Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo

Summary

O processo de cura de feridas envolve as células tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão da membrana celular. Este protocolo descreve os ensaios para monitorar esses processos.

Abstract

A capacidade das células para curar feridas é um processo celular fundamental, mas os mecanismos celulares e moleculares envolvidas na cura feridas células estão mal compreendidos. Aqui são descritos os ensaios para monitorar a capacidade e cinética de cura das células em cultura após a lesão localizada. O primeiro protocolo descreve uma abordagem ponto final baseado para avaliar simultaneamente reparo da membrana celular capacidade de centenas de células. O segundo protocolo descreve uma abordagem de imagem em tempo real para monitorar a cinética de reparo da membrana celular em células individuais, após lesão localizada com um laser pulsado. Como as células de cura feridas envolve o tráfico de proteínas específicas e os compartimentos intracelulares para o local da lesão, o terceiro protocolo descreve o uso de uma abordagem baseada ponto final acima para avaliar um tal evento tráfico (lisossomal exocitose) em centenas de células lesionadas e simultaneamente o último protocolo descreve o uso de lesões de laser pulsado em conjunto com micros TIRFcópia para monitorar a dinâmica de compartimentos subcelulares individuais em células lesadas em alta resolução espacial e temporal. Embora os protocolos aqui descrever a utilização dessas abordagens para estudar a relação entre a reparação da membrana celular e exocitose lisossomal em células musculares em cultura, podem ser aplicadas como tal, para qualquer outra célula de cultura aderente e compartimento subcelular de escolha.

Introduction

Membrana celular mantém a integridade das células, fornecendo uma barreira entre a célula e para o ambiente extracelular. Um estímulo químico, elétrico ou mecânico que exceder o limite fisiológico normal, assim como a presença de patógenos invasores cada um pode resultar em prejuízo para a membrana da célula e desencadear uma resposta celular subseqüente para reparar esse dano. Para sobreviver essas lesões na membrana celular, as células possuem um mecanismo eficiente para o reparo. Este mecanismo é dependente de cálcio e envolve o tráfico intracelular de proteínas, tais como anexinas e MG53, entre outros, bem como os compartimentos intracelulares tais como endossomas, lisossomas, Golgi e vesículas derivadas mitocôndrias para a membrana celular ferido ^1-7. No entanto, os dados da sequência de acontecimentos moleculares e subcelulares envolvidos na reparação da membrana celular danificada permanece pouco compreendido.

Resposta de reparação da célula podem ser agrupadas em orelhaly e respostas tardias. Respostas precoces, que ocorrem dentro de segundos a minutos o tempo de escala, são tremendamente importantes para determinar a natureza das respostas tardias que levam à reparação celular de sucesso ou morte celular. Ensaios de ponto final com base na análise bioquímica e celular em massa ajudaram a estabelecer o envolvimento de processos moleculares e celulares de reparação. Mas, devido à heterogeneidade e rapidez de resposta de reparação celular, ensaios de ponto final não fornecem os detalhes cinéticos e espaciais da seqüência de eventos que levam a reparar. Abordagens que permitem lesão controlada da membrana celular e permitem monitorar o reparo da membrana celular e respostas subcelulares associados a alta resolução espacial e temporal são ideais para tais estudos. Aqui, estas abordagens têm sido apresentadas. Dois dos protocolos descrevem abordagens para acompanhar a cinética em tempo real de reparação da membrana celular e as respostas intracelulares associados com o processo de reparação em células vivas seguintes inj a laserUry. Como complemento a estes ensaios baseados imagens de células vivas, os ensaios de ponto final também foram descritos que fornecem uma medida de base populacional para o monitoramento reparação de células individuais e as respostas subcelulares associados. Para demonstrar a sua utilidade destas abordagens têm sido utilizadas para controlar o tráfico e exocitose de lisossomos em resposta à lesão da membrana celular.

Protocol

1. Repair Membrana imagens de células Usando Granel (grânulo de vidro) Wounding

Este protocolo permite a marcação separadamente as células feridos e aqueles que não conseguem curar. A quantificação destas populações de células requer a utilização de três condições: 1. Teste (C1) - As células são deixadas a reparar na presença de ^{Ca2 +,} 2. Controlo 1 (nenhuma lesão C2) - As células são incubadas na presença de Ca ^{2 +,} mas não lesionado, e 3. Controlo 2 (sem reparação C3) - células são deixadas para reparar na ausência de Ca ^{2 +.}

1. Cultivar células de> 50% de confluência em três lamelas estéreis e lavar C1 e C2, duas vezes com a CIM a 37 ° C e C3 com PBS a 37 ° C e lamelas de transferência de silicone de O-rings.
2. Adicione 100 ml de solução de dextrano FITC pré-aquecido no CIM em C1 e C2 ou em PBS em C3.
3. Ferir membrana plasmática em C1 e C3 por suavemente ondulado 40 mg contas de vidro sobre a lamela à temperatura ambiente por lamelas de inclinação manualmente para trás ediante 6-8 vezes em um ângulo de 30 °.
   Nota: Para lesões leves, garantir as contas de vidro estão espalhados de maneira uniforme, minimizando, assim, lesões repetidas. Para melhorar a reprodutibilidade do ferimento entre as amostras, simultaneamente, realizar a lesão de contas de vidro de diferentes amostras a ser comparadas.
4. Evitar mais rolamento de esferas, transferir todos os lamelas para uma incubadora de 37 ° C em CO ₂ ambiente e permitir a reparação de prosseguir por 5 min.
5. Sem permitir que as esferas rolam, remover as esferas de vidro e de FITC-dextrano por lavagem com CIM (C1 e C2) ou PBS (C3), a 37 ° C.
6. Local lamelas de volta no anel O e adicionar 100 ml de solução TRITC dextrano pré-aquecido lisina solucionáveis ​​no CIM em C1 e C2 ou em PBS sobre C3.
7. Incubar a 37 ° C durante 5 min em ambiente de CO _2.
8. Lavar as lamelas duas vezes com pré-aquecido CIM e fixar com PFA a 4% durante 10 min à temperatura ambiente.
9. Lavar duas vezes com PBS e incuba-se durante 2 minutos à temperatura ambiente em corante Hoechst.
10. Wash samples duas vezes com PBS, montar em um slide usando a mídia de montagem e células de imagem usando um microscópio de epifluorescência.
11. Use as células de C2 para determinar a intensidade de coloração de fundo vermelho e verde e usar esse valor para limite os canais vermelho e verde para todas as amostras (C1-C3).
12. Pontuação número total de células que são a) verde (lesionado e reparado) e b) vermelho ou vermelho e verde (ferido, mas não conseguiram reparar) em amostras C1 e C3.
13. Contagem> 100 células verdes para cada condição e expressam a fração de células que não conseguiram reparar como um por cento de todas as células lesadas (verde e vermelho).

2. Imagens ao vivo da cinética de reparo da membrana celular após lesão Laser

1. Lave as células pré-aquecido com CIM e, em seguida, colocar a lamela na CIM com corante FM.
2. Coloque a lamela em um suporte no topo fase incubadora mantida a 37 ° C.
3. Seleccionar uma região de ² 1-2 mm da membrana da célula, e para irradiar <, 10 mseg com o laser pulsado. Atenuar a potência do laser, através do software de 40-50% da potência de pico. Poder Optimal permite lesão consistente, mas não-letal e isso deve ser determinado por tentativa e erro para cada linha de instrumento individual e celular sendo usado.
4. Para monitorar o reparo, a imagem a cada 10 segundos em epifluorescência e campo claro, começando antes do ferimento e continuar por 3-5 min após lesão.
   Nota: Para qualquer controle reparação, repita os passos de 2,1-2,4 com as células feridos em PBS contendo corante FM.
5. Para quantificar a cinética de reparação, medir FM celular corante fluorescente e representar graficamente a alteração na intensidade (ΔF/F0) durante o curso de imagiologia. Esta informação deve ser em média de mais de 10 células em cada condição e representados graficamente como a média ou valor de célula individual, conforme necessário.

3. Imagem Granel (grânulo de vidro) Lesão Induzida Lysosomal Exocitose

As amostras incluem seguintes células cultivadas para> 50%confluência: 1. Test (C1) - Células autorizados a reparar na presença de Ca ^{2 +,} 2. Controlo 1 (C2; Nenhuma lesão) - Células não lesionados nem incubadas com o anticorpo primário, e 3. Controle 2 (C3; No reparação) - Células autorizados a reparar na ausência de Ca ^{2 +.}

1. Lavar lamelas C1 e C2, duas vezes com a CIM a 37 ° C e C3 com PBS a 37 ° C, e transferi-los em silicone O-rings.
2. Adicione 100 ml de pré-aquecido lisina solucionáveis ​​dextrano TRITC no CIM em C1 e C2 e na PBS em C3.
3. Ferir membrana plasmática em C1 e C3 tal como no passo 1.3.
4. Evitar mais rolamento de esferas, transferir todos os lamelas para uma incubadora de 37 ° C em CO ₂ ambiente e permitir a reparação de prosseguir por 5 min.
5. Remover as esferas de vidro e TRITC dextrano por lavagem das lamelas em meio de crescimento frio, assegurando novamente sem laminação das pérolas de vidro sobre as células.
6. Lavar as lamelas duas vezes com meio de cultura fria e transferir para os anéis de vedação.
7. Para C1 e C3, Adicione 100 ml de rato anticorpo anti LAMP1 rato em meio de crescimento completas frias e adicione a, meios de crescimento completo frio para C2.
8. Para permitir a ligação do anticorpo lamelas incubar durante 30 min a 4 ° C.
9. Lave as lamelas três vezes com CIM frio e corrigir todos lamelas com PFA 4% por 10 min à temperatura ambiente e depois enxaguar 3x com CIM.
10. Incubar todas as lamelas em 100 ul de solução de bloqueio durante 15 minutos a RT
11. Incubar todas as lamelas em 100 mL de Alexa Fluor 488 anticorpo anti rato durante 15 min a 4 ° C.
12. Lavar duas vezes com PBS e incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente em Hoechst.
13. Lave as células duas vezes com PBS, montar em um slide usando a mídia de instalação e de imagem usando um microscópio de epifluorescência.
14. Usando imagens de células C2, determinar a coloração de fundo não específica no vermelho (TRITC dextrano) e verde (Alexa Fluor 488 anticorpos) canais e usar esses valores de coloração de fundo para limiar os canais vermelho e verde para todas as amostras (C1-C3). </ Li>
15. Use as> 100 rotulado vermelhas células de C1 e C3 para medir a intensidade de coloração LAMP1 (verde) em células lesadas. Para uma experiência de sucesso da coloração LAMP1 em células a partir de C3 será significativamente menor do que nas células de C1.

4. Imagens ao vivo da Membrana Celular Lesão Provocado Tráfico subcelular

1. Fluorescente rotular o compartimento de interesse através da transfecção de repórter adequado (por exemplo, CD63-GFP para os lisossomas ⁸⁾ ou utilizando corantes fluorescentes ^9.
2. Para lisossomos de etiquetagem com corante fluorescente, incubar as células cultivadas para 50% de confluência em meio de crescimento contendo FITC-dextrano
3. Permitir dextrano a ser sujeita a endocitose, durante 2 horas (ou mais, conforme necessário para a rotulagem endossomal suficiente com dextrano pela linha celular de interesse) na incubadora de CO _2.
4. Lavar as células com meio de crescimento pré-aquecido e incubar em que, durante 2 horas numa incubadora _{de CO2} para permitir que todosendocytosed dextrano a se acumular no lisossomo.
5. Antes de imagem, lavar a lamela na pré-aquecido CIM e montar em um suporte lamela no último estágio incubadora a 37 ° C.
6. Realizar widefield (para circulação em todo o celular) ou TIRF (movimento na superfície da célula e exocitose) de imagem - as células que não têm lotado FITC dextrano lisossomos rotulados são ideais para a imagem do movimento e exocitose de lisossomos individuais.
7. Alinhando os lasers TIRF para microscópio de imagem: Use 60X ou 100X com objetivo> 1,45 NA. Configure o ângulo de feixe de laser incidente TIRF usando a abordagem do fabricante.
8. Ferir a membrana celular por irradiação de uma pequena região (1-2 mm ²⁾ para <100 mseg, com o laser pulsado a 40-50% de atenuação.
9. Para monitorar a resposta do lisossoma para a célula lesão, células de imagem em 4-6 frames / seg por pelo menos 2 minutos ou mais, dependendo da dinâmica de exocitose em células de interesse.

Representative Results

Protocolos aqui descritas para imagens de células único são monitorar a capacidade e cinética de reparo da membrana celular (protocolos 1 e 2) eo tráfico subcelular e fusão de lisossomos durante a reparação (Protocolos 3 e 4).

Protocolo 1 mostra um ensaio de massa que permite marcar todas as células lesionadas e identificar as células danificadas que não conseguiram reparar. Os resultados na Figura 1 mostram que, enquanto as células não lesionados (Figura 1 A) permanecem sem rótulo as células feridas por conta de vidro em presença de FITC dextrano são rotulados verde (Figura 1B e 1C). Quando as células são permitidos para reparar na presença de ^{Ca2 +} a maioria das células (verde) para reparar feridas administrar e não são marcados (vermelho) por TRITC dextrano (Figura 1B). Quando as células são permitidos para reparar na ausência de ^{Ca2 +,} a maioria das células lesadas também são etiquetados vermelho pelo dextrano TRITC (Figura 1C). As células que nunca foram feridos não apresentam qualquer rotulagem com o dextrano TRITC. Assim, em relação a qualquer amostra da quantificação do número de células verdes marcado apenas fornece uma medida das células que foram feridos por esferas de vidro e reparados, enquanto a quantificação do número de células (vermelho e verde) duplamente marcada fornece uma medida das células que falharam para reparar de uma lesão.

Protocolo 2 descreve a avaliação das cinéticas de reparação da membrana celular por monitorização da entrada do corante FM na célula. Quando incubado na corante FM, células intactas mostram a coloração da membrana celular (Figura 2A antes da lesão painel WF). Após lesão do laser localizada da membrana celular corante FM começa entrar na célula e endomembranes, o que causa um aumento repentino na FM corante fluorescente (Figura 2B) vinculativo. À medida que a capacidade da membrana de células para reparar danos na sequência de laser é dependente de ^{Ca2 +,} uma célula de feridas na presença de ^{Ca2 +} é able para reparar, o que provoca a entrada do corante FM (e, consequentemente, aumentar em celular FM corante fluorescente) para cessar dentro de um minuto após a lesão (Figura 2A, painel superior, figura 2B, linha azul, e animado Video 1 e Figura 2). Pelo contrário, uma célula permitida a reparar na ausência de ^{Ca2 +,} não reparar, o que resulta na entrada contínua de corante e, portanto, aumento contínuo FM corante de fluorescência, mesmo 4 minutos após a lesão (Figura 2A, painel inferior, Figura 2B, A linha vermelha e animado de vídeo 2 e Figura 2). Assim, o reparo da membrana celular leva a um platô da coloração corante FM, enquanto a falta de reparo da membrana celular provoca entrada corante contínuo que não Plateau.

Protocolo 3 descreve a utilização de grandes quantidades (esferas de vidro) abordagem lesão para monitorar a translocação da superfície da célula de vesículas e proteínas, em resposta a uma lesão. Aqui ªcélulas e são feridos na presença de TRITC dextrano assim, enquanto que as células não lesadas não são rotulados vermelho (Figura 3A), mas todas as células lesionadas são rotulados vermelho (Figuras 3B e 3C). As células não lesionados que não são tratados com rotulagem nível show de anticorpo primário de fundo para LAMP1 superfície celular (painel LAMP1 Figura 3A). No entanto, quando as células são feridos e deixou-se curar em presença de cálcio, lisossomas sofrer exocitose e, portanto, não há aumento do nível de coloração LAMP1 na superfície das feridas (vermelho marcada), as células (Figura 3B). Este aumento na rotulagem LAMP1 superfície celular é muito menor em células que têm permissão para curar em ausência de cálcio (Figura 3C). Isto demonstra a natureza cálcio regulados de lisossômico exocitose e, consequentemente, a aparência da superfície de LAMP1. Assim, ambos, a quantificação do número de células com coloração LAMP1 superfície celular elevada, bem como a medição do nívelLAMP1 de coloração da superfície celular em células lesadas individuais, prever medidas de capacidade da célula de se submeter lesão desencadeada lisossômico exocitose.

Protocolo 4 pode ser usado para o monitoramento direto da cinética, natureza e localização da fusão lisossomo indivíduo em resposta à lesão da membrana celular. As células são feridos pelo laser pulsado e de superfície celular lisossomos são gravadas por imagem TIRF, que permite o monitoramento lesão desencadeada exocitose de lisossomos em células individuais (Figura 4A e animado vídeo 3). Figura 4A mostra uma célula (esboçado em verde) visualizado por imagem de contraste de fase (painel da esquerda) e por microscopia TIRF (painel do meio), antes do ferimento. Painel da direita mostra imagem TIRF da mesma célula 105 segundos após a lesão. Vários lesão desencadeadas respostas dos lisossomos são descritos nas Figuras 4B-E. Figura 4B mostra lesão desencadeadas recrutamento de um lisossoma (marcadopelo círculo cinzento) para a membrana celular, seguido por exocitose (animação vídeo 4 e Figura 4). Este lisossoma não é visível na imagem TIRF antes da lesão (Figura 4B: painel -2,5 s), mas após a lesão do lisossoma chega à membrana da célula e se torna detectável (Figura 4B: painel 102,5 s), como a vesícula se move para mais perto do membrana celular é melhor animado pela iluminação TIRF eo dextrano fluorescência FITC lisossômico atinge valor máximo quando o poro de fusão abre causando neutralização do pH lisossômico e assim dequenching da fluorescência FITC dextrano (Figura 4B: Painel 104,8 s). Subsequentemente, o dextrano é descarregado a partir da vesícula para o exterior da célula, causando FITC para espalhar lateralmente e a fluorescência de vesículas a diminuir gradualmente (Figura 4B: painel 107,1 s). Na segunda categoria, o lisossoma (marcado por um círculo laranja, animado VidOE 5 Figura 4) está presente antes da lesão (Figura 4C: Painel -2,5 s), ele permanece lá na membrana (Figura 4C: Painel de 91 s) até que os exocytoses vesícula. Aqui, o lisossoma exocytosed parcialmente (Figura 4C: Painel de 93 s) deixando para trás alguns dextrano FITC na vesícula após fusão (Figura 4C: 94,5 s). A terceira e quarta categorias de vesículas não se fundem à membrana. O lisossoma mostrado na Figura 4D (marcado por azul círculo) se move axialmente para e longe da membrana celular (animação vídeo 6 e Figura 4). Este lisossomo não é visível na membrana celular antes da lesão (Figura 4D: Painel -2,5 s), mas ao aproximar-se da membrana celular após lesão, torna-se visível por microscopia TIRF (Figura 4D: Painel 59,3 s). Atingiu mais próximo da membrana celular (Figura 4D: painel 59,6 s) e, em seguida afasta-se sem fundir (Figura 4D: pAnel 63,7 s). O lisossoma na quarta categoria chega perto da membrana e move-se horizontalmente ao longo da membrana celular (área marcada pela caixa roxo na Figura 4A, de animação vídeo 7 e Figura 4). Figura 4E (painel 8.7 s) mostra a chegada do lisossoma , que, em seguida, move-se ao longo da membrana e pode ser visto na sequência de imagens após a lesão (Figura 4E: painéis 10.7, 11.9, 12.8, 18.8 s). Com base na descrição acima de quantificar a intensidade de dextrano FITC de cada lisossoma - fusão (Figuras 4B e 4C), movendo-se axialmente (Figura 4D), ou movendo-se horizontalmente (Figura 4E) permite a determinação da resposta do lisossoma a lesão.

Figura 1. . Célula massa lesão membrana por contas de vidro Imagens mostram coloração nuclear (Hoechst, painel esquerdo), lesão (coloração verde - FITC dextrano), as células não reparados (coloração vermelho - TRITC Dextran), e fundiu imagens (Merge). (A) As células não lesadas, em presença de cálcio, (B) células de células lesionadas na presença de cálcio, e (C) Ferido em ausência de cálcio. Escala bar 10 m. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 2. . Imagens em tempo real de reparo da membrana celular em resposta à lesão do laser (A) Imagem de células (com contorno laranja) antes da lesão [painel à esquerda - campo claro (BF) eepifluorescência (epi)], 5 segundos, 1 minuto, e 4 minutos após a lesão. O local da lesão é indicado por uma seta branca. O painel superior mostra uma célula de feridas, na presença de cálcio e o painel inferior mostra uma célula de feridas na ausência de cálcio. (B) O gráfico mostra a mudança na coloração do corante FM (ΔF/F0) das células no painel A feridos na presença de cálcio (azul) ou na ausência de cálcio (vermelho). A região onde corante FM entra e, portanto, a rotulagem de fluorescência aumentada foi usada para a quantificação da intensidade de fluorescência. Escala bar = 10 mm). Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3. Exocitose imagem lisossômico em resposta a uma lesão em massa. Imagens mostram coloração nuclear Hoechst (azul), LAMP1 coloração da superfície celular (verde), TRITC dextrano (vermelho) e mesclar de todos os canais (overlay) de (a) sem lesão células não marcadas com o anticorpo primário, (B) células feridos permitida a reparação na presença de cálcio, e (C) células lesadas permitidos para reparar na ausência de cálcio. Escala bar 10 m. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 4. Imagens em tempo real de lisossômico exocitose em resposta à lesão laser. Células com FITC dextrano lisossomos marcados foram feridos por um laser pulsado na presença de cálcio. (A) O limite da célula quefoi ferido é descrito (em verde): painel da esquerda - campo claro antes da lesão, o painel do meio - TIRF antes da lesão e painel direito - TIRF 105 s após a lesão. O local da lesão é marcado pela caixa de ciano e da área representante indicado pelo / caixas roxas brancas e círculos coloridos dentro são ampliadas em painéis BE. A cor da vesícula na imagem de células inteiras (cinza, laranja e azul) corresponde à cor do zumbido nos lisossomos de imagens individuais. Painel (B) esquerda mostra um gráfico para o valor ΔF/F0 para a fluorescência FITC de uma vesícula recrutados após a lesão. Painel da direita mostra instantâneos da vesícula antes da lesão (-2,5 s), anterior ao fusionamento (102,5 s), fusão (104,8 s) e postfusion (107,1 s). Painel (C) esquerda mostra um gráfico para o valor ΔF/F0 para a fluorescência FITC de uma vesícula encaixado antes de lesão. Painel da direita mostra instantâneos da vesícula antes da lesão (-2,5 s), anterior ao fusionamento (91 s), fusão (93 s) e postfusion (94,5 s). (<painel forte> D) da esquerda mostra uma trama para o valor ΔF/F0 para a fluorescência com FITC de uma vesícula de movimento axial (em direcção e para longe da membrana celular). Painel da direita mostra instantâneos da vesícula antes da lesão (-2,5 s), e após a lesão na posição diferente perto da membrana em 59,3, 59,6 e 63,7 s. (E) Instantâneos da vesícula que se movia horizontalmente ao longo da membrana celular em várias posições antes da lesão (-2,5 s) e após a lesão em (8,7, 10,7, 11,9, 12,8 e 18,8 s). Barra de escala (A = 10 m, B, C, D, E = 1 mm). Clique aqui para ver imagem ampliada.

Animated vídeo 1 Figura 2: . imagem de reparo da membrana celular em resposta à lesão laser na presença de cálcio em tempo real de entrada corante FM em uma célula (com contorno laranja) ferido por pulsadade laser na presença de cálcio. O filme representa 200 imagens adquiridas a cada 2 s. A célula foi ferido (região marcada pelo quadrado ciano) após frame 4. O selo de tempo mostra a hora em hora: min: seg: formato ms. Escala da barra = 10 m.

Animated vídeo 2 Figura 2: . imagens em tempo real de reparo da membrana celular em resposta à lesão laser na ausência de cálcio entrada FM corante em uma célula (com contorno laranja) ferido por laser pulsado na ausência de cálcio. O filme representa 200 imagens adquiridas a cada 2 s. A célula foi ferido (região marcada pelo quadrado ciano) após frame 4. O selo de tempo mostra a hora em hora: min: seg: formato ms. Escala da barra = 10 m.

Animated vídeo 3 Figura 4: imagem de lisossômico exocyt tempo realosis em resposta à lesão laser. Diferentes respostas dos lisossomos em uma célula (esboçado no verde, Vídeo 3) ferido por laser pulsado. O filme representa 2 min de imagens de lapso de tempo seqüenciais adquiridas por microscopia TIRF em 5 frames / seg. Imagens de campo claro foram adquiridos a cada 20 seg. A célula foi ferido (indicado pela caixa de ciano) em 2 segundos em um vídeo. Os círculos coloridos (cinza, laranja e azul) ea caixa de roxo marcam os lisossomos descritos na figura 4 e vídeos de animação 4-7, demonstrando seus destinos diversos após lesão celular. O selo de tempo mostra a hora em hora: min: seg: formato ms. Escala da barra = 10 m.

Animated vídeo 4 figura 4 mostra lisossomo exocítico marcado por círculo cinza, que é recrutado para a membrana em resposta à lesão. Aos 7 seg (lesão 5 seg post) para este vídeo o lisossoma é recrutado na membrana celulare, em seguida, funde neste local em 1 min e 47 seg. Barra de escala = 1 mm.

Animated vídeo 5 figura 4 mostra lisossomo exocítico marcado por círculo laranja que foi ancorada na membrana antes da lesão e fusíveis neste local 1 min e 35 seg. Barra de escala = 1 mm.

Animated Video 6 figura 4 mostra lisossomos marcados por círculo azul se movendo em direção e, em seguida, para longe da membrana celular. Barra de escala = 1 mm.

Animated vídeo 7 figura 4 mostra uma região da célula marcada por caixa roxa em vídeo 3, onde após uma lesão um dos lisossoma (círculo branco) move along a membrana celular. Barra de escala = 1 mm.

Discussion

Lesão da membrana celular in vivo ocorre devido a uma variedade de factores de stress fisiológico e várias abordagens experimentais foram desenvolvidos para imitar estes. Estes incluem ferindo membrana celular das células aderentes raspando-los fora do prato ou por passagem através de um furo de ^9,10 seringa estreita. Depois de tais lesões das células curar em suspensão e não adere à matriz extracelular, como sucede normalmente em tecido. Ainda outros, como o uso de poros formando toxinas alterar quimicamente membrana celular por lipídios extrair tais como colesterol, portanto, não imitando em injúrias mecânicas in vivo ^5. Assim, o método utilizado para a lesão celular pode afetar o que pode ser aprendido sobre a resposta do reparo. Isto exige, não só exercer cautela na escolha do ensaio de lesão celular, mas também escolher abordagens melhor que imitam as lesões mecânicas in vivo. Essas abordagens incluem a lesão do zero (em que uma monocamada de células são feridospor um bisturi ou agulha) e contas de vidro lesão (onde lesão é causada por contas de vidro que rolam sobre células aderidas). Essas abordagens são bem adequados para ferir as células em massa, mas não são passíveis de imagem do processo de reparo da membrana celular em tempo real. Uso de microagulhas e lasers pulsados ​​para criar lesões localizadas e bem controlados no ponto de impacto imitar a lesão mecânica e traumática in vivo e são passíveis de imagem da resposta de reparação em tempo real, mas oferece uma visão sobre a reparação de uma célula de cada vez. Vale a pena notar que a abordagem lesão laser pulsado é distinta do uso de irradiação prolongada de membrana celular com lasers Sem pulso, onde a lesão da membrana é causada pelo aquecimento local, que é conhecido por induzir efeitos não fisiológicos, tais como danos photoxidative e fototérmica à membrana lípidos e componentes citosólicos ^11.

Os protocolos aqui descritos permitem o aproveitamento do potencial de um of en masse abordagem lesão, que se baseia na utilização de pérolas de vidro e uma das abordagem lesão localizada (laser pulsado) para o controlo da capacidade, a cinética e o tráfico subcelular envolvidas na reparação de membrana celular após lesão de tamanho micrométrico. Essas abordagens são mutuamente cortesia - lesão em massa permite a utilização de uma população de células para identificar um déficit na capacidade de reparação e tráfico subcelular associado a ele. Ao permitir a visualização de reparação em tempo real em células individuais, a abordagem lesão laser permite identificar o que passo do reparo da membrana celular e que eventos subcelular estão associados com o déficit na reparação. Esta abordagem tem sido utilizada para monitorizar a reparação da membrana celular em organismos de mamíferos e invertebrados ^7,12,13. Com base nas necessidades da experiência nenhuma destas duas abordagens podem ser utilizados por si só. No entanto, quando a natureza do déficit de reparação não é conhecido ou o mecanismo subcelular envolvido em to processo não é conhecido, usando uma combinação destas abordagens é útil.

Devido à variabilidade inerente ao número de células lesionadas entre amostras no ponto final ensaios à base de células de ferimento, é necessário identificar, independentemente, todas as células que são lesadas, que administravam a reparar e que falharam a reparar. A abordagem lesão esfera de vidro que descrevemos aqui permite identificar essas células. Ao efectuar a conta de vidro ferindo é importante que ao fazer esforço para maximizar o número de células ferido as lesões em si são tão leve células não recebem vários hits. Isto é importante, uma vez que irá causar lesões repetidas as células (selectivamente essas que são pobres em reparação) morrer e separar as lamelas durante o procedimento. Isso resultaria em uma subestimação de células que não conseguiram reparar. Também é importante a fim de evitar qualquer rolamento das esferas de vidro durante o manuseamento e lavando as lamelas para eliminar qualquer nova lesão queirá resultar numa coloração vermelha (células positivas falsas). Esta abordagem para ferimentos também permite o acompanhamento de uma população de células para a translocação da proteína da superfície da célula de interesse, como tem sido demonstrado aqui para lisossoma proteína associada à membrana de um (LAMP1). Ao monitorizar apenas as proteínas da superfície das células localizadas por imunofluorescência um requisito fundamental é a utilização de anticorpos que se ligam ao domínio extracelular da proteína de interesse e immunolabel células antes da fixação. Isto permite comparar o nível LAMP1 na membrana celular em células lesionadas com células não lesadas ou entre as diferentes populações de células. Embora este protocolo foi ilustrada usando LAMP1, ele pode ser aplicado a qualquer outra proteína de escolha para o qual existe um anticorpo específico para o domínio extracelular da proteína. Quando a lesão desencadeadas lisossomal exocitose deve ser comparada entre duas linhas de células que não tenham sido estabelecidos para ter taxa basal semelhante (não iniciada por uma lesão) de lisossomal exocitose, LAMP1 coloração da superfície celular nas células ilesas também devem ser medidos. Para isto uma amostra adicional é tratado apenas como exemplo C2, excepto que, no passo 9, as células devem ser incubadas com o anticorpo primário. Isto proporcionará uma medida da taxa basal de lisossomal exocitose.

Para o protocolo de lesão a laser das membranas celulares são feridos por um único fóton laser pulsado nsec alta intensidade. Ferindo é realizada na presença de células corante impermeabilizante cuja fluorescência aumenta mediante endomembranar de ligação (por exemplo, FM 1-43). Assim, na sequência da célula associada a fluorescência do corante proporciona uma medida para o tempo tomado pela célula para curar ^3. Lesão Laser faz com que o corante FM para entrar na célula e se ligam endomembranes, resultando em aumento na FM corante fluorescente. Reparação das membranas celulares danificadas impede ainda mais a entrada de corante para dentro da célula. Assim, para uma célula que as reparações, a fluorescência do corante atinge um patamar, enquanto que para uma célula que não reparar corantefluorescência aumenta continuamente.

Imagens de células vivas de eventos subcelulares individuais envolvidas no reparo da membrana celular requer monitoramento da membrana celular em alta relação sinal-ruído. Microscopia de reflexão interna total de fluorescência (TIRF) é uma abordagem adequada para eventos de superfície celular de imagem em um sinal de alta para ruído ^14-16. Existem vários sistemas de TIRF disponíveis comercialmente e qualquer um destes sistemas compatíveis com imagem de células vivas pode ser utilizado. Além disso, descrevemos as abordagens para a criação de microscópios TIRF caseiros em outros lugares ^17,18. Independente da configuração TIRF há uma necessidade de se estabelecer abordagens que permitam monitorar vários destinos das vesículas subcelulares antes e depois da lesão. Em outros lugares nós fornecemos uma discussão dessas abordagens que permitem a monitorização natureza, duração e grau de fusão de cada lisossoma ^19. Para monitorar lesão desencadeadas exocitose de FITC-dextrano marcado lysosomes descritos no protocolo 4 o elemento-chave a observar são os flashes. O flash envolve libertação do FITC dextrano contido no lisossoma indivíduo em um único passo, resultando em propagação lateral da fluorescência. Embora cada um de flash normalmente indica uma fusão única de exocítico lisossomo, é importante estabelecer isso monitorando quantos lisossomos estão presentes no local de fusão, antes e após o flash.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS