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Biology

इमेजिंग सेल झिल्ली चोट और मरम्मत में शामिल Subcellular प्रक्रियाओं

Published: March 24, 2014 doi: 10.3791/51106
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Center for Genetic Medicine Research, Children's National Medical Center, 2Department of Integrative Systems Biology, George Washington University
* These authors contributed equally

Summary

चिकित्सा घायल कोशिकाओं की प्रक्रिया कोशिका झिल्ली चोट की साइट के लिए विशिष्ट प्रोटीन और subcellular डिब्बों की तस्करी शामिल है. इस प्रोटोकॉल इन प्रक्रियाओं की निगरानी के लिए assays का वर्णन है.

Abstract

चंगा करने के लिए घायल कोशिकाओं की क्षमता एक मौलिक सेलुलर प्रक्रिया है, लेकिन चिकित्सा घायल कोशिकाओं में शामिल सेलुलर और आणविक तंत्र खराब समझ रहे हैं. यहाँ assays स्थानीय चोट के बाद संवर्धित कोशिकाओं के उपचार की क्षमता और कैनेटीक्स नजर रखने के लिए वर्णित हैं. पहले प्रोटोकॉल एक साथ कोशिकाओं के सैकड़ों की कोशिका झिल्ली की मरम्मत की क्षमता का आकलन करने के लिए एक अंत बिंदु आधारित दृष्टिकोण का वर्णन करता है. दूसरा प्रोटोकॉल एक स्पंदित लेजर के साथ स्थानीय चोट के बाद व्यक्ति की कोशिकाओं में कोशिका झिल्ली की मरम्मत के कैनेटीक्स नजर रखने के लिए एक वास्तविक समय इमेजिंग दृष्टिकोण का वर्णन करता है. चिकित्सा घायल कोशिकाओं को चोट की साइट के लिए विशिष्ट प्रोटीन और subcellular डिब्बों की तस्करी शामिल है, तीसरे प्रोटोकॉल एक साथ घायल कोशिकाओं के सैकड़ों की संख्या में ऐसे ही एक अवैध व्यापार घटना (lysosomal एक्सोसाइटोसिस) का आकलन करने के लिए ऊपर अंत बिंदु आधारित दृष्टिकोण का उपयोग और पिछले प्रोटोकॉल का वर्णन TIRF माइक्रो के साथ एक साथ स्पंदित लेजर चोट के उपयोग का वर्णनउच्च स्थानिक और अस्थायी समाधान पर घायल कोशिकाओं में व्यक्तिगत subcellular डिब्बों की गतिशीलता की निगरानी करने के लिए प्रतिलिपि. यहाँ प्रोटोकॉल कोशिका झिल्ली की मरम्मत और सुसंस्कृत मांसपेशियों की कोशिकाओं में lysosomal एक्सोसाइटोसिस के बीच की कड़ी का अध्ययन करने के लिए इन तरीकों का उपयोग का वर्णन है, वे किसी भी अन्य पक्षपाती सभ्य सेल और चुनाव के subcellular कम्पार्टमेंट के लिए इस तरह के रूप में लागू किया जा सकता है.

Introduction

कोशिका झिल्ली सेल और बाह्य वातावरण के बीच एक बाधा प्रदान करके कोशिकाओं की अखंडता को बनाए रखता है. सामान्य शारीरिक सीमा के साथ ही रोगजनकों हमलावर की मौजूदगी से अधिक है, रासायनिक विद्युत, यांत्रिक या प्रोत्साहन कोशिका झिल्ली को चोट में प्रत्येक परिणाम और इस चोट की मरम्मत के लिए बाद में एक सेलुलर प्रतिक्रिया ट्रिगर कर सकते हैं. कोशिका झिल्ली को इन चोटों के जीवित रहने के लिए, कोशिकाओं की मरम्मत के लिए एक कुशल व्यवस्था के अधिकारी. इस तंत्र कैल्शियम निर्भर है और अन्य लोगों के बीच इस तरह के annexins और MG53 के रूप में प्रोटीन के intracellular तस्करी के साथ ही घायल कोशिका झिल्ली 1-7 करने endosomes, लाइसोसोम, Golgi व्युत्पन्न vesicles और mitochondria के रूप में subcellular डिब्बों शामिल है. हालांकि, क्षतिग्रस्त कोशिका झिल्ली की मरम्मत में शामिल आणविक और subcellular घटनाओं के अनुक्रम का विवरण समझ खराब रहता है.

सेल की मरम्मत प्रतिक्रिया कान में अलग किया जा सकता हैभंडारण और देर के हिमायती हैं. मिनट समय के पैमाने को सेकंड के भीतर हो जो जल्दी प्रतिक्रिया, सफल, सेल की मरम्मत या कोशिका मृत्यु के लिए अग्रणी देर प्रतिक्रियाओं की प्रकृति का निर्धारण करने में काफी महत्वपूर्ण हैं. थोक जैव रासायनिक और सेलुलर विश्लेषण पर आधारित अंत बिंदु assays मरम्मत में आणविक और सेलुलर प्रक्रियाओं की भागीदारी की स्थापना में मदद की है. लेकिन, के कारण सेलुलर मरम्मत प्रतिक्रिया की विविधता और तेज़ी के लिए, अंत बिंदु assays में सुधार करने के लिए प्रमुख घटनाओं के अनुक्रम की गतिज और स्थानिक विवरण उपलब्ध कराने में विफल. कोशिका झिल्ली की नियंत्रित चोट सक्षम और कोशिका झिल्ली की मरम्मत और उच्च स्थानिक और अस्थायी समाधान पर एसोसिएटेड subcellular प्रतिक्रियाओं की निगरानी की अनुमति दृष्टिकोण है कि आदर्श रूप में इस तरह के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं. इधर, इस तरह के दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है. प्रोटोकॉल के दो लेजर inj निम्नलिखित कोशिका झिल्ली की मरम्मत की वास्तविक समय कैनेटीक्स और जीवित कोशिकाओं में सुधार प्रक्रिया के साथ जुड़े subcellular प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने के तरीकों का वर्णनUry. इन लाइव सेल इमेजिंग आधारित assays के लिए एक पूरक के रूप में, अंत बिंदु assays भी व्यक्ति की कोशिकाओं और जुड़े subcellular प्रतिक्रियाओं की निगरानी की मरम्मत के लिए एक जनसंख्या आधारित उपाय प्रदान कि वर्णित किया गया है. इन तरीकों कोशिका झिल्ली चोट के जवाब में तस्करी और लाइसोसोम के एक्सोसाइटोसिस नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है उनके उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए.

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Protocol

1. इमेजिंग सेल झिल्ली की मरम्मत थोक का उपयोग करना (ग्लास मनका) घायल हो गए

इस प्रोटोकॉल अलग से घायल कोशिकाओं और चंगा करने में विफल है कि उन अंकन की अनुमति देता है. कोशिकाओं की इन आबादियों बढ़ाता तीन शर्तों का उपयोग आवश्यक है: 1. टेस्ट (सी 1) - प्रकोष्ठों सीए 2 +, 2 की उपस्थिति में सुधार करने के लिए अनुमति दी जाती है. नियंत्रण 1 (कोई चोट सी 2) - प्रकोष्ठों सीए 2 + की उपस्थिति में incubated, लेकिन घायल नहीं, और 3 रहे हैं. नियंत्रण 2 (कोई मरम्मत C3) - कोशिकाओं सीए 2 + के अभाव में मरम्मत के लिए अनुमति दी जाती है.

  1. तीन बाँझ coverslips पर> 50% संगम को कोशिकाओं के विकास और सिलिकॉन O-अंगूठी पर 37 डिग्री सेल्सियस और हस्तांतरण coverslips पर पीबीएस के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और C3 पर यूके के साथ दो बार सी 1 और सी 2 धो लो.
  2. सी 1 और सी 2 पर या पीबीएस में C3 पर यूके में prewarmed FITC dextran समाधान के 100 μl जोड़ें.
  3. धीरे वापस मैन्युअल रूप से झुकने coverslips से कमरे के तापमान पर coverslip से अधिक 40 मिलीग्राम कांच के मोती रोलिंग और से सी 1 और सी 3 पर प्लाज्मा झिल्ली घायल30 डिग्री के कोण पर आगे 6-8 बार.
    नोट: हल्के चोट के लिए, इस प्रकार दोहराने चोटों को कम करने, कांच के मोती समान रूप से फैला रहे हैं सुनिश्चित करते हैं. नमूनों के बीच चोट के reproducibility में सुधार करने के लिए, एक साथ तुलना किए जाने वाले विभिन्न नमूनों के गिलास मनका चोट बाहर ले.
  4. मोती के आगे रोलिंग से बचना, परिवेश सीओ 2 पर एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए सभी coverslips हस्तांतरण और मरम्मत 5 मिनट के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं.
  5. मोती रोल देने के बिना, 37 डिग्री सेल्सियस पर यूके (सी 1 और सी 2) या पीबीएस (C3) के साथ धोने से कांच के मोती और FITC dextran हटाने
  6. जगह ओ अंगूठी पर वापस coverslips और सी 1 और सी 2 पर या पीबीएस में C3 पर यूके में prewarmed लाइसिन फिक्स TRITC dextran समाधान के 100 μl जोड़ें.
  7. परिवेश सीओ 2 पर 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  8. Prewarmed यूके के साथ दो बार coverslips धोने और आरटी पर 10 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​के साथ तय कर लो.
  9. पीबीएस के साथ दो बार धोने और Hoechst डाई में आरटी पर 2 मिनट के लिए सेते हैं.
  10. धो कॉम्पैक्टतों दो बार पीबीएस के साथ, एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग बढ़ते मीडिया और छवि कोशिकाओं का उपयोग कर एक स्लाइड पर माउंट.
  11. पृष्ठभूमि लाल और हरे रंग धुंधला तीव्रता का निर्धारण और सभी नमूनों (C1-C3) के लिए सीमा लाल और हरे रंग चैनलों के लिए यह मान का उपयोग करने के लिए सी 2 से कोशिकाओं का उपयोग करें.
  12. एक) ग्रीन (घायल हो गए और मरम्मत) और बी) लाल या लाल और हरे रंग (घायल दोनों, लेकिन सी 1 और सी 3 नमूने में) में सुधार करने में विफल रहे हैं कि कोशिकाओं की कुल संख्या स्कोर.
  13. गणना> 100 साग हर हालत के लिए और घायल सभी कोशिकाओं (हरे और लाल) के एक प्रतिशत के रूप में सुधार करने में विफल रहा है कि कोशिकाओं के अंश व्यक्त कोशिकाओं.

2. लेजर चोट के बाद सेल झिल्ली की मरम्मत की काइनेटिक्स की लाइव इमेजिंग

  1. Prewarmed यूके के साथ कोशिकाओं को धो लें और फिर एफएम डाई के साथ यूके में coverslip डाल दिया.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा चरण शीर्ष इनक्यूबेटर में एक धारक में coverslip जगह
  3. कोशिका झिल्ली का एक 1-2 मिमी 2 क्षेत्र का चयन करें, और के लिए चमकाना <; स्पंदित लेजर के साथ 10 मिसे. सत्ता के शिखर 40-50% करने के लिए सॉफ्टवेयर के माध्यम से लेजर शक्ति attenuate. इष्टतम बिजली संगत, लेकिन nonlethal चोट की अनुमति देता है और यह प्रयोग किया जा रहा प्रत्येक व्यक्ति के साधन और सेल लाइन के लिए परीक्षण और त्रुटि के द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए.
  4. पूर्व चोट करने के लिए शुरू, epifluorescence और brightfield में मरम्मत, छवि हर 10 सेकंड पर नजर रखने और चोट के बाद 3-5 मिनट के लिए जारी रखने के लिए.
    नोट: कोई मरम्मत नियंत्रण के लिए, दोहराने पीबीएस में घायल कोशिकाओं एफएम डाई को रोकने के साथ 2.1-2.4 कदम.
  5. मरम्मत के कैनेटीक्स यों, सेलुलर एफएम डाई प्रतिदीप्ति उपाय और इमेजिंग के दौरान तीव्रता (ΔF/F0) में परिवर्तन साजिश है. इस डेटा हर हालत में 10 से अधिक कोशिकाओं के लिए औसत और जरूरत के रूप में, औसतन या व्यक्तिगत सेल के मूल्य के रूप में प्लॉट किया जाना चाहिए.

3. इमेजिंग थोक (ग्लास मनका) चोट प्रेरित Lysosomal एक्सोसाइटोसिस

नमूने> 50% की वृद्धि हुई निम्नलिखित कोशिकाओं में शामिलसंगम: 1. टेस्ट (सी 1) - सीए 2 +, 2 की उपस्थिति में सुधार करने के लिए अनुमति दी कोशिकाओं. नियंत्रण 1 (सी 2; कोई चोट) - प्रकोष्ठों घायल और न ही प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ incubated, और 3 भी नहीं. नियंत्रण 2 (सी 3, कोई मरम्मत) - सीए 2 + की अनुपस्थिति में सुधार करने के लिए अनुमति दी कोशिकाओं.

  1. धो 37 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और C3 पर यूके के साथ दो बार सी 1 और सी 2 coverslips और सिलिकॉन O-अंगूठी पर उन्हें स्थानांतरण.
  2. C3 पर सी 1 और सी 2 पर यूके में और पीबीएस में prewarmed लाइसिन फिक्स TRITC dextran के 100 μl जोड़ें.
  3. 1.3 चरण में के रूप में सी 1 और सी 3 पर प्लाज्मा झिल्ली घायल.
  4. मोती के आगे रोलिंग से बचना, परिवेश सीओ 2 पर एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए सभी coverslips हस्तांतरण और मरम्मत 5 मिनट के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं.
  5. फिर कोशिकाओं पर कांच के मोती की कोई रोलिंग सुनिश्चित करने, ठंड मध्यम विकास में coverslips धोने से कांच के मोती और TRITC dextran निकालें.
  6. ठंड मध्यम विकास के साथ दो बार coverslips कुल्ला और O-अंगूठी के लिए स्थानांतरण.
  7. C1 और C3 के, ठंड पूर्ण विकास मीडिया में चूहा विरोधी माउस LAMP1 एंटीबॉडी के 100 μl जोड़ने और सी 2 के लिए ठंड, पूर्ण विकास मीडिया जोड़ें.
  8. एंटीबॉडी 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते coverslips बाध्यकारी अनुमति देने के लिए
  9. ठंड यूके के साथ coverslips तीन बार धोएं और आरटी पर 10 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​के साथ सभी coverslips को ठीक करने और उसके बाद यूके के साथ 3x कुल्ला.
  10. आरटी पर 15 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान के 100 μl में सभी coverslips सेते
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर एलेक्सा Fluor 100 μl में 15 मिनट के लिए 488 विरोधी चूहा एंटीबॉडी सभी coverslips सेते
  12. पीबीएस के साथ दो बार धोने और Hoechst में आरटी पर 2 मिनट के लिए सेते हैं.
  13. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं, एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग बढ़ते मीडिया और छवि का उपयोग करते हुए एक स्लाइड पर माउंट.
  14. सी 2 कोशिकाओं की छवियों का उपयोग करना, अविशिष्ट पृष्ठभूमि लाल रंग में धुंधला (TRITC dextran) और हरी (एलेक्सा Fluor 488 एंटीबॉडी) चैनलों का निर्धारण और सभी नमूनों (C1-C3) के लिए लाल और हरे चैनल दहलीज को इन पृष्ठभूमि धुंधला मूल्यों का उपयोग करें. </ ली>
  15. घायल कोशिकाओं में LAMP1 धुंधला (हरा) की तीव्रता को मापने के लिए सी 1 और सी 3 से> 100 लाल लेबल की कोशिकाओं का उपयोग करें. एक सफल प्रयोग के लिए C3 से कोशिकाओं में LAMP1 धुंधला सी 1 से कोशिकाओं की तुलना में काफी कम हो जाएगा.

4. सेल झिल्ली चोट के रहते इमेजिंग Subcellular तस्करी उत्प्रेरित

  1. Fluorescently लेबल (लाइसोसोम 8 जैसे CD63-GFP) या फ्लोरोसेंट रंगों 9 का उपयोग करके उचित संवाददाता transfecting द्वारा ब्याज के डिब्बे.
  2. फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबलिंग लाइसोसोम के लिए, FITC-dextran युक्त विकास मीडिया में 50% संगम को विकसित कोशिकाओं सेते
  3. सीओ 2 इनक्यूबेटर में (ब्याज की सेल लाइन से dextran के साथ पर्याप्त endosomal लेबलिंग के लिए जरूरत के रूप में या लंबे समय तक) dextran 2 घंटे के लिए endocytosed होने की अनुमति.
  4. अनुमति देने के लिए prewarmed विकास मीडिया के साथ कोशिकाओं को धो लें और सीओ 2 इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए उस में सेते सभीलाइसोसोम में जमा करने के लिए dextran endocytosed.
  5. इमेजिंग से पहले, prewarmed यूके में coverslip कुल्ला और 37 डिग्री सेल्सियस पर चरण शीर्ष इनक्यूबेटर पर एक coverslip धारक में माउंट
  6. (सेल भर में आंदोलन के लिए) widefield या TIRF (कोशिका की सतह और एक्सोसाइटोसिस पर आंदोलन) इमेजिंग के लिए बाहर ले - FITC dextran भीड़ नहीं है जो कोशिकाओं लेबल लाइसोसोम व्यक्ति लाइसोसोम के आंदोलन और एक्सोसाइटोसिस इमेजिंग के लिए आदर्श होते हैं.
  7. इमेजिंग खुर्दबीन के लिए TIRF लेज़रों संरेखित: उपयोग 60X या> 1.45 एनए के साथ 100X उद्देश्य. निर्माता के दृष्टिकोण का उपयोग कर घटना TIRF लेजर बीम के लिए कोण सेट अप करें.
  8. 40-50% क्षीणन में स्पंदित लेजर के साथ, <100 मिसे के लिए एक छोटे (1-2 मिमी 2) क्षेत्र irradiating द्वारा कोशिका झिल्ली को चोट पहुंचाना.
  9. ब्याज की कोशिकाओं में एक्सोसाइटोसिस की गतिशीलता के आधार पर कम से कम 2 मिनट या उससे अधिक समय के लिए 4-6 फ्रेम / सेकंड में चोट, छवि कोशिकाओं सेल को lysosome की प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए.

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Representative Results

एकल कक्ष इमेजिंग के लिए यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल क्षमता और कैनेटीक्स कोशिका झिल्ली की मरम्मत की (प्रोटोकॉल 1 और 2) और मरम्मत के दौरान subcellular तस्करी और लाइसोसोम के विलय पर नजर रखने के लिए कर रहे हैं (प्रोटोकॉल 3 और 4).

प्रोटोकॉल 1 सभी घायल कोशिकाओं अंकन और सुधार करने में विफल रहा है कि उन घायल कोशिकाओं की पहचान करने की अनुमति देता है कि एक थोक परख से पता चलता है. रिहाई कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) unlabeled रहते हैं, FITC dextran की उपस्थिति में ग्लास मनका से घायल कोशिकाओं (आंकड़े 1 बी और 1 सी) ग्रीन लेबल रहे हैं कि चित्रा 1 शो में परिणाम है. कोशिकाओं सीए की उपस्थिति में सुधार करने के लिए अनुमति दी जाती है जब 2 घायल (हरा) कोशिकाओं के अधिकांश में सुधार करने के लिए प्रबंधन और TRITC dextran (चित्रा 1 बी) से (लाल) के रूप में चिह्नित नहीं कर रहे हैं. कोशिकाओं सीए 2 + के अभाव में मरम्मत के लिए अनुमति दी जाती है, घायल कोशिकाओं के अधिकांश भी TRITC dextran (फाई द्वारा लाल चिह्नित कर रहे हैंgure -1 सी). घायल कभी नहीं थे कि कोशिकाओं TRITC dextran के साथ किसी भी लेबलिंग नहीं दिखाते. इस प्रकार, डबल (लाल और हरा) लेबल कोशिकाओं की संख्या में विफल रहा है कि कोशिकाओं का एक उपाय प्रदान करता है बढ़ाता है, जबकि केवल लेबल हरे, कांच के मनकों से घायल हो गए और मरम्मत की गई है कि कोशिकाओं का एक उपाय प्रदान करता है कोशिकाओं की संख्या बढ़ाता किसी भी नमूने में चोट से मरम्मत करने के लिए.

प्रोटोकॉल 2 सेल में एफएम डाई की प्रविष्टि की निगरानी के द्वारा कोशिका झिल्ली की मरम्मत के कैनेटीक्स का आकलन करने का वर्णन करता है. एफएम डाई में incubated, अक्षत कोशिकाओं (चोट WF पैनल से पहले 2A चित्रा) कोशिका झिल्ली धुंधला दिखा. कोशिका झिल्ली के स्थानीयकृत लेजर चोट के बाद एफएम डाई सेल में प्रवेश करने और एफएम डाई प्रतिदीप्ति (चित्रा 2 बी) में अचानक वृद्धि का कारण बनता है जो endomembranes, बंधन शुरू होता है. निम्नलिखित लेजर चोट की मरम्मत के लिए कोशिका झिल्ली की क्षमता के रूप में सीए 2 +, सीए 2 + की उपस्थिति में घायल एक सेल पर निर्भर है अटल हैLe एफएम डाई प्रविष्टि का कारण बनता है, जो मरम्मत (और इसलिए सेलुलर एफएम डाई प्रतिदीप्ति में वृद्धि) की चोट के बाद एक मिनट के भीतर बंद करने के लिए (चित्रा 2A, ऊपरी पैनल, चित्रा 2 बी, नीली रेखा, और वीडियो 1 और चित्रा 2 एनिमेटेड) के लिए. इसके विपरीत, सीए 2 + की अनुपस्थिति में सुधार करने के लिए अनुमति दी एक सेल, इसलिए एफएम डाई प्रतिदीप्ति में निरंतर वृद्धि निरंतर डाई प्रविष्टि में यह परिणाम है और जो मरम्मत करने में विफल रहता भी 4 मिनट चोट (चित्रा 2A के बाद, कम पैनल, चित्रा 2B, लाल रेखा और) वीडियो 2 और चित्रा 2 एनिमेटेड. कोशिका झिल्ली मरम्मत के अभाव पठार में विफल रहता है कि निरंतर डाई प्रविष्टि का कारण बनता है, जबकि इस प्रकार, कोशिका झिल्ली की मरम्मत, एफएम डाई धुंधला का एक plateauing की ओर जाता है.

प्रोटोकॉल 3 चोट के जवाब में vesicles और प्रोटीन की कोशिका की सतह स्थानान्तरण की निगरानी के लिए थोक (ग्लास मनका) चोट दृष्टिकोण के उपयोग का वर्णन करता है. यहाँ वेंरिहाई कोशिकाओं (चित्रा 3) लाल लेबल नहीं हैं, जबकि ई कोशिकाओं, इस प्रकार TRITC dextran की उपस्थिति में घायल हो गए हैं, लेकिन सभी घायल कोशिकाओं (आंकड़े 3B और 3 सी) लाल चिह्नित कर रहे हैं. कोशिका की सतह LAMP1 (चित्रा 3A LAMP1 पैनल) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी शो पृष्ठभूमि स्तर लेबलिंग के साथ इलाज नहीं कर रहे हैं कि रिहाई कोशिकाओं. कोशिकाओं घायल और कैल्शियम की मौजूदगी में चंगा करने के लिए अनुमति दी जाती है लेकिन, जब, लाइसोसोम एक्सोसाइटोसिस से गुजरना है और इस तरह घायल (लाल लेबल) कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) की सतह पर LAMP1 धुंधला के स्तर में वृद्धि होती है. कोशिका की सतह LAMP1 लेबलिंग में यह वृद्धि कैल्शियम की अनुपस्थिति (चित्रा -3 सी) में चंगा करने के लिए अनुमति दी जाती है कि कोशिकाओं में बहुत कम है. यह कैल्शियम विनियमित lysosomal एक्सोसाइटोसिस की प्रकृति और इसलिए LAMP1 की सतह उपस्थिति को दर्शाता है. इस प्रकार दोनों, उच्च कोशिका की सतह LAMP1 धुंधला के साथ कोशिकाओं की संख्या बढ़ाता है और साथ ही स्तर को मापनेव्यक्ति घायल कोशिकाओं पर कोशिका की सतह LAMP1 धुंधला की, चोट lysosomal एक्सोसाइटोसिस चालू होने से गुजरना करने के लिए सेल की क्षमता के लिए उपाय प्रदान करते हैं.

प्रोटोकॉल 4 कोशिका झिल्ली चोट के जवाब में कैनेटीक्स, प्रकृति, और व्यक्तिगत लाइसोसोम संलयन के स्थान की प्रत्यक्ष निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कोशिकाओं लाइसोसोम निगरानी चोट व्यक्ति की कोशिकाओं में लाइसोसोम के एक्सोसाइटोसिस ट्रिगर (चित्रा -4 ए और वीडियो 3 एनिमेटेड). चित्रा -4 ए द्वारा कल्पना (हरे रंग में उल्लिखित) एक सेल से पता चलता है की अनुमति देता है जो TIRF इमेजिंग, ने उतारी रहे स्पंदित लेजर और कोशिका की सतह से घायल हो गए हैं चरण विपरीत इमेजिंग (पैनल बाएं) और पूर्व चोट के TIRF माइक्रोस्कोपी (मध्यम पैनल), से. राइट पैनल की चोट के बाद ही सेल 105 सेकंड के TIRF छवि को दर्शाता है. विभिन्न चोट लाइसोसोम की प्रतिक्रियाओं ट्रिगर आंकड़े में वर्णित हैं 4B-E. 4B चित्रा चोट एक lysosome की भर्ती चालू होने से पता चलता है (चिह्नितएक्सोसाइटोसिस (एनिमेटेड वीडियो 4 और चित्रा 4) के बाद कोशिका झिल्ली को ग्रे वृत्त) से. इस लाइसोसोम प्रायर (4B चित्रा: पैनल -2.5 ओं) चोट के TIRF छवि में दिखाई नहीं देता है, लेकिन चोट के बाद लाइसोसोम कोशिका झिल्ली पर आता है और (चित्रा 4 बी: पैनल 102.5 ओं) पता लगाने योग्य हो जाता है पुटिका के करीब ले जाता है, के रूप में कोशिका झिल्ली यह TIRF रोशनी से बेहतर उत्साहित है और संलयन ताकना lysosomal पीएच के निराकरण के कारण और इस प्रकार FITC dextran प्रतिदीप्ति (चित्रा 4 बी: पैनल 104.8 एस) के dequenching खोलता है lysosomal FITC dextran प्रतिदीप्ति अधिकतम मूल्य तक पहुँचता है. इसके बाद dextran धीरे - धीरे (: पैनल 107.1 एस चित्रा 4 बी) में कमी करने के लिए laterally प्रसार करने के लिए FITC प्रतिदीप्ति के कारण सेल के बाहरी और पुटिका प्रतिदीप्ति को पुटिका से छुट्टी दे दी है. दूसरी श्रेणी में, नारंगी चक्र द्वारा चिह्नित लाइसोसोम (Vid एनिमेटेडपुटिका exocytoses तक पैनल 91 ओं): पैनल -2.5 है), यह झिल्ली (चित्रा 4C पर बनी हुई है: ईओ 5 चित्रा 4) चोट से पहले (चित्रा 4C मौजूद है. संलयन (: 94.5 एस चित्रा 4C) निम्नलिखित पुटिका में कुछ FITC dextran छोड़ने के पीछे: यहाँ लाइसोसोम आंशिक रूप से (पैनल 93 एस चित्रा 4C) exocytosed. vesicles के तीसरे और चौथे श्रेणियों झिल्ली को फ्यूज नहीं है. (ब्लू सर्किल द्वारा चिह्नित) चित्रा 4D में दिखाया लाइसोसोम के लिए और दूर (वीडियो 6 और 4 चित्र एनिमेटेड) कोशिका झिल्ली से अक्षीय रूप से चलता रहता है. इस लाइसोसोम चोट (चित्रा 4D: पैनल -2.5 ओं) से पहले कोशिका झिल्ली में दिखाई नहीं देता है, लेकिन चोट के बाद कोशिका झिल्ली आ पर यह TIRF माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4D: पैनल 59.3 ओं) द्वारा दिखाई हो जाता है. यह कोशिका झिल्ली (चित्रा 4D: पैनल 59.6 ओं) के सबसे करीब पहुंच गया और उसके बाद (चित्रा 4D fusing के बिना दूर ले जाता है: पीANEL 63.7 ओं). चौथी श्रेणी में लाइसोसोम झिल्ली के करीब आता है और. चित्रा 4E (पैनल 8.7 ओं) लाइसोसोम के आने से पता चलता है क्षैतिज कोशिका झिल्ली (वीडियो 7 और 4 चित्र एनिमेटेड चित्रा -4 ए में बैंगनी बॉक्स द्वारा चिह्नित क्षेत्र,) के साथ चलता है , जो तब झिल्ली के साथ चलता है और छवियों के अनुक्रम में देखा जा सकता है चोट पोस्ट (चित्रा 4E: पैनल 10.7, 11.9, 12.8, 18.8 ओं). प्रत्येक लाइसोसोम की FITC dextran प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ाता ऊपर वर्णन के आधार पर - (चित्रा 4E), fusing (आंकड़े 4B और 4C) अक्षीय (चित्रा 4D) चलती है या क्षैतिज आगे बढ़ चोट के लाइसोसोम की प्रतिक्रिया का निर्धारण करने की अनुमति देता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. . ग्लास मनकों द्वारा थोक कोशिका झिल्ली चोट छवियाँ परमाणु धुंधला हो जाना (Hoechst, बाएं पैनल) दिखाने के लिए, चोट (हरे रंग धुंधला - FITC Dextran), मरम्मत रहित कोशिकाओं (लाल धुंधला - TRITC Dextran), और (मर्ज) छवियों विलय कर दिया. कैल्शियम की उपस्थिति में (ए) रिहाई कोशिकाओं, (बी) कैल्शियम के अभाव में कोशिकाओं में कैल्शियम की उपस्थिति में कोशिकाओं घायल हो गए, और (सी) घायल हो गए. स्केल बार 10 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. . (नारंगी में उल्लिखित) कोशिकाओं की लेजर चोट के जवाब में कोशिका झिल्ली की मरम्मत की वास्तविक समय इमेजिंग (ए) छवि चोट [बाएं पैनल से पहले - उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) औरepifluorescence (ईपीआई)], 5 सेकंड, चोट के बाद 1 मिनट, और 4 मिनट. चोट की साइट पर एक सफेद तीर द्वारा संकेत दिया है. ऊपरी पैनल कैल्शियम और कम पैनल की उपस्थिति में घायल एक सेल कैल्शियम के अभाव में घायल एक सेल से पता चलता है दिखाता है. (बी) ग्राफ़ कैल्शियम (नीला) की उपस्थिति में या कैल्शियम (लाल) के अभाव में घायल पैनल में कोशिकाओं के एफएम डाई धुंधला (ΔF/F0) में परिवर्तन दिखा. एफएम डाई प्रवेश करती है और इसलिए प्रतिदीप्ति लेबलिंग वृद्धि हुई जहां क्षेत्र प्रतिदीप्ति तीव्रता की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया था. स्केल बार = 10 माइक्रोन). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. थोक चोट के जवाब में इमेजिंग lysosomal एक्सोसाइटोसिस. छवियाँ परमाणु धुंधला Hoechst (नीला), कोशिका की सतह LAMP1 धुंधला (हरा), TRITC dextran (लाल) दिखाने के लिए और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल नहीं (ए) रिहाई कोशिकाओं के सभी चैनल (ओवरले) का मर्ज, (बी) घायल कोशिकाओं की मरम्मत करने की अनुमति दी कैल्शियम की उपस्थिति में, और (सी) कैल्शियम के अभाव में सुधार करने के लिए अनुमति दी घायल कोशिकाओं. स्केल बार 10 माइक्रोन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. लेजर चोट के जवाब में lysosomal एक्सोसाइटोसिस की वास्तविक समय इमेजिंग. FITC dextran लेबल लाइसोसोम के साथ कोशिकाओं में कैल्शियम की उपस्थिति में एक स्पंदित लेजर से घायल हो गए. (ए) सेल की सीमा है किघायल हो गया था (हरे रंग में) उल्लिखित है: वाम पैनल - उज्ज्वल क्षेत्र चोट से पहले, मध्य पैनल - चोट और सही पैनल से पहले TIRF - चोट के बाद TIRF 105 है. चोट की साइट सियान बॉक्स और इ पैनल में तेजी से बढ़ी कर रहे हैं के भीतर सफेद / बैंगनी रंग के बक्से और रंग हलकों ने संकेत दिया प्रतिनिधि क्षेत्र द्वारा चिह्नित है. पूरे सेल छवि में पुटिका के रंग (ग्रे, नारंगी और नीले रंग की) व्यक्तिगत लाइसोसोम की छवियों में तेजी से बढ़ी में रंग से मेल खाती है. (बी) के बाएं पैनल की चोट के बाद भर्ती एक पुटिका के FITC प्रतिदीप्ति के लिए ΔF/F0 मूल्य के लिए एक साजिश से पता चलता है. राइट पैनल चोट से पहले पुटिका (-2.5 एस), prefusion (102.5 एस), संलयन (104.8) और postfusion (107.1 एस) की फोटो से पता चलता है. (सी) वाम पैनल से पहले चोट को डॉक एक पुटिका के FITC प्रतिदीप्ति के लिए ΔF/F0 मूल्य के लिए एक साजिश से पता चलता है. राइट पैनल चोट से पहले पुटिका (-2.5 एस), prefusion (91 एस), संलयन (93) और postfusion (94.5 ओं) की फोटो से पता चलता है. (<मजबूत> डी) वाम पैनल () की दिशा में और दूर कोशिका झिल्ली से अक्षीय रूप से आगे बढ़ एक पुटिका के FITC प्रतिदीप्ति के लिए ΔF/F0 मूल्य के लिए एक साजिश से पता चलता है. राइट पैनल चोट (-2.5 ओं) से पहले पुटिका के फोटो से पता चलता है, और 59.3, 59.6 और 63.7 है पर झिल्ली के पास अलग स्थिति में चोट के बाद. (8.7, 10.7, 11.9, 12.8 और 18.8 ओं) पर चोट (-2.5 ओं) से पहले और चोट के बाद विभिन्न पदों पर क्षैतिज कोशिका झिल्ली के साथ चले गए कि पुटिका (ई) फोटो. स्केल बार (एक = 10 माइक्रोन, बी, सी, डी, ई = 1 माइक्रोन). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

एनिमेटेड वीडियो 1 चित्रा 2: . कैल्शियम की मौजूदगी में लेजर चोट के जवाब में कोशिका झिल्ली की मरम्मत की वास्तविक समय इमेजिंग (नारंगी में उल्लिखित) एक सेल में एफएम डाई प्रविष्टि स्पंदित से घायलकैल्शियम की मौजूदगी में लेजर. फिल्म में हर 2 सेकंड का अधिग्रहण 200 छवियों का प्रतिनिधित्व करता है. सेल सीमा 4 के बाद (सियान वर्ग द्वारा चिह्नित क्षेत्र) घायल हो गया. समय स्टाम्प घंटा में समय से पता चलता है: मिनट: सेकंड: मिसे प्रारूप. = 10 माइक्रोन स्केल बार.

एनिमेटेड वीडियो 2 चित्रा 2: . कैल्शियम के अभाव में लेजर चोट के जवाब में कोशिका झिल्ली की मरम्मत की वास्तविक समय इमेजिंग कैल्शियम के अभाव में स्पंदित लेजर से घायल हो (ऑरेंज में उल्लिखित) एक सेल में एफएम डाई प्रविष्टि. फिल्म में हर 2 सेकंड का अधिग्रहण 200 छवियों का प्रतिनिधित्व करता है. सेल सीमा 4 के बाद (सियान वर्ग द्वारा चिह्नित क्षेत्र) घायल हो गया. समय स्टाम्प घंटा में समय से पता चलता है: मिनट: सेकंड: मिसे प्रारूप. = 10 माइक्रोन स्केल बार.

एनिमेटेड वीडियो 3 चित्रा 4: lysosomal exocyt की वास्तविक समय इमेजिंगलेजर चोट के जवाब में Osis. एक सेल में लाइसोसोम के अलग प्रतिक्रियाएं स्पंदित लेजर से घायल (हरे, वीडियो 3 में उल्लिखित). फिल्म / सेक 5 तख्ते पर TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत अनुक्रमिक समय चूक छवियों के 2 मिनट का प्रतिनिधित्व करता है. Brightfield छवियों हर 20 सेकंड का अधिग्रहण किया गया. सेल इस वीडियो में 2 सेकंड में (सियान बॉक्स द्वारा इंगित) घायल हो गया. (, ग्रे नारंगी और नीले रंग) रंग हलकों और बैंगनी बॉक्स सेल चोट के बाद उनके विविध भाग्य का प्रदर्शन, चित्रा 4 में वर्णित लाइसोसोम और एनिमेटेड वीडियो 4-7 निशान. समय स्टाम्प घंटा में समय से पता चलता है: मिनट: सेकंड: मिसे प्रारूप. = 10 माइक्रोन स्केल बार.

एनिमेटेड वीडियो 4 चित्रा 4 चोट के जवाब में झिल्ली के लिए भर्ती किया गया है, जो ग्रे वृत्त द्वारा चिह्नित exocytic लाइसोसोम से पता चलता है. इस वीडियो में 7 सेकंड (5 सेकंड पोस्ट चोट) पर लाइसोसोम कोशिका झिल्ली में भर्ती हो जाता हैऔर फिर 1 मिनट और 47 सेकंड में इस साइट पर फ़्यूज़. = 1 मिमी स्केल बार.

एनिमेटेड वीडियो 5 आंकड़ा 4 से पहले इस साइट 1 मिनट और 35 सेकंड पर चोट और फ़्यूज़ करने के लिए झिल्ली पर जुर्माना लगाया गया है जो नारंगी चक्र द्वारा चिह्नित exocytic लाइसोसोम से पता चलता है. = 1 मिमी स्केल बार.

एनिमेटेड वीडियो 6 आंकड़ा 4 ब्लू सर्किल द्वारा चिह्नित लाइसोसोम दूर कोशिका झिल्ली से फिर की ओर बढ़ रहा है और पता चलता है. = 1 मिमी स्केल बार.

एनिमेटेड वीडियो 7 आंकड़ा 4 लाइसोसोम की चोट एक के बाद जहां वीडियो 3 में बैंगनी बॉक्स द्वारा चिह्नित सेल का एक क्षेत्र से पता चलता है (सफेद वृत्त) अल चालेंकोशिका झिल्ली ओंग. = 1 मिमी स्केल बार.

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Discussion

विवो में कोशिका झिल्ली की चोट के कारण एक शारीरिक तनाव की विविधता और कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोण इन नकल करने के लिए विकसित किया गया है करने के लिए होता है. ये पकवान उन्हें बंद scraping द्वारा या एक संकीर्ण बोर सिरिंज 9,10 के माध्यम से passaging द्वारा पक्षपाती कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली को घायल कर शामिल हैं. इस तरह की चोटों के बाद कोशिकाओं को निलंबन में ठीक है और वे सामान्य रूप से ऊतक में कर के रूप में बाह्य मैट्रिक्स का पालन नहीं. ऐसे ताकना बनाने विषाक्त पदार्थों के उपयोग के रूप में अभी भी दूसरों को, रासायनिक ऐसे कोलेस्ट्रॉल के रूप में निकालने लिपिड द्वारा कोशिका झिल्ली में परिवर्तन, इस प्रकार विवो यांत्रिक चोटों 5 में नकल उतार नहीं. इस प्रकार, सेल चोट के लिए इस्तेमाल किया विधि मरम्मत प्रतिक्रिया के बारे में सीखा जा सकता है क्या प्रभावित कर सकते हैं. यह सेल चोट परख के चुनाव में न केवल सावधानी व्यायाम, लेकिन यह भी बेहतर vivo में यांत्रिक चोटों कि नकल दृष्टिकोण चुनने जरूरी है. इस तरह के दृष्टिकोण कोशिकाओं की एक monolayer घायल हो गए हैं, जहां खरोंच चोट (शामिलएक छुरी या सुई) और कांच के मोती चोट (चोट पालन कोशिकाओं पर रोलिंग ग्लास मनकों के कारण होता है जहाँ) द्वारा. इन तरीकों में अच्छी तरह से सामूहिक रूप से कोशिकाओं को घायल के लिए अनुकूल है, लेकिन कोशिका झिल्ली की मरम्मत की प्रक्रिया की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए उत्तरदायी नहीं हैं. प्रभाव के बिंदु पर स्थानीय और अच्छी तरह से नियंत्रित चोटों बनाने के लिए microneedles और स्पंदित लेज़रों के उपयोग vivo में यांत्रिक और दर्दनाक चोट नकल और मरम्मत प्रतिक्रिया की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए उत्तरदायी हैं, लेकिन एक बार में एक कक्ष की मरम्मत में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. यह स्पंदित लेजर चोट दृष्टिकोण झिल्ली चोट लिपिड झिल्ली ऐसे photoxidative और photothermal क्षति के रूप में nonphysiological प्रभाव उत्पन्न करने के लिए जाना जाता है जो स्थानीयकृत हीटिंग, के कारण होता है जहां nonpulsed लेज़रों के साथ कोशिका झिल्ली की विस्तारित विकिरण के उपयोग से अलग है कि ध्यान देने योग्य है और साइटोसोलिक घटक 11.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक ओ की क्षमता का दोहन की अनुमतिकांच के मोती के उपयोग पर निर्भर करता है और क्षमता, कैनेटीक्स और माइक्रोमीटर आकार चोट के बाद कोशिका झिल्ली की मरम्मत में शामिल subcellular तस्करी की निगरानी के लिए स्थानीय चोट दृष्टिकोण (स्पंदित लेजर) में से एक है, जो च सामूहिक रूप से चोट दृष्टिकोण. ये दृष्टिकोण परस्पर पूरक हैं - थोक चोट की मरम्मत करने की क्षमता और इसके साथ जुड़े subcellular तस्करी में कमी की पहचान करने के लिए कोशिकाओं की आबादी का उपयोग सक्षम बनाता है. व्यक्ति की कोशिकाओं में मरम्मत के वास्तविक समय दृश्य सक्षम करके, लेजर चोट दृष्टिकोण कोशिका झिल्ली की मरम्मत के कदम और subcellular क्या घटनाओं की मरम्मत में कमी के साथ जुड़े रहे हैं क्या पहचान की अनुमति देता है. यह दृष्टिकोण स्तनधारी और अकशेरुकी जीवों 7,12,13 में कोशिका झिल्ली की मरम्मत की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया है. प्रयोग की जरूरतों के आधार पर इन दो तरीकों से किसी के द्वारा ही इस्तेमाल किया जा सकता है. मरम्मत घाटे की प्रकृति जाना जाता है या subcellular तंत्र टी में शामिल नहीं है लेकिन, जबइन तरीकों का एक संयोजन का उपयोग कर, नहीं जाना जाता है उसकी प्रक्रिया उपयोगी है.

कारण आधारित अंत बिंदु में नमूने सेल चोट assays के बीच घायल कोशिकाओं की संख्या में निहित परिवर्तनशीलता के लिए यह स्वतंत्र रूप से सभी की मरम्मत करने में कामयाब रहे कि घायल हुए हैं कि कोशिकाओं, और सुधार करने में विफल रहा है कि उन लोगों की पहचान करने के लिए आवश्यक है. हम यहाँ का वर्णन किया है ग्लास मनका चोट दृष्टिकोण इन कोशिकाओं की पहचान करने की अनुमति देता है. घायल ग्लास मनका बाहर ले जाने कब यह खुद को हल्के होते हैं चोटों से घायल कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम करने के प्रयास कर रही है जबकि इतने कोशिकाओं कई हिट प्राप्त नहीं है कि महत्वपूर्ण है. दोहराया चोट कोशिकाओं (मरम्मत में गरीब हैं कि चुनिंदा उन) प्रक्रिया के दौरान मरने और coverslip से अलग करने के लिए कारण होगा, क्योंकि यह महत्वपूर्ण है. इस की मरम्मत करने में विफल रहा है कि कोशिकाओं के एक मूल्यवान समझना नतीजा होगा. यह किसी भी नए चोट को खत्म करने के लिए coverslips हैंडलिंग और धोने के दौरान कांच के मोती के किसी भी रोलिंग से बचने के लिए भी महत्वपूर्ण है जोएक लाल धुंधला (झूठी सकारात्मक कोशिकाओं) का परिणाम देगा. चोट के लिए यह दृष्टिकोण भी lysosome जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1 (LAMP1) के लिए यहां प्रदर्शित किया गया है, के रूप में ब्याज की प्रोटीन की कोशिका की सतह स्थानान्तरण के लिए कोशिकाओं की आबादी की निगरानी की अनुमति देता है. Immunofluorescence द्वारा ही कोशिका की सतह स्थानीयकृत प्रोटीन जब निगरानी एक महत्वपूर्ण आवश्यकता निर्धारण से पहले ब्याज और immunolabel कोशिकाओं की प्रोटीन की कोशिकी डोमेन है कि बाँध एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए है. यह रिहाई कोशिकाओं के साथ या कोशिकाओं के विभिन्न आबादी के बीच घायल कोशिकाओं में कोशिका झिल्ली पर LAMP1 स्तर की तुलना की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल LAMP1 का उपयोग सचित्र किया गया है, यह प्रोटीन का बाह्य डोमेन के लिए विशिष्ट एक एंटीबॉडी है जिसके लिए पसंद के किसी भी अन्य प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है. चोट ट्रिगर lysosomal एक्सोसाइटोसिस lysosomal एक्सोसाइटोसिस की (चोट से चालू होने वाले नहीं) भी इसी बेसल दर है स्थापित नहीं किया गया है कि दो सेल लाइनों के बीच तुलना करने की जरूरत है, रिहाई कोशिकाओं पर कोशिका की सतह LAMP1 धुंधला हो जाना भी मापा जाना चाहिए. इस के लिए एक अतिरिक्त नमूना है कि बस चरण 9 में कोशिकाओं प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ incubated किया जाना चाहिए, सिवाय नमूना सी 2 के रूप में व्यवहार किया जाता है. इस lysosomal एक्सोसाइटोसिस के बेसल दर का एक उपाय प्रदान करेगा.

लेजर चोट प्रोटोकॉल के लिए कोशिका झिल्ली एक उच्च तीव्रता फोटान nsec स्पंदित लेजर से घायल हो गए हैं. लोग घायल हो गए जिसका प्रतिदीप्ति बढ़ जाती बाध्यकारी एंडोमेम्ब्रेन पर (जैसे एफएम 1-43) सेल impermeant डाई की उपस्थिति में किया जाता है. इस प्रकार सेल जुड़े डाई प्रतिदीप्ति निम्नलिखित समय के लिए 3 चंगा करने के लिए सेल द्वारा की गई एक उपाय प्रदान करता है. लेजर चोट एफएम डाई प्रतिदीप्ति में वृद्धि के परिणामस्वरूप, सेल भर endomembranes बाध्य करने के लिए एफएम डाई का कारण बनता है. क्षतिग्रस्त कोशिका झिल्ली की मरम्मत सेल में आगे डाई प्रवेश में बाधा उत्पन्न करती. इस प्रकार, एक सेल के लिए डाई की मरम्मत करने में विफल रहता है कि जबकि मरम्मत, डाई प्रतिदीप्ति, एक पठार तक पहुँच जाता है कि एक सेल के लिएप्रतिदीप्ति लगातार बढ़ जाती है.

कोशिका झिल्ली की मरम्मत में शामिल व्यक्ति subcellular घटनाओं के लाइव सेल इमेजिंग शोर अनुपात करने के लिए उच्च संकेत में कोशिका झिल्ली निगरानी की आवश्यकता है. कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी शोर अनुपात 14-16 के लिए एक उच्च संकेत पर इमेजिंग कोशिका की सतह घटनाओं के लिए अच्छी तरह से अनुकूल एक दृष्टिकोण है. वहाँ कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध TIRF व्यवस्था कर रहे हैं और लाइव सेल इमेजिंग के साथ संगत इन पद्धतियों में से कोई भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, हम कहीं और 17,18 घर का बना TIRF माइक्रोस्कोप की स्थापना के लिए दृष्टिकोण का वर्णन किया है. TIRF सेटअप की स्वतंत्र से पहले subcellular vesicles के विभिन्न भाग्य की निगरानी और चोट के बाद की अनुमति दृष्टिकोण है कि स्थापित करने की जरूरत है. दूसरी जगहों पर हम प्रत्येक लाइसोसोम 19 के विलय की निगरानी प्रकृति, अवधि, और डिग्री की अनुमति है कि इस तरह के दृष्टिकोण की चर्चा प्रदान की है. चोट की निगरानी करने के लिए lysoso लेबल FITC-dextran के एक्सोसाइटोसिस ट्रिगरप्रोटोकॉल 4 निरीक्षण करने के लिए प्रमुख विशेषता में वर्णित एमईएस चमक रहे हैं. फ़्लैश प्रतिदीप्ति के पार्श्व प्रसार में जिसके परिणामस्वरूप एक भी कदम में व्यक्तिगत लाइसोसोम में निहित FITC dextran की रिहाई शामिल है. प्रत्येक फ्लैश आमतौर पर एकल लाइसोसोम के एक exocytic फ्यूजन इंगित करता है, यह कई लाइसोसोम फ्यूजन साइट से पहले पर मौजूद हैं कैसे निगरानी और फ्लैश का पालन करते हुए इस स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम फ्रेंच पेशी Dystrophy एसोसिएशन (AFM) द्वारा ई. के लिए स्वास्थ्य अनुदान AR055686 और AR060836 और postdoctoral फैलोशिप के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. इस अध्ययन में उपयोग सेलुलर इमेजिंग सुविधा स्वास्थ्य अनुदान HD040677 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS Sigma H1387 Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES Fisher BP410 Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable) Invitrogen D1820 2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads Sigma G8772
TRITC dextran (Lysine fixable) Invitrogen D1818 2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16% EMS 15710 4% in PBS
Hoechst Invitrogen H3570 1/10 000 in PBS
FM dye Invitrogen T3163 1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran Sigma FD40S 2 mg/ml in growth medium
LAMP1  Santa Cruz sc-19992 1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG Invitrogen A21470 1/500 in blocking solution
Mounting media Dako S3023
Coverslips Fisher 12-545-86
Glass bottom petridish MatTek corporation P35G-1.0-14-C
Silicone O ring Bellco 1943-33315
Coverslip holder Bellco 1943-11111
Invitrogen A-7816
DMEM VWR 12001-566
FBS VWR MP1400-500H Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin VWR 12001-350 Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum Sigma C5405 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free) VWR 12001-664
Epifluorescence microscope Olympus America, PA IX81
TIRF illuminator  Olympus America, PA Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator Sutter Instruments, Novato CA Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera Photometrics, Tucson, AZ Evolve 512 EMCCD 
Image acquisition and anaysis software Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO Slidebook 5
Pulsed laser Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO Ablate (3iL13)
Stage top incubator Tokaihit, Japan INUBG2ASFP-ZILCS

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References

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Defour, A., Sreetama, S. C., Jaiswal, J. K. Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair. J. Vis. Exp. (85), e51106, doi:10.3791/51106 (2014).

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