Summary
Il trapianto cellulare rappresenta una strategia per il trattamento della degenerazione retinica caratterizzata dalla perdita di fotorecettore. Qui descriviamo un metodo per l'arricchimento dei fotorecettori trapiantabili e il loro innesto subretinale in topi adulti.
Abstract
La compromissione della vista e la cecità dovute alla perdita delle cellule che percepiscono la luce della retina, cioè dei fotorecettori, rappresentano la ragione principale della disabilità nei paesi industrializzati. La sostituzione dei fotorecettori degenerati con il trapianto di cellule rappresenta una possibile opzione di trattamento nelle future applicazioni cliniche. Infatti, recenti studi preclinici hanno dimostrato che i fotorecettori immaturi, isolati dalla retina neonatale del topo al giorno 4 postnatale, hanno il potenziale per integrarsi nella retina del topo adulto dopo il trapianto subretinale. Le cellule donatrici hanno generato una morfologia fotorecettori matura che include segmenti interni ed esterni, un corpo cellulare rotondo situato nello strato nucleare esterno e terminali sinaptici in prossimità delle cellule bipolari endogene. In effetti, recenti rapporti hanno dimostrato che i fotorecettori dei donatori si integrano funzionalmente nei circuiti neurali dei topi ospiti. Per una futura applicazione clinica di tale approccio di sostituzione cellulare, le sospensioni purificate delle cellule scelte devono essere generate e posizionate nella posizione corretta per una corretta integrazione nell'occhio. Per l'arricchimento dei precursori del fotorecettore, lo smistamento dovrebbe basarsi su specifici antigeni di superficie cellulare per evitare la modifica genetica delle cellule donatrici da parte dei reporter. Qui mostriamo lo smistamento cellulare associato al magnetico (MACS) - arricchimento dei precursori del fotorecettore a bastone trapiantabile isolati dalla retina neonatale di topi reporter specifici del fotorecettore basati sul marcatore di superficie cellulare CD73. L'incubazione con anticorpi anti-CD73 seguita da anticorpi secondari coniugati con micro-perline ha permesso l'arricchimento dei precursori del fotorecettore dell'asta da parte del MACS a circa il 90%. Rispetto alla citometria a flusso, MACS ha il vantaggio che può essere più facile da applicare agli standard GMP e che elevate quantità di cellule possono essere ordinate in brevi periodi di tempo relativi. L'iniezione di sospensioni cellulari arricchite nello spazio subretinale dei topi adulti di tipo selvatico ha comportato un tasso di integrazione 3 volte superiore rispetto alle sospensioni cellulari nonsortite.
Introduction
La visione è uno dei sensi primi degli umani. La compromissione di questo senso e della cecità sono una delle principali ragioni della disabilità nei paesi industrializzati. La causa predominante di compromissione della vista o cecità è la degenerazione retinica, caratterizzata da perdita cellulare fotorecettore, in quanto può essere osservata nella degenerazione maculare, retinite pigmentosa, distrofia conica-asta e altre condizioni. Ad oggi, non è disponibile una terapia efficace per ripristinare la visione persa. Nel 2006 e nel 2008 due diversi laboratori hanno riportato, indipendenti l'uno dall'altro, un trapianto riuscito di cellule precursori del fotorecettore di bastone in retine di topi adulti di tiposelvatico 1,2. Così, derivante dalla possibilità di trapianto di cellule precursori del fotorecettore anche in una retina degenerata, per sostituire i fotorecettori degenerati e ripristinare la visione. Infatti, è stato dimostrato di recente che tali cellule precursori fotorecettori trapiantate suscitano criteri morfologici di fotorecettori maturi di tipo selvatico, come i segmentiesterni 3adeguatamente sviluppati, terminali sinaptici in prossimità di cellule bipolari endogene e un corpo cellulare rotondo situato nello stratonucleare esterno 2-4,nonché la capacità di integrarsi funzionalmente nel circuito neurale ospite5-7. Uno dei principi principali di questa strategia è l'uso della retina dei giovani topi postnatale giorno 4 (PN 4, PN0 è definita come giorno di nascita), con conseguente miscela di diversi tipi di cellule per il trapianto. Sullo sfondo di una futura applicazione terapeutica, questa miscela deve essere purificata per le cellule precursori del fotorecettore. CD73 è stato descritto come il primo marcatore di superficie cellulare specifico per i giovani fotorecettori nella retina8-10. Qui, dimostriamo un metodo di purificazione delle cellule precursori del fotorecettore basato su questo marcatore di superficie cellulare e con l'uso della tecnica macs (magnetic-associated cell sorting). MACS potrebbe avere vantaggi rispetto alle tecniche di smistamento delle celle attivate fluorescentmente, a causa dei tempi di smistamento rapidi e della più facile regolazione delle condizioni GMP. Potremmo dimostrare un arricchimento di ~ 90% e un tasso di integrazione fino a 3 volte superiore quando trapiantiamo la popolazione arricchita nello spazio subretinale nelle retine adulte di tipo selvatico. Pertanto, l'arricchimento cellulare precursore del fotorecettore basato su MACS e il trapianto subretinale sono tecniche affidabili e promettenti per lo sviluppo di una strategia terapeutica rigenerativa per il trattamento della degenerazione retinica.
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Protocol
Uso etico e cura degli animali dichiarazione:
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in stretta conformità con le leggi dell'Unione Europea e della Germania (Tierschutzgesetz) e hanno aderito alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e della visione. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico animale della TU Dresda e della Landesdirektion Dresden (numero di approvazione: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Prima di iniziare la dissociazione cellulare e l'ordinamento cellulare
- Etichettare tre tubi di reazione da 15 ml con: Lavaggio (W), Frazione positiva (+) e Frazione negativa (-).
2. Dissociazione della retina
- Decapitare i cuccioli PN 4 usando una forbice.
- Risciacquare la testa dei cuccioli poco dopo nel 70% di etanolo seguito dal lavaggio in PBS.
- Trasferire la testa in HBSS freddo ed enucleare l'occhio (ripetere questo passaggio per tutte le teste). Per enucleare, aprire le palpebre e fissare l'occhio con forcep curve nella regione del nervo ottico. Quindi tira l'occhio con attenzione fuori dall'orbita.
- Dopo aver enucleato tutti gli occhi, isolare la retina: introdurre una forbice chiusa nel nervo ottico e aprire le lame. Sbirciare l'RPE/chorid out. Rimuovere le lenti e i vasi sanguigni utilizzando forcep curve.
- Trasferire le retine isolate in un tubo di reazione da 1,5 ml contenente la soluzione di papaina (fornita dal kit di dissociazione della papaina).
- Incubare le retine nella soluzione di papaina per 30-60 minuti in un bagno d'acqua o shaker (400 giri/min) a 37 °C.
- Mentre le retine incubano nella soluzione di papaina, pipetta 1 ml di soluzione ovomucoide in un tubo di reazione da 15 ml (etichetta "1").
- Aggiungere 60 μl di DNasi I (10 mg/ml) + 60 μl di soluzione ovomucoide (fornita dal kit) + 520 μl di EBSS in un tubo di reazione da 15 ml (etichetta "2").
- Dopo l'incubazione della papaina, trasferire la soluzione di papaina contenente le retine parzialmente digerite nel tubo di reazione "2".
- Utilizzando una pipetta lucida antincendio, eseguire la dissociazione meccanica (10 volte su e giù).
- Pipettare la sospensione a cella singola al tubo di reazione "1". Prova a generare 2 strati strati stratificando delicatamente la sospensione cellulare sopra la soluzione ovomucoide.
- Centrifuga per 5 min a 300 x g (circa 1.300 giri/min).
- Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 500 μl di tampone MACS.
3. Ordinamento delle celle mediante MACS (Magnetic Associated Cell Sorting)
- Aggiungere anticorpo anti-CD73 del ratto X μl a 500 μl per ottenere una concentrazione finale di 10 μg/ml.
- Incubare 5 minuti sul ghiaccio.
- Riempire il tubo di reazione da 15 ml a 10 ml con tampone MACS e centrifugarlo per 5 minuti ad una velocità di 300 x g.
- Rimuovere il supernatante.
- Rimpiorsi il pellet in tampone MACS da 480 μl e aggiungere 120 μl di microperline IgG di capra anti-ratto.
- Incubare 15 minuti sul ghiaccio; non agitarlo, scuoterlo o mescolarlo.
- Riempire il tubo di reazione da 15 ml a 5 ml con tampone MACS e centrifugarlo per 5 minuti a 300 x g.
- Poiché il tubo di reazione è stato centrifugato:
- Regolare una colonna LS nel supporto magnetico.
- Mettere il filtro di preseparazione sopra la colonna LS.
- Idratare il filtro di preseparazione e la colonna LS con tampone MACS da 3 ml e raccogliere il tampone MACS nel tubo di lavaggio (W).
- Rimuovere il supernatante.
- Rimosi il pellet in tampone MACS da 500 μl.
- Caricare la sospensione cellulare da 500 μl sul filtro, quindi aggiungere 1 ml di tampone MACS al filtro e raccogliere la frazione negativa nel tubo di reazione della frazione negativa (-).
- Aggiungere quindi 3 x 3 ml di buffer MACS alla colonna per lavare via le celle non associate alla colonna
- Una volta che questi 9 ml sono attraverso la colonna LS, rimuovere la colonna dal supporto magnetico e installarla sopra il tubo di reazione della frazione positiva (+).
- Caricare rapidamente 5 ml di buffer MACS nella colonna LS e mettere lo stantuffo nella colonna LS e premerlo verso il basso fino a quando l'intero buffer non passa attraverso la colonna.
- Centrifugare il tubo di reazione contenente la frazione positiva per 5 min a 300 x g.
- Rimuovere il supernatante, resuspend in 500 μl di tampone MACS e mantenere a 4 °C.
- Contare la quantità totale di celle utilizzando un dispositivo comune di conteggio delle celle.
- Preparare una sospensione cellulare dalla frazione ordinata positiva contenente 2 x 105 celle/μl nel buffer MACS e mantenerla a 4 °C
4. Trapianto di cellule precursori fotorecettore ordinate da MAC nella retina del topo
- Assicurarsi di avere tutte le seguenti soluzioni pronte: 1 ml di PBS sterile o HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 ml sterile deionizzato H2O, aliquote delle frazioni di sospensione cellulare a 4 °C.
- Anestetizzare il topo adulto (cioè 2-4 mesi)con un'iniezione intraperitoneale di cloridrato di medetomidina (0,01 mg/10 g di peso corporeo), chetamina (0,75 mg/10 g di peso corporeo). Quindi fare un'iniezione sottocutanea di Buprenorfina (0,05 mg / kg di peso corporeo) per alleviare il dolore.
- Dilatare gli alunni con un calo di Fenilefrina 2.5%-Tropicamid 0.5%.
- Fissare il mouse nel supporto della testa del mouse e posizionarlo al microscopio stereo.
- Applicare una goccia di gel visidico per evitare l'asciugatura dell'occhio.
- Fare un piccolo foro al confine tra sclera e cornea (rispettivamente ora serrata)usando uno sterile 30 G 1/2 in ago.
- Tagliare un coperchio comune scivolare in piccoli pezzi (circa 5 mm x 5 mm) utilizzando una penna diamanta, posizionare uno di questi pezzi sopra la cornea, consentendo la visualizzazione diretta della retina.
- Sciacquare più volte la siringa microliter presterilizzata con acqua deionizzata.
- Caricare la siringa microliter con 1 μl di sospensione cellulare, dirigere l'ago tangenzialmente attraverso la congiuntiva e la sclera e posizionare sotto controllo visivo nella metà nasale della retina.
- Punzonare delicatamente un foro nella retina fino a raggiungere lo spazio subretinale, iniettare la sospensione cellulare nello spazio subretinale.
- Osservare il distacco bolloso della retina, che dovrebbe essere uniforme, coprendo circa 1/4 dello spazio retinico senza alcun sanguinamento.
- Ritirare delicatamente la siringa, il foro retinica si sigilla automaticamente.
- Sciacquare più volte la siringa del microlitro con acqua deionizzata.
- Rilasciare il mouse dal supporto della testa.
- Svegliare il topo iniettando cloridrato di atipamozolo per invertire l'effetto cloridrato di medetomidina.
- Posizionare il mouse per il tempo di risveglio in una camera calda e scura (circa 25 °C).
- I successivi 2 giorni dopo il trapianto, la buprenorfina (0,05 mg / kg di peso corporeo) deve essere somministrata per iniezione sottocutanea al mattino e al pomeriggio per alleviare il dolore.
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Representative Results
Al fine di valutare la capacità dei fotorecettori dell'asta di integrarsi nella retina del mouse, è stata utilizzata una linea di reporter del topo, in cui GFP è guidata dalla cerniera neurale retina leucina (Nrl, Nrl-GFP)promotrice 11. L'Nrl è il primo marcatore dei fotorecettori di aste che inizia la sua espressione all'E12.5 per tutta l'età adulta, consentendo una specifica etichettatura delle cellule fotorecettori dell'asta del donatore.
I cuccioli di PN 4 Nrl-GFP sono stati decapitati e gli occhi sono stati enucleati. Le retine sono state quindi isolate e dissociate utilizzando il metodo sopra descritto. La sospensione cellulare risultante è stata quindi smistata utilizzando MACS basato su CD73 (Figure 1 e 2). Dopo lo smistamento MAC, abbiamo analizzato l'arricchimento raggiunto durante questa procedura.
Come mostrato nella figura 3A, la sospensione cellulare iniziale (Input) conteneva il 30,4% di cellule positive alla GFP, cioè. fotorecettori di aste. Dopo lo smistamento MAC basato su CD73, un arricchimento fino all'86,9% nella frazione CD73-positiva (CD73+) è stato osservato dalla citometria del flusso. Nella frazione CD73-negativa (CD73-) solo il 9,9% di tutte le cellule è stato rilevato positivamente per la GFP(Figura 3A). L'arricchimento delle cellule positive nrl-GFP a seguito del MACS basato su CD73 viene inoltre visualizzato dopo la placcatura in vitro (Figura 3B).
Dopo lo smistamento del MAC, le cellule donatrici nella frazione cd73-positiva sono state sfollate e risosorti ad una concentrazione finale di 200.000 cellule/μl. Questa sospensione cellulare è stata ulteriormente utilizzata per il trapianto nello spazio subretinale delle retine ospiti di tipo selvatico (Figura 4). Da tre a quattro settimane dopo il trapianto, le retine ospiti sono state riparato, isolate e se seleate. Diverse cellule donatrici integrate nello strato nucleare esterno degli ospiti e acquisite la morfologia dei fotorecettori maturi con localizzazione del corpo cellulare nello strato nucleare esterno e formazione di sferule sinaptiche e segmenti interni (Figura 5). Immagini dettagliate sono state pubblicate in precedenza dal nostrogruppo 3,8 che mostrano un risultato paragonabile alle cellule selezionate dal FAC trapiantate per ospitare retinae da altri gruppi4,6,10. Coerente in tutti questi studi è che le cellule trapiantate rimangono nel sito di iniezione, definito dalla retina ospite distaccata bollosa, e non migrano via. Alcuni si integrano nella retinaospite (cioè nello strato nucleare esterno), e altri rimangono nello spazio subretinale3. Inoltre, è stato dimostrato che la distribuzione delle cellule donatrici nel sito di integrazione dipende dal tipo di modello di topo utilizzato5. Non sono stati rilevati segni di rigetto acuto dell'ospite/innesto nei trapianti tra topi C57BL/6J.
Figura 1. Schema generale di trapianto subretinale di precursori purificati del fotorecettore MACS nella retina del topo adulto. Le cellule donatrici dei cuccioli di PN 4 Nrl-GFP sono isolate, seguite dallo smistamento MAC basato su CD73 e trapiantate nello spazio subretinale delle retine ospiti del topo. Clicca qui per visualizzare la figura più grande.
Figura 2. Arricchimento di fotorecettori trapiantabili da MACS. La sospensione cellulare generata da tutte le retine PN4 raccolte viene incubata con anticorpi anti-CD73 del ratto primario seguiti da lavaggio e incubazione con anticorpi anti-ratto coniugati con microperline. Gli anticorpi non vincolati vengono lavati via. La sospensione cellulare viene passata attraverso una colonna LS collegata con un supporto magnetico. Le cellule legate da anticorpi rimangono attaccate alla colonna mentre le cellule rimanenti vengono eluite e raccolte (frazione CD73-negativa). Infine, la colonna LS viene rimossa dal supporto magnetico e le celle rimanenti vengono eluizzate e raccolte (frazione CD73-positiva). Clicca qui per visualizzare il film completo.
Figura 3. Analisi dell'arricchimento positivo delle cellule Nrl-GFP a seguito dello smistamento MAC basato su CD73. (A) Prima dello smistamento, la popolazione iniziale di cellule donatrici conteneva il 30,4% delle cellule positive dell'Nrl-GFP. A seguito dello smistamento mac, un arricchimento delle cellule positive alla GFP potrebbe essere rilevato nella frazione CD73+ (86,9%) mentre la frazione CD73 conteneva solo basse quantità di cellule GFP+ (9,9%). (B) Immagine rappresentativa che dimostra il risultato dell'ordinamento MAC basato su CD73 delle cellule PN4 Nrl-GFP. 1 milione di cellule di ogni frazione sono state placcate su copripasto rivestiti di laminina. Le celle sono state fissate 4 ore dopo la placcatura con 4% di PFA per 10 minuti. Le celle erano macchiate di DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, 1:20.000). Un arricchimento significativo delle cellule positive alla GFP nella frazione CD73+ è stato osservato rispetto alla frazione di ingresso o alla frazione CD73. Clicca qui per visualizzare la figura più grande.
Figura 4. Iniezione subretinica. Disegno schematico del processo di trapianto nella retina del topo adulto. L'ago viene inserito attraverso un foro nell'ora serrata,navigato attraverso lo spazio vitreo evitando di toccare l'obiettivo e posto alla retina sotto controllo visivo. Spingendo delicatamente, l'ago viene perforato attraverso la retina e posto nello spazio subretinale. Alla fine, la sospensione cellulare viene iniettata attentamente sotto controllo visivo valutando il processo di distacco.
Figura 5. Integrazione di cellule fotorecettori trapiantate. Immagine rappresentativa raffigurante MACS integrato basato su CD73 ordinato cellule PN4 Nrl-GFP in seguito al trapianto nella retina del topo adulto. I precursori del fotorecettore trapiantati si integrano correttamente nello strato nucleare esterno (ONL) e generano una morfologia del fotorecettore maturo.
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Discussion
Il trapianto subretinale di cellule precursori del fotorecettore rappresenta uno strumento affidabile per ottenere l'integrazione di queste cellule sensibili alla luce nelle retine ospiti innumero significativo 1,2. Ciò potrebbe consentire l'istituzione di una terapia cellulare per il trattamento delle malattie degenerative retiniche in futuro6. La popolazione donatrice di cellule, attualmente isolata dalle retine PN 4, è una miscela di diversi tipi di cellule, da cui solo le cellule precursori del fotorecettore si integrano dopo iniezione subretinica. Utilizzando lo smistamento MAC basato su CD73, la percentuale di fotorecettori all'interno della sospensione cellulare del donatore può essere aumentata ≈ un 90% che consente un tasso di integrazione circa 3 volte superiore nelle retine ospiti di tipo selvaggio rispetto alla popolazione cellulare non smistata8. Rispetto alla citometria a flusso, MACS ha il vantaggio di una procedura di smistamento rapido e che può essere applicata relativamente facilmente agli standard GMP. La purificazione dei fotorecettori trapiantabili è di particolare interesse alla luce dei recenti vantaggi per la generazione in vitro di fotorecettori da cellule staminali pluripotenti12-14. Le colture di cellule staminali pluripotenti differenziate sono composte da diversi tipi di cellule, rendendo la disponibilità di specifiche procedure di smistamento un prerequisito essenziale per il loro futuro utilizzo nelle terapie di trapianto cellulare.
Secondo la procedura di purificazione MACS, diversi punti sono degni di nota, garantendo un flusso di lavoro senza gravi disturbi. Maggiore è il numero di retine da ordinare, più tempo è necessario per la loro digestione. Dopo la digestione, durante la procedura di smistamento, l'aggregazione delle cellule deve essere evitata. Ciò avviene preferibilmente prima dell'aggiunta dell'anticorpo secondario e durante la sua incubazione. In questo caso, l'aggregato deve essere rimosso immediatamente con una pipetta. Durante l'eluizione del buffer MACS durante la raccolta della frazione MACS-negativa, è assolutamente necessario non aggiungere più di 3 ml alla colonna. La pressione del buffer sulla colonna sarà troppo alta se si aggiunge più tampone di 3 ml. Ciò disturberà il legame dell'anticorpo alle cellule e riduce l'efficienza di smistamento. Quando si rimuove la colonna dal supporto magnetico per iniziare a raccogliere la frazione macs-positiva, questo passaggio deve essere fatto rapidamente. I 5 ml di tampone MACS devono essere aggiunti alla colonna il più velocemente possibile. Inoltre, il tuffo deve essere messo e premuto rapidamente fino a quando l'intero buffer non attraversa la colonna. Non è necessario preoccuparsi della pressione applicata. Il buffer MACS è isotonico e può essere variato. È possibile utilizzare buffer FACS, supporto di coltura cellulare, PBS, EBSS o HBSS. La sterilità del tampone può essere ottenuta filtrando attraverso una membrana filtrante da 0,4 μm.
Dopo l'arricchimento da parte del MACS, è possibile ottenere un trapianto riuscito di cellule donatrici nello spazio subretinale tenendo a mente i seguenti punti. Poiché le cellule fotorecettore sembrano essere molto sensibili al trattamento ex vivo, non è consigliabile mantenerle a 4 °C più a lungo del necessario. Procedere per il trapianto il più velocemente possibile. Quando si inserisce l'ago di iniezione nel bulbo oculare, è importante evitare di toccare l'obiettivo in quanto l'ago metallico relativamente affilato potrebbe danneggiare l'obiettivo con conseguente induzione dell'uveite indotta dall'obiettivo. L'ultimo passo sulla strada per lo spazio subretinale, la penetrazione della retina, è cruciale. Poiché non è possibile osservare visivamente se lo spazio subretinale viene raggiunto, è importante sviluppare una sensazione per la giusta pressione di spinta e resistenza ai tessuti. Per testare, se la testa dell'ago è posizionata correttamente, potrebbe essere applicato un piccolo volume e il distacco della retina alla testa dell'ago dovrebbe essere osservato attentamente. Se si sta formando un distacco tondo e bolloso senza sanguinamento, la posizione è corretta e il resto della soluzione può essere applicato con attenzione. Durante l'iniezione, l'ago deve rimanere nella sua posizione per evitare ulteriori danni al tessuto. Il foro retinico creato dall'ago di iniezione sigillerà da solo se l'ago viene retratti lentamente. L'intera procedura deve essere eseguita nel minor tempo possibile per evitare ulteriori stress e danni all'animale. Durante il trapianto, la sospensione cellulare tende ad agglobo e bloccare la siringa del microlitro. In questo caso, si suggerisce una diluizione della sospensione cellulare utilizzando PBS sterile o HBSS. Un'altra possibilità per superare questo problema è aggiungere 1 μl di DNA I alla sospensione cellulare, per sciogliere i grumi di DNA dalle cellule morte, che tendono ad incollare le cellule viventi insieme.
Questo protocollo è limitato allo smistamento magnetico delle cellule. Pertanto, le celle potrebbero essere ordinate per un solo marcatore per arrotondamento di ordinamento. Rispetto alla citometria del flusso, dove le cellule potrebbero essere ordinate usando marcatori diversi (comprese le proprietà fisiologiche e diversi marcatori di superficie cellulare) allo stesso tempo, questo è uno svantaggio importante di questa tecnica. Ogni volta che è necessario l'ordinamento per marcatori diversi in un breve lario, la citometria del flusso potrebbe essere la soluzione migliore. Inoltre, lo smistamento per le proprietà fluorescenti delle cellule, come la GFP espressa transgenicamente o altri marcatori di cellule di vita non è possibile con questa tecnica. Attualmente è limitato all'uso di anticorpi di superficie cellulare che possono essere coniugati con perline magnetiche. Tuttavia, questa tecnica potrebbe essere ridimensionata in base alle attrezzature tecniche utilizzate.
Poiché Miltenyi Biotec è attualmente l'unico fornitore di strumenti di smistamento delle celle magnetiche, non esiste un'alternativa disponibile fino ad oggi. Per la dissociazione cellulare, potrebbero essere usati altri enzimi diversi dalla papaina(cioè la tripparina). Naturalmente, il nostro laboratorio ha ottenuto i migliori risultati con la papaina, dal momento che questo sembra essere l'enzima di dissociazione più delicato nelle nostre mani. La finestra di tempo della digestione della papaina (30-60 min) è variabile. In questa finestra di tempo è stata raggiunta una digestione ottimale nel nostro laboratorio. Potrebbe essere necessario un tempo di incubazione più breve o più lungo a seconda delle dimensioni del campione, della qualità del campione e dell'enzima utilizzato. 20000 test individuali.
Dato che macs mono-passo non raggiunge livelli di purezza alti come la citometria del flusso, una possibile ulteriore applicazione di questa tecnica potrebbe essere lo smistamento negativo di cellule indesiderate e potenziali dannose. Lì, la frazione cellulare positiva per un dato marcatore di superficie cellulare ma non di interesse può essere risolta, lasciando la frazione di interesse isolata nel flusso attraverso. Questo potrebbe essere fatto in anticipo o dopo una fase di smistamento positivo e consente l'ulteriore discriminazione delle cellule utilizzando diversi marcatori di superficie cellulare e la rimozione di cellule indesiderate, come cellule dello strato di alimentatore o cellule indifferenziate da colture di cellule staminali pluripotenti con il loro potenziale rischio tumorale. Pertanto, MACS potrebbe essere adatto per la purificazione di fotorecettori da colture cellulari ES o iPS in possibili applicazioni terapeutiche future in quanto rappresenta un trattamento delicato, veloce e semplice per la purificazione di elevate quantità di cellule coltivate. Macs potrebbe essere facilmente applicato alle condizioni GMP poiché i dettagli delle fasi di smistamento, cioè meccanica, fluidi e procedure sono ridotti rispetto alla citometria del flusso. È interessante notare che MACS è già usato regolarmente negli studi clinici per l'arricchimento delle cellule dal sangue o dal midollo osseo. È interessante notare che MACS può essere applicato anche sulle cellule quando non è presente alcun marcatore di superficie cellulare adatto, introducendo geneticamente un marcatore di superficie per rendere le cellule "competenti" per i successivi passaggi di smistamento delle cellulemagnetiche 15.
In sintesi, MACS rappresenta uno strumento affidabile e veloce per arricchire le cellule precursori del fotorecettore utilizzando marcatori di superficie cellulare per studi di trapianto. Inoltre, è un metodo facilmente utilizzabile per future applicazioni cliniche che richiedono condizioni GMP.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ci piace ringraziare Anand Swaroop per aver fornito topi Nrl-GFP, Jochen Haas per il supporto tecnico e Sindy Böhme ed Emely Lessmann per l'allevamento.
Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, dal CRTD Seed Grant Program, dall'SFB 655 e dal ProRetina e.V. fondazione, il DIGS-BB Graduate Program Dresden e il Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
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