Summary
Celtransplantatie vertegenwoordigt een strategie voor de behandeling van netvliesdegeneratie die wordt gekenmerkt door fotoreceptorverlies. Hier beschrijven we een methode voor verrijking van transplanteerbare fotoreceptoren en hun subretinale enting in volwassen muizen.
Abstract
Slechtziendheid en blindheid als gevolg van het verlies van de lichtgevoelige cellen van het netvlies, d.w.z. fotoreceptoren, vormen de belangrijkste reden voor invaliditeit in geïndustrialiseerde landen. Vervanging van ontaarde fotoreceptoren door celtransplantatie is een mogelijke behandelingsoptie in toekomstige klinische toepassingen. Recente preklinische studies toonden inderdaad aan dat onrijpe fotoreceptoren, geïsoleerd van het neonatale netvlies van de muis op postnatale dag 4, het potentieel hebben om te integreren in het volwassen netvlies van de muis na subretinale transplantatie. Donorcellen genereerden een volwassen fotoreceptormorfologie inclusief binnen- en buitensegmenten, een rond cellichaam in de buitenste nucleaire laag en synaptische terminals in de nabijheid van endogene bipolaire cellen. Recente rapporten toonden inderdaad aan dat donorfotoreceptoren functioneel integreren in het neurale circuit van gastheermuizen. Voor een toekomstige klinische toepassing van een dergelijke celvervangingsbenadering moeten gezuiverde suspensussingen van de cellen van keuze worden gegenereerd en op de juiste positie worden geplaatst voor een goede integratie in het oog. Voor de verrijking van voorlopers van fotoreceptoren moet de sortering gebaseerd zijn op specifieke celoppervlakantigenen om genetische manipulatie van donorcellen te voorkomen. Hier tonen we magnetische-geassocieerde celsortering (MACS) - verrijking van transplanteerbare staaffotoreceptorprecursoren geïsoleerd van het neonatale netvlies van fotoreceptorspecifieke reportermuizen op basis van de celoppervlakmarker CD73. Incubatie met anti-CD73-antilichamen gevolgd door microparel geconjugeerde secundaire antilichamen maakte de verrijking van staaffotoreceptorprecursoren door MACS tot ongeveer 90% mogelijk. In vergelijking met flowcytometrie heeft MACS het voordeel dat het gemakkelijker kan worden toegepast op GMP-normen en dat grote hoeveelheden cellen in relatief korte tijdsperioden kunnen worden gesorteerd. Injectie van verrijkte celsuspensingen in de subretinale ruimte van volwassen wilde muizen resulteerde in een 3-voudig hogere integratiesnelheid in vergelijking met ongesorteerde celsuspensingen.
Introduction
Visie is een van de belangrijkste zintuigen van de mens. Aantasting van deze zin en blindheid zijn een van de belangrijkste redenen voor invaliditeit in geïndustrialiseerde landen. De belangrijkste oorzaak voor slechtziendheid of blindheid is retinale degeneratie, gekenmerkt door fotoreceptorcelverlies, zoals kan worden waargenomen bij maculadegeneratie, retinitis pigmentosa, cone-rod dystrofie en andere aandoeningen. Tot op heden is een effectieve therapie om verloren gezichtsvermogen te herstellen niet beschikbaar. In 2006 en 2008 meldden twee verschillende laboratoria, onafhankelijk van elkaar, een succesvolle transplantatie van staaffotoreceptorprecursorencellen in volwassen wilde muizen retinas1,2. Aldus, het voordoen van de mogelijkheid van fotoreceptor precursor celtransplantatie ook in een ontaard netvlies, om ontaarde fotoreceptoren te vervangen en het gezichtsvermogen te herstellen. Onlangs is namelijk aangetoond dat dergelijke getransplanteerde fotoreceptorprecursorcellen morfologische criteria van volwassen fotoreceptoren van het wilde type oproepen, zoals goed ontwikkelde buitenste segmenten3, synaptische terminals in de nabijheid van endogene bipolaire cellen en een rond cellichaam in de buitenste nucleaire laag2-4, evenals het vermogen om functioneel te integreren in het neurale circuit van de gastheer5-7. Een van de belangrijkste principes van deze strategie is het gebruik van postnatale dag 4 (PN 4, PN0 wordt gedefinieerd als dag van geboorte) jonge muizen netvlies, wat resulteert in een mengsel van verschillende celtypen voor transplantatie. Op de achtergrond van een toekomstige therapeutische toepassing moet dit mengsel worden gezuiverd voor fotoreceptorprecursorcellen. CD73 is beschreven als de eerste celoppervlakmarker specifiek voor jonge fotoreceptoren in het netvlies8-10. Hier demonstreren we een fotoreceptor precursor celzuiveringsmethode op basis van deze celoppervlakmarker en met behulp van de magnetische celsorteertechniek (MACS). MACS kan voordelen hebben in vergelijking met fluorescerende geactiveerde celsorteertechnieken, vanwege snelle sorteertijden en de eenvoudigere aanpassing aan GMP-omstandigheden. We kunnen een verrijking van ~ 90% en een tot 3-voudig hogere integratiesnelheid aantonen bij het transplanteren van de verrijkte populatie naar de subretinale ruimte in volwassen wild-type netvlies. Macs-gebaseerde fotoreceptor precursor celverrijking en subretinale transplantatie zijn dus betrouwbare en veelbelovende technieken voor de ontwikkeling van een regeneratieve therapeutische strategie voor de behandeling van retinale degeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Verklaring ethisch gebruik en verzorging van dieren:
Alle dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de wetgeving van de Europese Unie en duitsland (Tierschutzgesetz) en hielden zich aan de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en vision-onderzoek. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de dierenethiekcommissie van de TU Dresden en de Landesdirektion Dresden (erkenningsnummer: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Voordat u begint met celdissociatie en celsortering
- Etiket drie reactiebuizen van 15 ml met: Was (W), Positieve fractie (+) en Negatieve fractie (-).
2. Retina dissociatie
- Onthoofd de PN 4 pups met een schaar.
- Spoel het hoofd van de pups kort af in 70% ethanol gevolgd door wassen in PBS.
- Breng het hoofd over op koude HBSS en maak het oog enucleate (herhaal deze stap voor alle hoofden). Om te enucleeren, open de oogleden en fixeer het oog met gebogen tang op het oogzenuwgebied. Trek vervolgens het oog voorzichtig uit de baan.
- Na het verleiden van alle ogen, isoleer het netvlies: introduceer een gesloten schaar in de oogzenuw en open de messen. Peal de RPE/chorid uit. Verwijder de lenzen en bloedvaten met behulp van een gebogen tang.
- Breng het geïsoleerde netvlies over in een reactiebuis van 1,5 ml met de papaïneoplossing (geleverd door de papaïnedissociatiekit).
- Incubeer het netvlies in de papaïneoplossing gedurende 30-60 minuten in een waterbad of shaker (400 tpm) bij 37 °C.
- Terwijl het netvlies incubeert in de papaïneoplossing, pipeteert u 1 ml eiceloplossing tot een reactiebuis van 15 ml (label "1").
- Voeg 60 μl DNase I (10 mg/ml) + 60 μl eiceloplossing (meegeleverd door de kit) + 520 μl EBSS toe aan een reactiebuis van 15 ml (label "2").
- Breng na de incubatie van papaïne de papaïneoplossing met het gedeeltelijk verteerde netvlies over naar reactiebuis "2".
- Voer met behulp van een vuur gepolijste pipet mechanische dissociatie uit (10x op en neer).
- Pipetteer de eencellige suspensie naar reactiebuis "1". Probeer 2 lagen te genereren door de celsuspensie voorzichtig bovenop de eiceloplossing te legen.
- Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g (ongeveer 1.300 tpm).
- Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in 500 μl MACS-buffer.
3. Celsorteren met behulp van magnetische gekoppelde celsortering (MACS)
- Voeg X μl rat anti-CD73 antilichaam toe aan de 500 μl om een eindconcentratie van 10 μg/ml te bereiken.
- Incubeer 5 minuten op ijs.
- Vul de reactiebuis van 15 ml tot 10 ml met MACS-buffer en centrifugeer deze gedurende 5 minuten met een snelheid van 300 x g.
- Verwijder het supernatant.
- Resuspend de pellet in 480 μl MACS buffer en voeg 120 μl geiten anti-rat IgG microbeads toe.
- Incubeer 15 min op ijs; niet roeren, schudden of mengen.
- Vul de reactiebuis van 15 ml tot 5 ml met macs-buffer en centrifugeer deze gedurende 5 minuten bij 300 x g.
- Wanneer de reactiebuis wordt gecentrifugeerd:
- Stel een LS-kolom in de magnetische standaard in.
- Plaats het voorscheidingsfilter boven op de LS-kolom.
- Hydrateer het voorscheidingsfilter en de LS-kolom met 3 ml MACS-buffer en verzamel de MACS-buffer in de wasbuis (W).
- Verwijder het supernatant.
- Resuspend de pellet in 500 μl MACS buffer.
- Plaats de celsuspensie van 500 μl in het filter, voeg vervolgens 1 ml MACS-buffer toe aan het filter en verzamel de negatieve fractie in de negatieve fractie (-) reactiebuis.
- Voeg vervolgens 3 x 3 ml MACS-buffer toe aan de kolom om de cellen af te wassen die niet aan de kolom zijn gebonden
- Zodra deze 9 ml door de LS-kolom zijn, verwijdert u de kolom van de magnetische standaard en installeert u deze bovenop de reactiebuis met positieve fractie (+).
- Plaats snel 5 ml MACS-buffer in de LS-kolom en plaats de zuiger in de LS-kolom en druk deze naar beneden totdat de hele buffer door de kolom is.
- Centrifugeer de reactiebuis met de positieve fractie gedurende 5 min bij 300 x g.
- Verwijder het supernatant, resuspend in 500 μl MACS buffer en houd bij 4 °C.
- Tel het totale aantal cellen met behulp van een gemeenschappelijk celtellingsapparaat.
- Bereid een celsuspensie voor uit de positief gesorteerde fractie die 2 x 105 cellen/μl in macs-buffer bevat en houd deze bij 4 °C
4. Transplantatie van MAC-gesorteerde fotoreceptorprecursorcellen in het netvlies van de muis
- Zorg ervoor dat u alle volgende oplossingen bij de hand hebt: 1 ml steriel PBS of HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 ml steriel gedeï gedeïdiseerd H2O, aliquots van de celsuspensiefracties bij 4 °C.
- Verdoof de volwassen muis(d.w.z. 2-4 maanden oud) met een intraperitoneale injectie van medetomidinehydrochloride (0,01 mg/10 g lichaamsgewicht), ketamine (0,75 mg/10 g lichaamsgewicht). Doe vervolgens een subcutane injectie met Buprenorfine (0,05 mg/kg lichaamsgewicht) voor pijnverlichting.
- Verwijd pupillen met een daling van Phenylephrin 2,5%-Tropicamid 0,5%.
- Bevestig de muis in de muiskophouder en plaats deze onder de stereomicroscoop.
- Breng een druppel Visidic gel aan om uitdroging van het oog te voorkomen.
- Maak een klein gaatje op de rand tussen sclera en hoornvlies (respectievelijk ora serrata)met een steriele naald van 30 G 1/2.
- Snijd een gemeenschappelijke hoes in kleine (ongeveer 5 mm x 5 mm) stukken met behulp van een diamantpen, plaats een van deze stukken bovenop het hoornvlies, zodat het netvlies direct kan worden gevisualisatied.
- Spoel de voorgesteriliseerde microliterspuit meerdere keren door met gedeioneerd water.
- Laad de microliterspuit met 1 μl celsuspensie, steek de naald tangentially door het bindvlies en de sclera en plaats deze onder visuele controle in de neushelft van het netvlies.
- Sla voorzichtig een gat in het netvlies totdat u de subretinale ruimte bereikt, injecteer de celsuspensie in de subretinale ruimte.
- Let op de bulleuze ontkoppeling van het netvlies, die uniform moet zijn en ongeveer 1/4 van de netvliesruimte bedekt zonder bloedingen.
- Trek de spuit voorzichtig terug, het netvliesgat sluit automatisch af.
- Spoel de microliterspuit meerdere keren met gedeioneerd water.
- Laat de muis los van de hoofdhouder.
- Maak de muis wakker door atipamozole hydrochloride te injecteren voor omkering van het medetomidine hydrochloride-effect.
- Plaats de muis voor de wektijd in een warme donkere kamer (ongeveer 25 °C).
- De volgende 2 dagen na transplantatie moet Buprenorfine (0,05 mg/kg lichaamsgewicht) 's ochtends en 's middags worden toegediend via subcutane injectie voor pijnverlichting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het vermogen van staaffotoreceptoren te beoordelen om in het netvlies van de muis te integreren, werd een muisreporterlijn gebruikt, waarbij GFP wordt aangedreven door de neurale retina leucine rits (Nrl, Nrl-GFP) promotor11. Nrl is de vroegste marker van staaffotoreceptoren die zijn expressie op E12.5 gedurende de volwassenheid begint, waardoor een specifieke etikettering van donorstaaffotoreceptorcellen mogelijk is.
PN 4 Nrl-GFP pups werden onthoofd en ogen werden ingekapseld. Retina's werden vervolgens geïsoleerd en gedissocieerd met behulp van de hierboven beschreven methode. De resulterende celsuspensie werd vervolgens gesorteerd met MACS op cd73(figuren 1 en 2). Na mac-sortering analyseerden we de verrijking die tijdens deze procedure werd bereikt.
Zoals weergegeven in figuur 3A, bevatte de initiële celsuspensie (Input) 30,4% GFP-positieve cellen, d.w.z.. staaffotoreceptoren. Na cd73-gebaseerde MAC-sortering werd een verrijking van maximaal 86,9% in de CD73-positieve fractie (CD73+) waargenomen door flowcytometrie. In de CD73-negatieve fractie (CD73-) werd slechts 9,9% van alle cellen positief gedetecteerd voor GFP (figuur 3A). De verrijking van Nrl-GFP-positieve cellen na CD73-gebaseerde MACS wordt bovendien gevisualiseerd na plating in vitro (Figuur 3B).
Na MAC-sortering werden donorcellen in de CD73-positieve fractie afgesplitst en geresuspendeerd tot een eindconcentratie van 200.000 cellen/μl. Deze celsuspensie werd verder gebruikt voor transplantatie in de subretinale ruimte van wild-type gastheer retinas (Figuur 4). Drie tot vier weken na de transplantatie werden de netvliezen van de gastheer gefixeerd, geïsoleerd en doorsneden. Verschillende donorcellen geïntegreerd in de buitenste nucleaire laag van de gastheren en verworven de morfologie van volwassen fotoreceptoren met lokalisatie van het cellichaam in de buitenste nucleaire laag en vorming van synaptische sferules en binnenste segmenten (Figuur 5). Gedetailleerde foto's zijn eerder gepubliceerd door onze groep3,8 met een resultaat vergelijkbaar met FAC-gesorteerde cellen getransplanteerd om netvlies te hosten door andere groepen4,6,10. Consistent in al deze studies is dat de getransplanteerde cellen op de injectieplaats blijven, gedefinieerd door het bulleuze losgemaakte gastheer retina, en niet migreren. Sommige integreren in het netvlies van de gastheer(d.w.z. buitenste nucleaire laag), en sommige blijven in de subretinale ruimte3. Bovendien is aangetoond dat de verdeling van donorcellen op de plaats van integratie afhangt van het type muismodel dat wordt gebruikt5. Er werden geen acute gastheer/transplantaatafstotingsverschijnselen waargenomen bij transplantaties tussen C57BL/6J muizen.
Figuur 1. Algemeen schema van subretinale transplantatie van MACS gezuiverde fotoreceptor precursoren in volwassen muis retina. Donorcellen van PN 4 Nrl-GFP pups worden geïsoleerd, gevolgd door CD73-gebaseerde MAC-sortering en getransplanteerd in de subretinale ruimte van het netvlies van de muisgastheer. Klik hier om grotere figuur te bekijken.
Figuur 2. Verrijking van transplanteerbare fotoreceptoren door MACS. De celsuspensie gegenereerd uit alle verzamelde PN4-retina's wordt geïncubeerd met primaire rat anti-CD73 antilichamen gevolgd door wassen en incubatie met anti-rat antilichamen geconjugeerd met microbeads. Ongebonden antilichamen worden weggespoeld. De celophanging wordt door een LS-kolom gepasseerd die verbonden is met een magnetische standaard. Cellen die gebonden zijn aan antilichamen blijven aan de kolom gehecht terwijl de resterende cellen worden geëuteerd en verzameld (CD73-negatieve fractie). Ten slotte wordt de LS-kolom uit de magnetische standaard verwijderd en worden de resterende cellen geëuteerd en verzameld (CD73-positieve fractie). Klik hier om de volledige film te bekijken.
Figuur 3. Analyse van Nrl-GFP positieve celverrijking na CD73-gebaseerde MAC-sortering. (A) Vóór het sorteren bevatte de initiële populatie donorcellen 30,4% van de Nrl-GFP-positieve cellen. Na MAC-sortering kon een verrijking van GFP-positieve cellen worden gedetecteerd in de CD73+ fractie (86,9%) terwijl de CD73-fractie slechts lage hoeveelheden GFP+ cellen bevatte (9,9%). (B) Representatief beeld dat het resultaat aantoont van cd73-gebaseerde MAC-sortering van PN4 Nrl-GFP-cellen. 1 miljoen cellen uit elke fractie werden geplateerd op laminine-gecoate coverslips. Cellen werden 4 uur na plating met 4% PFA gedurende 10 minuten gefixeerd. Cellen werden gekleurd met DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindole, 1:20.000). Een significante verrijking van GFP-positieve cellen in de CD73+ fractie werd waargenomen in vergelijking met de ingangsfractie of de CD73-fractie. Klik hier om grotere figuur te bekijken.
Figuur 4. Subretinale injectie. Schematische tekening van het transplantatieproces in het volwassen netvlies van de muis. De naald wordt ingebracht door een gat in de ora serrata, navigeert door de vitreale ruimte door het aanraken van de lens te vermijden en wordt onder visuele controle op het netvlies geplaatst. Door zachtjes te duwen wordt de naald door het netvlies geslagen en in de subretinale ruimte geplaatst. Uiteindelijk wordt de celsuspensie zorgvuldig onder visuele controle geïnjecteerd door het ontkoppelingsproces te evalueren.
Figuur 5. Integratie van getransplanteerde fotoreceptorcellen. Representatief beeld dat geïntegreerde CD73-gebaseerde MACS afschildert gesorteerde PN4 Nrl-GFP cellen na transplantatie in het volwassen netvlies van de muis. Getransplanteerde fotoreceptorprecursoren integreren correct in de buitenste nucleaire laag (ONL) en genereren volwassen fotoreceptormorfologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subretinale transplantatie van fotoreceptorprecursorencellen is een betrouwbaar hulpmiddel om deze lichtgevoelige cellen in significante aantallen in het netvlies van de gastheer te integreren1,2. Dit zou de oprichting van een celtherapie voor de behandeling van retinale degeneratieve ziekten in de toekomst mogelijk kunnen maken6. De donorpopulatie van cellen, momenteel geïsoleerd van PN 4 retinas, is een mengsel van verschillende celtypen, waaruit alleen de fotoreceptorprecursorcellen integreren na subretinale injectie. Door cd73-gebaseerde MAC-sortering te gebruiken, kan het aandeel fotoreceptoren binnen de suspensie van de donorcel worden verhoogd tot ≈ 90% die een ongeveer 3-voudig hogere integratiesnelheid in wild-type gastheer retinas mogelijk maakt in vergelijking met de ongesorteerde celpopulatie8. In vergelijking met flowcytometrie heeft MACS het voordeel van een snelle sorteerprocedure en dat het relatief eenvoudig kan worden toegepast op GMP-normen. De zuivering van transplanteerbare fotoreceptoren is van specifiek belang in het licht van recente voordelen voor de in vitro generatie van fotoreceptoren uit pluripotente stamcellen12-14. Culturen van gedifferentieerde pluripotente stamcellen bestaan uit verschillende celtypen, waardoor de beschikbaarheid van specifieke sorteerprocedures een essentiële voorwaarde is voor hun toekomstige gebruik in celtransplantatietherapieën.
Volgens de MACS-zuiveringsprocedure zijn verschillende punten opmerkelijk, waardoor een workflow zonder grote verstoringen wordt gegarandeerd. Hoe hoger het aantal netvliezen dat moet worden gesorteerd, hoe meer tijd er nodig is voor hun spijsvertering. Na de spijsvertering, tijdens de sorteerprocedure, moet aggregatie van cellen worden vermeden. Dit gebeurt bij voorkeur vóór toevoeging van het secundaire antilichaam en tijdens de incubatie ervan. In dit geval moet het aggregaat onmiddellijk met een pipet worden verwijderd. Tijdens het elutie van de MACS-buffer tijdens het verzamelen van de MACS-negatieve fractie, is het absoluut noodzakelijk om niet meer dan 3 ml aan de kolom toe te voegen. De druk van de buffer op de kolom zal te hoog zijn als er meer buffer dan 3 ml wordt toegevoegd. Dit verstoort de binding van het antilichaam aan de cellen en verlaagt de sorteerefficiëntie. Bij het verwijderen van de kolom uit de magnetische standaard om te beginnen met het verzamelen van de MACS-positieve fractie, moet deze stap snel worden uitgevoerd. De 5 ml MACS-buffer moet zo snel mogelijk aan de kolom worden toegevoegd. Ook moet de duik snel worden gezet en ingedrukt totdat de hele buffer door de kolom is. Het is niet nodig om u zorgen te maken over de uitgeoefende druk. De MACS buffer is isotone en kan worden gevarieerd. Het is mogelijk om FACS-buffer, celkweekmedium, PBS, EBSS of HBSS te gebruiken. Steriliteit van de buffer kan worden bereikt door te filteren door een filtermembraan van 0,4 μm.
Na verrijking door MACS kan een succesvolle transplantatie van donorcellen naar de subretinale ruimte worden bereikt door de volgende punten in gedachten te houden. Aangezien fotoreceptorcellen zeer gevoelig lijken te zijn voor behandeling ex vivo, is het niet raadzaam om ze langer dan nodig op 4 °C te houden. Ga zo snel mogelijk over tot transplantatie. Bij het inbrengen van de injectienaald in de oogbol is het belangrijk om de lens niet aan te raken, omdat de relatief scherpe metalen naald de lens kan beschadigen, wat resulteert in inductie van lensgeïnduceerde uveïtis. De laatste stap op weg naar de subretinale ruimte, de penetratie van het netvlies, is cruciaal. Omdat het niet visueel kan worden waargenomen of de subretinale ruimte wordt bereikt, is het belangrijk om een gevoel te ontwikkelen voor de juiste drukdruk en weefselweerstand. Om te testen, als de naaldkop correct is geplaatst, kan een klein volume worden aangebracht en moet de loslating van het netvlies aan de naaldkop zorgvuldig worden waargenomen. Als zich een ronde, bulleuze onthechting zonder bloeding vormt, is de positie correct en kan de rest van de oplossing zorgvuldig worden aangebracht. Tijdens de injectie moet de naald in zijn positie blijven om verdere schade aan het weefsel te voorkomen. Het netvliesgat dat door de injectienaald wordt gecreëerd, wordt vanzelf afdicht als de naald langzaam wordt ingetrokken. De hele procedure moet zo min mogelijk tijd worden uitgevoerd om verdere stress en schade aan het dier te voorkomen. Tijdens de transplantatie heeft de celsuspensie de neiging om de microliterspuit samen te klonteren en te blokkeren. Als dit gebeurt, wordt een verdunning van de celsuspensie met steriel PBS of HBSS voorgesteld. Een andere mogelijkheid om dit probleem op te lossen is om 1 μl DNAse I toe te voegen aan de celsuspensie, om DNA-klonten uit dode cellen op te lossen, die de neiging hebben om levende cellen aan elkaar te lijmen.
Dit protocol is beperkt tot het magnetisch sorteren van cellen. Daarom kunnen de cellen worden gesorteerd voor slechts één markering per sorteerronde. In vergelijking met flowcytometrie, waarbij cellen tegelijkertijd kunnen worden gesorteerd met behulp van verschillende markers (inclusief fysiologische eigenschappen en verschillende celoppervlakmarkers), is dit een groot nadeel van deze techniek. Wanneer het sorteren op verschillende markers in een kort tijdsbestek nodig is, is flowcytometrie misschien de betere oplossing. Ook is sorteren op fluorescerende eigenschappen van cellen, zoals transgenisch uitgedrukte GFP of andere levenscelmarkers, niet mogelijk met deze techniek. Het is momenteel beperkt tot het gebruik van celoppervlakantistoffen die kunnen worden geconjugeerd met magnetische kralen. Deze techniek kan echter worden opgeschaald op basis van de gebruikte technische apparatuur.
Aangezien Miltenyi Biotec momenteel de enige leverancier is van magnetische celsorteergereedschappen, is er tot op heden geen alternatief beschikbaar. Voor celdissociatie kunnen andere enzymen dan papaïne(d.w.z. trypsine) worden gebruikt. Opmerkelijk is dat ons lab de beste resultaten behaalde met papaïne, omdat dit het meest zachte dissociatie-enzym in onze handen lijkt te zijn. Het tijdvenster van papaïnevertering (30-60 min) is variabel. In dit tijdvenster werd een optimale spijsvertering bereikt in ons lab. Afhankelijk van de grootte van het monster, de kwaliteit van het monster en het gebruikte enzym kan een kortere of langere incubatietijd nodig zijn. Individuele tests worden voorgesteld.
Aangezien MACS in één stap niet zo hoog is als flowcytometrie, kan een mogelijke verdere toepassing van deze techniek een negatieve sortering van ongewenste en potentiële schadelijke cellen zijn. Daar kan de celfractie positief voor een bepaalde celoppervlakmarker, maar niet van belang, worden opgelost, waardoor de fractie van belang geïsoleerd blijft in de stroom erdoorheen. Dit kan van tevoren of na een positieve sorteerstap worden gedaan en maakt het mogelijk om cellen verder te onderscheiden met behulp van verschillende celoppervlakmarkers en ongewenste cellen te verwijderen, zoals feederlaagcellen of ongedifferentieerde cellen uit pluripotente stamcelculturen met hun potentiële tumorgene risico. Daarom kan MACS geschikt zijn voor de zuivering van fotoreceptoren uit ES- of iPS-celculturen in mogelijke toekomstige therapeutische toepassingen, omdat het een zachte, snelle en eenvoudige behandeling vertegenwoordigt voor de zuivering van grote hoeveelheden gekweekte cellen. MACS kan gemakkelijk worden toegepast op GMP-omstandigheden, omdat de details van sorteerstappen, d.w.z. mechanica, vloeistoffen en procedures, worden verminderd in vergelijking met flowcytometrie. Het is opmerkelijk dat MACS al routinematig wordt gebruikt in klinische onderzoeken voor de verrijking van cellen uit bloed of beenmerg. Interessant is dat MACS zelfs op cellen kan worden aangebracht wanneer er geen geschikte celoppervlakmarkering aanwezig is, door genetisch een oppervlaktemarkering in te voeren om cellen "competent" te maken voor volgende magnetische celsorteerstappen15.
Kortom, MACS is een betrouwbaar en snel hulpmiddel om fotoreceptorprecursorcellen te verrijken met behulp van celoppervlakmarkers voor transplantatiestudies. Bovendien is het een gemakkelijk te gebruiken methode voor toekomstige klinische toepassingen die GMP-condities vereisen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
We willen Anand Swaroop bedanken voor het leveren van Nrl-GFP muizen, Jochen Haas voor technische ondersteuning en Sindy Böhme en Emely Lessmann voor de veeteelt.
Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, het CRTD Seed Grant Program, de SFB 655 en de ProRetina e.V. stichting, het DIGS-BB Graduate Program Dresden en het Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| Purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5 mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamine 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University Clinics Dresden Pharmacy | ||
| Preseparation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Fire polish glass Pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15 ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | |
| Sterile 15 ml tubes | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| 1.5 ml Reaction tube | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml Reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton microliter syringe 5 µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle 34 G | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12 mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - 5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Forceps - Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Diamond pen | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Cover slips | Sparks | MIC3366 |
References
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
