mennesker. Forringelse af denne følelse og blindhed er en af hovedårsagerne til handicap i de industrialiserede lande. Den fremherskende årsag til synsnedsættelse eller blindhed er nethindedegeneration, karakteriseret ved fotoreceptorcelletab, da det kan observeres i makuladegeneration, retinitis pigmentosa, kegle-stang dystrofi og andre forhold. Til dato er en effektiv terapi for at genoprette tabt syn ikke tilgængelig. I 2006 og 2008 to forskellige laboratorier rapporterede, uafhængig af hinanden, en vellykket transplantation af stang photoreceptor prækursor celler i voksne vilde-type mus nethinder1,2. Således opstår muligheden for photoreceptor prækursor celletransplantation også i en degenereret nethinden, at erstatte degenererede fotoreceptorer og genoprette vision. Faktisk er det blevet påvist for nylig, at sådanne transplanterede fotoreceptorprækursorceller fremkalder morfologiske kriterier for modne fotoreceptorer af vild type, såsom korrekt udviklede ydre segmenter3, synaptiske terminaler i nærheden af endogene bipolære celler og en rund cellekrop placeret i det ydre nukleare lag2-4, samt evnen til at integrere funktionelt i værts neurale kredsløb5-7. Et af hovedprincipperne i denne strategi er brugen af postnatal dag 4 (PN 4, PN0 defineres som fødselsdag) unge mus nethinder, hvilket resulterer i en blanding af forskellige celletyper til transplantation. På baggrund af en fremtidig terapeutisk anvendelse skal denne blanding renses for fotoreceptorprækursorceller. CD73 er blevet beskrevet som den første celleoverflademarkør, der er specifik for unge fotoreceptorer i nethinden8-10. Her demonstrerer vi en fotoreceptor prækursor cellerensning metode baseret på denne celle overflade markør og med brug af den magnetisk-associerede celle sortering (MACS) teknik. MACS kan have fordele i forhold til fluorescerende-aktiverede cellesorteringsteknikker på grund af hurtige sorteringstider og den lettere justering af GMP-betingelser. Vi kunne demonstrere en ~ 90% berigelse og en op til 3 gange højere integrationshastighed ved transplantation af den berigede befolkning til det subretinale rum i voksne vilde nethinder. Macs-baseret fotoreceptor prækursorcelleberigelse og subretinale transplantationer er således pålidelige og lovende teknikker til udvikling af en regenerativ terapeutisk strategi til behandling af nethindedegeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Erklæring om etisk anvendelse og pasning af dyr:
Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med EU-lovgivningen og den tyske lovgivning (Tierschutzgesetz) og overholdt ARVO's erklæring om anvendelse af dyr i oftalmisk og visionsforskning. Alle dyreforsøg blev godkendt af tu Dresdens etiske komité og Landesdirektion Dresden (godkendelsesnummer: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Før afkobling af celler startes og cellesortering
- Mærke tre 15 ml reaktionsrør med: Vask (W), Positiv fraktion (+) og Negativ fraktion (-).
2. Retina Dissociation
- Halshugge PN 4 hvalpe ved hjælp af en saks.
- Skyl hovedet af hvalpene kort i 70% ethanol efterfulgt af vask i PBS.
- Overfør hovedet til kold HBSS ogucleate øjet (gentag dette trin for alle hoveder). For at belyse, åbne øjenlågene og fiksere øjet med buede pincet i synsnerven regionen. Træk derefter øjet forsigtigt ud af kredsløbet.
- Efter at have belyst alle øjnene isoleres nethinden: indfør en lukket saks i synsnerven og åbn knivene. Peal RPE / chorid ud. Fjern linser og blodkar ved hjælp af buede pincet.
- De isolerede nethinder overføres til et 1,5 ml reaktionsrør, der indeholder papainopløsningen (leveret af papain-dissociationssættet).
- Nethinden i papainopløsningen inkuberes i 30-60 minutter i et vandbad eller en ryster (400 omdrejninger) ved 37 °C.
- Mens nethinder inkuberes i papainopløsningen, pipetteres 1 ml ægforslæbende opløsning på et 15 ml reaktionsrør (etiket "1").
- Der tilsættes 60 μl DNase I (10 mg/ml) + 60 μl ægforsucoidopløsning (leveret af sættet) + 520 μl EBSS til et 15 ml reaktionsrør (etiket "2").
- Efter papain inkubation overføres papainopløsningen, der indeholder de delvist fordøjede nethinder, til reaktionsrøret "2".
- Ved hjælp af en brandpoleret pipette skal du udføre mekanisk dissociation (10x op og ned).
- Pipetter enkeltcelleaffjedringen til reaktionsrøret "1". Prøv at generere 2 lag ved forsigtigt at lægge celleophænget oven på ovomucoidopløsningen.
- Centrifuge i 5 min ved 300 x g (ca. 1.300 omdrejninger i minuttet).
- Supernatanten kasseres og cellerne genbruges i 500 μl MACS-buffer.
3. Cellesortering ved hjælp af magnetisk tilknyttet cellesortering (MACS)
- X μl rotteanti-CD73-antistof til 500 μl for at opnå en endelig koncentration på 10 μg/ml.
- Inkuber 5 min på is.
- 15 ml reaktionsrøret fyldes til 10 ml med MACS-buffer og centrifuges i 5 minutter med en hastighed på 300 x g.
- Fjern supernatanten.
- Pelletpen blev genbrugt i 480 μl MACS-buffer og tilsættes 120 μl gedantirotter af IgG-mikroperler.
- Inkuber 15 min på is; Må ikke omrøres, rystes eller blandes.
- Fylder 15 ml reaktionsrøret til 5 ml med MACS-buffer og centrifuge det i 5 minutter ved 300 x g.
- Da reaktionsrøret er centrifuged:
- Juster en LS-kolonne i det magnetiske stativ.
- Sæt forparationsfilteret oven på LS-kolonnen.
- Hydrat preseparationsfilteret og LS-kolonnen med 3 ml MACS-buffer, og opsaml MACS-bufferen i vaskerøret (W).
- Fjern supernatanten.
- Opsnå pellet i 500 μl MACS buffer.
- 500 μl celleaffjedringen til filteret indlæses, derefter tilsættes 1 ml MACS-buffer til filteret, og den negative fraktion opsamles i det negative fraktions(-) reaktionsrør.
- Derefter tilsættes 3 x 3 ml MACS-buffer til kolonnen for at vaske de celler af, der ikke er bundet til kolonnen
- Når disse 9 ml er gennem LS-kolonnen, skal du fjerne kolonnen fra magnetstativet og installere den oven på det positive fraktions(+) reaktionsrør.
- Indlæs hurtigt 5 ml MACS-buffer i LS-kolonnen, og læg stemplet i LS-kolonnen, og tryk det ned, indtil hele bufferen er gennem kolonnen.
- Centrifuge reaktionsrøret, der indeholder den positive fraktion i 5 minutter ved 300 x g.
- Supernatanten fjernes, opsuspendes i 500 μl MACS-buffer og ved 4 °C opbevares.
- Tæl den samlede mængde celler ved hjælp af en fælles celleoptællingsenhed.
- Forbered en celleaffjedring fra den positive sorterede brøk, der indeholder 2 x10 5 celler/μl i MACS-buffer, og hold den ved 4 °C
4. Transplantation af MAC-sorterede fotoreceptorprækursorerceller i musehinden
- Sørg for at have alle følgende opløsninger klar: 1 ml steril PBS eller HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 ml steril deioniseret H2O, aliquots af cellesuspensionsfraktionerne ved 4 °C.
- Bedøve den voksne mus(dvs. 2-4 måneder gammel) med en intraperitoneal injektion af medetomidinhydrochlorid (0,01 mg/10 g kropsvægt), ketamin (0,75 mg/10 g kropsvægt). Derefter gøre en subkutan injektion af Buprenorphin (0,05 mg/ kg kropsvægt) for smertelindring.
- Dilate elever med et fald på Phenylephrin 2,5%-Tropicamid 0,5%.
- Fastgør musen i musehovedholderen, og placer den under stereomikroskop.
- Påfør en dråbe Visidic gel for at forhindre tørring af øjet.
- Lav et lille hul ved grænsen mellem sclera og hornhinden (henholdsvis ora serrata)ved hjælp af en steril 30 G 1/2 i nål.
- Skær en fælles dækning glide ind i små (ca. 5 mm x 5 mm) stykker ved hjælp af en diamant pen, placere en af disse stykker på toppen af hornhinden, så direkte visualisering af nethinden.
- Skyl den forelagte mikroliter sprøjte flere gange med deioniseret vand.
- Mikrolitersprøjten fyldes med 1 μl celleaffjedring, der tanger demer tangentielt gennem bindehinden og scleraen, og placeres under visuel kontrol i nethindens næsehalvdel.
- Punch forsigtigt et hul i nethinden, indtil de når det subretinale rum, injicere celle suspension i subretinal rummet.
- Overhold den bulløse løsrivelse af nethinden, som skal være ensartet, der dækker ca. 1/4 af nethinderummet uden blødning.
- Træk sprøjten forsigtigt tilbage, retinale hul forsegler automatisk.
- Skyl mikroliter sprøjten flere gange med deioniseret vand.
- Slip musen fra hovedholderen.
- Vågn op mus ved at injicere atipamozol hydrochlorid til vending af medetomidin hydrochlorid effekt.
- Placer musen til vågnetid i varmt mørkt kammer (ca. 25 °C).
- De næste 2 dage efter transplantationen skal Buprenorphin (0,05 mg/kg legemsvægt) gives ved subkutan injektion om morgenen og om eftermiddagen for smertelindring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at vurdere stang fotoreceptorers evne til at integrere sig i musehinden blev der brugt en musereporterlinje, hvor GFP drives af den neurale nethinde leucine lynlås (Nrl, Nrl-GFP) promotor11. Nrl er den tidligste markør for stang fotoreceptorer starter sit udtryk på E12.5 hele voksenalderen, så en specifik mærkning af donor stang fotoreceptor celler.
PN 4 Nrl-GFP hvalpe blev halshugget og øjnene blev belyst. Nethinder blev derefter isoleret og adskilt ved hjælp af den ovenfor beskrevne metode. Den resulterende celleophæng blev derefter sorteret ved hjælp af CD73-baserede MACS (Figur 1 og 2). Efter MAC-sortering analyserede vi den berigelse, der blev opnået under denne procedure.
Som vist i figur 3Aindeholdt den oprindelige celleophængning (Input) 30,4 % GFP-positive celler, dvs. stang fotoreceptorer. Efter CD73-baseret MAC-sortering blev en berigelse på op til 86,9% i cd73-positiv fraktion (CD73+) observeret af flowcytometry. I den CD73-negative fraktion (CD73-) blev kun 9,9% af alle celler positivt påvist for GFP (Figur 3A). Berigelsen af nrl-GFP-positive celler efter CD73-baserede MACS visualiseres desuden efter plating in vitro (Figur 3B).
Efter MAC-sortering blev donorcellerne i cd73-positiv fraktion spundet ned og genbrugt til en endelig koncentration på 200.000 celler/μl. Denne celleaffjedring blev yderligere anvendt til transplantation i det subretinale rum af værtsnetinder af vild type (Figur 4). Tre til fire uger efter transplantationen blev værtshinden rettet, isoleret og sektionsopdelt. Flere donorceller integreret i værternes ydre nukleare lag og erhvervede morfologien hos modne fotoreceptorer med lokalisering af cellekroppen i det ydre nukleare lag og dannelse af synaptiske sfæriske og indre segmenter (Figur 5). Detaljerede billeder er blevet offentliggjort før af vores gruppe3,8, der viser et resultat, der kan sammenlignes med FAC-sorterede celler transplanteret for at være vært for nethinden af andre grupper4,6,10. Konsekvent i alle disse undersøgelser er, at de transplanterede celler ophold på injektionsstedet, defineret af bullous løsrevet vært nethinden, og ikke migrere væk. Nogle integreres i værtshinden(dvs. det ydre atomlag), og nogle forbliver i det subretinale rum3. Derudover har det vist sig, at fordelingen af donorceller på integrationsstedet afhænger af den anvendte musemodeltype5. Der blev ikke påvist akutte tegn på afstødning af vært/graft ved transplantationer mellem C57BL/6J-mus.
Figur 1. Samlet ordning for diskret transplantation af MACS renset fotoreceptor prækursorer i voksen mus nethinden. Donorceller fra PN 4 Nrl-GFP hvalpe er isoleret, efterfulgt af CD73-baserede MAC-sortering og transplanteret i det subretinale rum af musevært nethinder. Klik her for at få vist en større figur.
Figur 2. Macs' berigelse af fotoreceptorer, der kan transplanteres. Celleaffjedringen fra alle opsamlet PN4 nethinder inkuberes med primære rotteanti-CD73 antistoffer efterfulgt af vask og inkubation med anti-rotte antistoffer konjugeret med mikroperler. Ubundne antistoffer vaskes væk. Celleophænget passerer gennem en LS-kolonne, der er forbundet med et magnetisk stativ. Celler, der er bundet af antistoffer, forbliver fastgjort til kolonnen, mens de resterende celler udråbes og indsamles (CD73-negativ brøk). Endelig fjernes LS-kolonnen fra magnetstanden, og de resterende celler elueres og opsamles (CD73-positiv fraktion). Klik her for at se hele filmen.
Figur 3. Analyse af nrl-GFP-positiv celleberigelse efter CD73-baseret MAC-sortering. (A) Før sorteringen indeholdt den oprindelige population af donorceller 30,4% af nrl-GFP-positive celler. Efter MAC-sortering kunne der påvises en berigelse af GFP-positive celler i CD73+ fraktionen (86,9%) mens CD73-fraktionen kun indeholdt små mængder GFP+-celler (9,9 %). (B) Repræsentativt billede, der viser resultatet af CD73-baseret MAC-sortering af PN4 Nrl-GFP-celler. 1 million celler fra hver fraktion blev belagt på laminin-coatede coverslips. Celler blev fastsat 4 timer efter plating med 4% PFA i 10 min. Celler blev plettet med DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, 1:20,000). En betydelig berigelse af GFP-positive celler i CD73+ fraktionen blev observeret sammenlignet med inputfraktionen eller CD73-fraktionen. Klik her for at få vist en større figur.
Figur 4. Subretinal injektion. Skematisk tegning af transplantationsprocessen ind i den voksne musehinde. Nålen indsættes gennem et hul i ora serrata, navigeres gennem vitreal rummet ved at undgå at røre linsen og placeres i nethinden under visuel kontrol. Ved blidt at skubbe, er nålen stanset gennem nethinden og placeres i det subretinale rum. Til sidst injiceres celleaffjedringen omhyggeligt under visuel kontrol ved at evaluere løsrivelsesprocessen.
Figur 5. Integration af transplanterede fotoreceptorceller. Repræsentativt billede, der viser integrerede CD73-baserede MACS sorterede PN4 Nrl-GFP-celler efter transplantation i den voksne musehinde. Transplanterede fotoreceptorprækursorer integreres korrekt i det ydre nukleare lag (ONL) og genererer moden fotoreceptormorfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subretinal transplantation af fotoreceptorprækursorceller er et pålideligt redskab til at opnå integration af disse lysfølsomme celler i værtsnetinder i et betydeligt antal1,2. Dette kan gøre det muligt at etablere en celleterapi til behandling af retinale degenerative sygdomme i fremtiden6. Donorpopulationen af celler, der i øjeblikket er isoleret fra PN 4 nethinder, er en blanding af forskellige celletyper, hvorfra kun fotoreceptorprækursorcellerne integreres efter subretinal injektion. Ved hjælp af CD73-baseret MAC-sortering kan andelen af fotoreceptorer inden for donorcelleaffjedringen øges til ≈ 90%, der tillader en ca. 3 gange højere integrationshastighed i værts nethinder af vild type sammenlignet med den usorterede cellepopulation8. I sammenligning med flowcytometry har MACS fordelen ved en hurtig sorteringsprocedure, og at det kan være relativt let at anvende på GMP-standarder. Rensning af transplanterbare fotoreceptorer er af særlig interesse i lyset af de seneste fordele for in vitro-generationen af fotoreceptorer fra pluripotente stamceller12-14. Kulturer af differentierede pluripotente stamceller består af forskellige celletyper, hvilket gør tilgængeligheden af specifikke sorteringsprocedurer til en væsentlig forudsætning for deres fremtidige anvendelse i celletransplantationsbehandlinger.
Ifølge MACS-rensningsproceduren er flere punkter bemærkelsesværdige, hvilket sikrer en arbejdsgang uden større forstyrrelser. Jo højere antallet af nethinder, der skal sorteres, jo mere tid er nødvendig for deres fordøjelse. Efter fordøjelsen skal sammenlægning af celler undgås under sorteringsproceduren. Dette sker helst før tilsætning af det sekundære antistof og under dets inkubation. I dette tilfælde skal aggregatet fjernes straks med en pipette. Under eluering af MACS-buffer under opsamling af MACS-negativ fraktion er det absolut nødvendigt ikke at tilføje mere end 3 ml til kolonnen. Bufferens tryk på kolonnen vil være for højt, hvis der tilsættes mere buffer end 3 ml. Dette vil forstyrre bindingen af antistoffet til cellerne og sænker sorteringseffektiviteten. Når du fjerner kolonnen fra det magnetiske stativ for at begynde at indsamle den MACS-positive fraktion, skal dette trin gøres hurtigt. De 5 ml MACS-buffer skal tilsættes til kolonnen så hurtigt som muligt. Springet skal også sættes og trykkes hurtigt, indtil hele bufferen er gennem kolonnen. Det er ikke nødvendigt at bekymre sig om det anvendte tryk. MACS-bufferen er isotonic og kan varieres. Det er muligt at bruge FACS buffer, cellekultur medium, PBS, EBSS eller HBSS. Bufferens sterilitet kan opnås ved at filtrere gennem en 0,4 μm filtermembran.
Efter berigelse af MACS kan en vellykket transplantation af donorceller til det subretinalenum opnås ved at holde følgende punkter i tankerne. Da fotoreceptorceller synes at være meget følsomme over for behandling ex vivo, er det ikke tilrådeligt at holde dem på 4 °C længere end nødvendigt. Fortsæt med transplantation så hurtigt som muligt. Når du indsætter injektionsnålen i øjet, er det vigtigt at undgå at røre linsen, da den relativt skarpe metalnål kan beskadige linsen, hvilket resulterer i induktion af linseinduceret uveitis. Det sidste skridt på vejen til det subretinale rum, indtrængningen af nethinden, er afgørende. Da det ikke visuelt kan observeres, om det subretinale rum er nået, er det vigtigt at udvikle en følelse for det rigtige skubbetryk og vævsresistens. For at teste, hvis nålehovedet er placeret korrekt, kan der påføres et lille volumen, og nethindens løsrivelse ved nålehovedet skal omhyggeligt observeres. Hvis der dannes en rund, bullous løsrivelse uden blødning, er positionen korrekt, og resten af opløsningen kan anvendes omhyggeligt. Under injektionen skal nålen forblive i sin position for at undgå yderligere skade på vævet. Nethindehullet, der skabes af injektionsnålen, forsegles af sig selv, hvis nålen trækkes langsomt tilbage. Hele proceduren skal udføres i den minimale tid, der er mulig for at undgå yderligere stress og skade på dyret. Under transplantationen har celleaffjedringen tendens til at klumpe og blokere mikroliter sprøjten. Hvis dette sker, foreslås en fortynding af cellesuspensionen ved hjælp af steril PBS eller HBSS. En anden mulighed for at løse dette problem er at tilføje 1 μl DNAse I til celleaffjedringen for at opløse DNA-klumper fra døde celler, som har tendens til at lime levende celler sammen.
Denne protokol er begrænset til magnetisk sortering af celler. Cellerne kan derfor kun sorteres for én markør pr. sorteringsrunde. I sammenligning med flowcytometry, hvor celler kan sorteres ved hjælp af forskellige markører (herunder fysiologiske egenskaber såvel som forskellige celleoverflademarkører) på samme tid, er dette en stor ulempe ved denne teknik. Når sorteringen for forskellige markører i et kort tidsvindue er nødvendig, kan flowcytometri være den bedste løsning. Sortering for fluorescerende egenskaber af celler, som transgenisk udtrykt GFP eller andre livscellemarkører, er heller ikke mulig med denne teknik. Det er i øjeblikket begrænset til brugen af celleoverfladeantistoffer, der kan konjugeres med magnetiske perler. Ikke desto mindre kunne denne teknik skaleres op baseret på det anvendte tekniske udstyr.
Da Miltenyi Biotec i øjeblikket er den eneste leverandør af magnetiske cellesorteringsværktøjer, er der ikke noget alternativ tilgængeligt til dato. Til celleafkobling kan der anvendes andre enzymer end papain (dvs. trypsin). Bemærk, at vores laboratorium opnåede de bedste resultater med papain, da dette ser ud til at være det mest blide dissociationsenzym i vores hænder. Tidsvinduet for papain fordøjelsen (30-60 min) er variabel. I denne tidsvindue blev der opnået optimal fordøjelse i vores laboratorium. Kortere eller længere inkubationstid kan være nødvendig afhængigt af prøvestørrelse, prøvekvalitet og anvendt enzym. Individuel testning foreslås.
I betragtning af at MACS i et enkelt trin ikke når renhedsniveauer så højt som flowcytometry, kan en mulig yderligere anvendelse af denne teknik være negativ sortering af uønskede og potentielle skadelige celler. Der kan cellefraktionen positiv for en given celleoverflademarkør, men ikke af interesse, sorteres ud, hvilket efterlader den brøkdel af interessen isoleret i strømmen igennem. Dette kan gøres på forhånd eller efter et positivt sorteringstrin og tillader yderligere forskelsbehandling af celler ved hjælp af forskellige celleoverflademarkører samt fjernelse af uønskede celler, som feederlagsceller eller udifferentierede celler fra pluripotente stamcellekulturer med deres potentielle tumorgene risiko. Derfor kan MACS være egnet til rensning af fotoreceptorer fra ES- eller iPS-cellekulturer i mulige fremtidige terapeutiske anvendelser, da det repræsenterer en blid, hurtig og enkel behandling til rensning af store mængder dyrkede celler. MACS kan let anvendes på GMP-betingelser, da detaljerne i sorteringstrin, dvs. mekanik, væsker og procedurer reduceres sammenlignet med flowcytometry. Det er bemærkelsesværdigt, at MACS allerede rutinemæssigt anvendes i kliniske forsøg til berigelse af celler fra blod eller knoglemarv. Interessant nok kan MACS endda anvendes på celler, når der ikke er nogen passende celleoverflademarkør til stede, ved genetisk at introducere en overflademarkør for at gøre celler "kompetente" til efterfølgende magnetisk cellesorteringstrin15.
Sammenfattende repræsenterer MACS et pålideligt og hurtigt værktøj til at berige fotoreceptorprækursorceller ved hjælp af celleoverflademarkører til transplantationsundersøgelser. Derudover er det en let anvendelig metode til fremtidige kliniske applikationer, der kræver GMP-tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Anand Swaroop for at have leveret Nrl-GFP-mus, Jochen Haas for teknisk support og Sindy Böhme og Emely Lessmann til husdyrhold.
Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center for Regenerative Terapier Dresden, CRTD Seed Grant Program, SFB 655, og ProRetina e.V. stiftelse, DIGS-BB Graduate Program Dresden og Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
