Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

Summary

El proceso de las células de curación heridas implica el tráfico de proteínas específicas y los compartimentos subcelulares al sitio de la lesión de la membrana celular. Este protocolo describe ensayos para controlar estos procesos.

Abstract

La capacidad de las células para curar heridas es un proceso celular fundamental, pero los mecanismos celulares y moleculares implicados en las células curativas heridos son poco conocidos. Aquí se describen ensayos para controlar la capacidad y la cinética de la curación de las células cultivadas después de una lesión localizada. El primer protocolo describe un método de punto final a base de evaluar simultáneamente la capacidad de reparación de la membrana celular de cientos de células. El segundo protocolo describe un enfoque de formación de imágenes en tiempo real para controlar la cinética de la reparación de la membrana celular en las células individuales después de una lesión localizada con un láser pulsado. Como las células curativas heridos implica el tráfico de proteínas específicas y compartimentos subcelulares a la zona de la lesión, el tercer protocolo describe el uso de la aproximación al punto final más arriba basado para evaluar el tráfico de uno de esos eventos (exocitosis lisosomales) en cientos de células dañadas de forma simultánea y el último protocolo describe el uso de lesión láser pulsado junto con micros TIRFcopia para monitorear la dinámica de los compartimentos subcelulares individuales en las células dañadas en alta resolución espacial y temporal. Si bien los protocolos siguientes describen la utilización de estos enfoques para estudiar la relación entre la reparación de la membrana celular y exocitosis lisosomal en las células musculares cultivadas, que se pueden aplicar como tal para cualquier otra célula en cultivo adherente y compartimento subcelular de elección.

Introduction

La membrana de la célula mantiene la integridad de las células, proporcionando una barrera entre la célula y el medio ambiente extracelular. Un estímulo químico, eléctrico o mecánico que excede el umbral fisiológico normal, así como la presencia de los patógenos invasores puede cada resultado de lesiones a la membrana celular y desencadenar una respuesta celular posterior para reparar esta lesión. Para sobrevivir a estas lesiones a la membrana celular, las células poseen un mecanismo eficiente para la reparación. Este mecanismo es dependiente de calcio e implica el tráfico intracelular de proteínas como anexinas y MG53, entre otros, así como los compartimentos subcelulares tales como endosomas, lisosomas, vesículas de Golgi y mitocondrias derivadas de la membrana de la célula lesionada ^1-7. Sin embargo, los detalles de la secuencia de eventos moleculares y subcelulares involucrados en la reparación de la membrana celular dañada sigue siendo poco conocida.

Respuesta de reparación de la célula se puede segregar en el oídomente y las respuestas tardías. Las primeras respuestas, que se producen dentro de segundos a minutos escala de tiempo, son tremendamente importante en la determinación de la naturaleza de las respuestas tardías que conducen a la reparación celular éxito o muerte celular. Ensayos de punto final basado en el análisis bioquímico y celular a granel han ayudado a establecer la participación de los procesos moleculares y celulares de la reparación. Pero, debido a la heterogeneidad y la rapidez de respuesta de reparación celular, ensayos de punto final no proporcionan los detalles cinéticos y espaciales de la secuencia de eventos que conducen a reparar. Los enfoques que permitan lesión controlada de la membrana celular y permiten el seguimiento de la reparación de la membrana celular y subcelular respuestas asociadas a una alta resolución espacial y temporal son ideales para este tipo de estudios. En este caso, se han presentado este tipo de enfoques. Dos de los protocolos describen enfoques para controlar la cinética en tiempo real de reparación de la membrana celular y las respuestas subcelulares asociados con el proceso de reparación en células vivas siguientes inj láserury. Como complemento a estos ensayos basados ​​en imágenes de células vivas, los ensayos de punto final también se han descrito que proporcionan una medida basada en la población para la reparación de la vigilancia de las células individuales y las respuestas asociadas subcelulares. Para demostrar su utilidad estos enfoques se han utilizado para vigilar el tráfico y exocitosis de lisosomas en respuesta a la lesión de la membrana celular.

Protocol

1. Imágenes de células de reparación de membrana Usando granel (grano de cristal) Herir

Este protocolo permite el marcado por separado las células dañadas y las que no cicatrizan. La cuantificación de estas poblaciones de células requiere el uso de tres condiciones: 1. Prueba (C1) - Las células se dejan reparar en presencia de Ca ^{2 +,} 2. Control de 1 (sin lesión C2) - Las células se incubaron en presencia de Ca ^{2 +,} pero no heridos, y 3. Control 2 (sin reparación C3) - las células se les permite reparar en ausencia de Ca ^{2 +.}

1. Se cultivan las células a> 50% de confluencia en tres cubreobjetos estériles y lavar C1 y C2 dos veces con CIM a 37 ° C y C3 con PBS a 37 ° C y cubreobjetos de transferencia de juntas tóricas de silicona.
2. Añadir 100 l de solución de dextrano FITC precalentado en CIM en C1 y C2 o en PBS en C3.
3. Herir membrana plasmática en C1 y C3 por suaves ondulaciones 40 mg de perlas de vidrio sobre el portaobjetos a temperatura ambiente por cubreobjetos inclinación manualmente hacia atrás ysucesivamente 6-8 veces en un ángulo de 30 °.
   Nota: Para las lesiones leves, asegúrese de que las cuentas de vidrio se distribuyen de manera uniforme, minimizando las lesiones repetidas. Para mejorar la reproducibilidad de lesiones entre las muestras, realización simultánea de la lesiones de perlas de vidrio de las diferentes muestras que se van a comparar.
4. Evitar más de rodadura de cuentas, transferir todos los cubreobjetos a una incubadora a 37 ° C en ambiente de CO ₂ y permitir la reparación de proceder durante 5 min.
5. Sin dejar que las bolas rueden, retire las cuentas de vidrio y FITC dextrano por lavado con CIM (C1 y C2) o PBS (C3) a 37 ° C.
6. Lugar cubreobjetos de vuelta en el ring y añadir 100 l de solución precalentada lisina fixable dextrano TRITC en CIM en C1 y C2 o en PBS en C3.
7. Incubar a 37 ° C durante 5 min a temperatura ambiente de CO _2.
8. Lavar dos veces con cubreobjetos precalentado CIM y fijar con 4% PFA durante 10 minutos a temperatura ambiente.
9. Lavar dos veces con PBS y se incuba durante 2 min a temperatura ambiente en el reactivo de Hoechst.
10. Lave samples dos veces con PBS, montar en una diapositiva utilizando medio de montaje y células de imagen usando un microscopio de epifluorescencia.
11. Usar células de C2 para determinar la intensidad de la tinción de fondo rojo y verde, y utilizar este valor para el umbral de los canales rojo y verde para todas las muestras (C1-C3).
12. Puntuación número total de células que son a) verde (lesionado y reparado) yb) de color rojo o rojo y verde (lesionado, pero no pudieron reparar) en muestras C1 y C3.
13. Conde> 100 células verdes para cada condición y expresar la fracción de células que han fallado para reparar como un porcentaje de todas las células lesionadas (verde y rojo).

2. Imágenes en vivo de la cinética de la reparación de la membrana de la célula después de la lesión con láser

1. Lavar las células con precalentado CIM y luego poner el cubreobjetos en CIM con el tinte FM.
2. Coloque el cubreobjetos en un soporte en la incubadora de etapa superior se mantiene a 37 ° C.
3. Seleccione una región de 1-2 mm ² de la membrana celular, y para irradiar <; 10 mseg con el láser pulsado. Atenuar la potencia del láser a través del software para el 40-50% de la potencia de pico. Potencia óptima permite lesión consistente, pero no letal y esto debe ser determinado por ensayo y error para cada instrumento individual y célula de la línea que se utiliza.
4. Para supervisar la reparación, la imagen cada 10 segundos en epifluorescencia y campo claro, comenzando antes de la lesión y continuar durante 3-5 min después de una lesión.
   Nota: Para control de reparación, repita los pasos 2.1 a 2.4 con las células dañadas en PBS que contenía colorante FM.
5. Para cuantificar la cinética de reparación, medir FM celular colorante fluorescente y trazar el cambio en la intensidad (ΔF/F0) durante el curso de formación de imágenes. Estos datos deben promediarse durante más de 10 células de cada condición y se representa como promedio o el valor de la celda individual, según sea necesario.

3. Imaging granel (grano de cristal) lesión inducida Lysosomal Exocitosis

Las muestras incluyen siguientes células cultivadas hasta> 50%confluencia: 1. Test (C1) - Las células se permiten reparar en la presencia de Ca ^{2 +,} 2. Control de 1 (C2; Ninguna lesión) - Las células no lesionadas ni incubadas con el anticuerpo primario, y 3. Control 2 (C3; Ninguna reparación) - Las células se permiten reparar en ausencia de Ca ^{2 +.}

1. Lave cubreobjetos C1 y C2 dos veces con CIM a 37 ° C y C3 con PBS a 37 º C y transferirlos en silicona las juntas tóricas.
2. Añadir 100 l de precalentado lisina fixable dextrano TRITC en CIM en C1 y C2 y C3 en PBS.
3. Herir membrana plasmática en C1 y C3 como en el paso 1.3.
4. Evitar más de rodadura de cuentas, transferir todos los cubreobjetos a una incubadora a 37 ° C en ambiente de CO ₂ y permitir la reparación de proceder durante 5 min.
5. Retire las perlas de vidrio y TRITC dextrano mediante el lavado de los cubreobjetos en medio de crecimiento frío, asegurando de nuevo sin rodadura de las perlas de vidrio en las células.
6. Enjuagar los portaobjetos dos veces con medio de crecimiento frío y la transferencia a las juntas tóricas.
7. Para C1 y C3, Añadir 100 ml de rata anticuerpo anti ratón LAMP1 en medio de crecimiento completo de frío y añadir el, medio de crecimiento completo fría para C2.
8. Para permitir la unión del anticuerpo cubreobjetos se incuba durante 30 min a 4 ° C.
9. Lavar los cubreobjetos tres veces con CIM frío y corregir todos los cubreobjetos con PFA al 4% durante 10 min a TA y luego enjuague 3x con la CIM.
10. Incubar todos los cubreobjetos en 100 l de solución de bloqueo durante 15 min a TA
11. Incubar todos los cubreobjetos en 100 l Alexa Fluor 488 anticuerpo anti rata durante 15 min a 4 ° C.
12. Lavar dos veces con PBS y se incuba durante 2 min a RT en Hoechst.
13. Lavar las células dos veces con PBS, montar en una diapositiva utilizando medio de montaje y la imagen usando un microscopio de epifluorescencia.
14. El uso de imágenes de células C2, determinar la tinción inespecífica de fondo en el rojo (dextrano TRITC) y verde (Alexa Fluor 488 anticuerpos) canales y utilizar estos valores de tinción de fondo con el umbral de los canales rojo y verde para todas las muestras (C1-C3). </ Li>
15. Utilice los> 100 marcados con rojo células de C1 y C3 para medir la intensidad de la tinción LÁMPARA1 (verde) en células lesionadas. Para un experimento exitoso la tinción LÁMPARA1 en las células de C3 será significativamente menor que en las células de C1.

4. Imágenes en vivo del daño celular membrana Se activa el Tráfico subcelular

1. Fluorescently etiquetar el compartimento de interés transfectando reportero apropiado (por ejemplo CD63-GFP para lisosomas ⁸⁾ o mediante el uso de colorantes fluorescentes ^9.
2. Para lisosomas etiquetado con colorante fluorescente, incubar las células cultivadas a 50% de confluencia en medio de cultivo conteniendo FITC-dextrano
3. Permitir dextrano a ser endocitosis durante 2 horas (o más largo, según sea necesario para el etiquetado suficiente endosomal con dextrano por la línea celular de interés) en la incubadora de CO _2.
4. Lavar las células con medio de cultivo y se incuban precalentadas en ella durante 2 horas en una incubadora de _CO2 para permitir a todosendocitosis dextrano a acumularse en el lisosoma.
5. Antes de imágenes, enjuague el cubreobjetos precalentado CIM y montar en un soporte de portaobjetos en la incubadora de etapa superior a 37 ° C.
6. Realizar campo amplio (para el movimiento a lo largo de la célula) o TIRF (movimiento en la superficie celular y la exocitosis) de imágenes - las células que no tienen abarrotadas FITC dextrano lisosomas marcados son ideales para obtener imágenes de los movimientos y la exocitosis de los lisosomas individuales.
7. Alineación de los láseres TIRF para microscopio de imagen: Use 60X o 100X objetivo con> 1,45 NA. Configure el ángulo de incidencia del rayo láser TIRF utilizando el enfoque del fabricante.
8. Lesionar la membrana celular mediante la irradiación de una región pequeña (1-2 mm ²⁾ de <100 ms, con el láser pulsado a 40-50% de atenuación.
9. Para monitorear la respuesta del lisosoma a la celda de lesiones, celdas de imagen a los 4-6 cuadros / seg durante al menos 2 minutos o más dependiendo de la dinámica de la exocitosis en las células de interés.

Representative Results

Protocolos que se describen aquí para obtener imágenes de células individuales son para controlar la capacidad y la cinética de la reparación de la membrana celular (Protocolos 1 y 2) y el tráfico subcelular y fusión de lisosomas durante la reparación (Protocolos 3 y 4).

Protocolo 1 muestra un ensayo mayor que permite el marcado todas las células dañadas y la identificación de las células dañadas que no pudieron reparar. Los resultados en la Figura 1 muestran que mientras que las células no dañadas (Figura 1A) permanecen sin etiqueta, las células dañadas por cuenta de vidrio en presencia de FITC-dextrano se etiquetan verde (Figuras 1B y 1C). Cuando las células se les permite reparar en la presencia de Ca ^{2 +} la mayoría de las células (verde) heridos logran reparar y no están marcadas (rojo) por TRITC dextrano (Figura 1B). Cuando las células se les permite reparar en ausencia de ^{Ca2 +,} la mayoría de las células lesionadas también están etiquetados rojo por el dextrano TRITC (Figura 1C). Las células que no fueron lesionados no muestran el marcaje con el dextrano TRITC. Por lo tanto, en cualquier muestra dada cuantificar el número de células sólo verde con la etiqueta proporciona una medida de las células que fueron heridos por perlas de vidrio y reparado, mientras que cuantifica el número de dobles células (rojo y verde) etiquetados proporciona una medida de las células que fracasaron para reparar las lesiones.

Protocolo 2 describe la evaluación de la cinética de la reparación de la membrana celular mediante el control de la entrada de colorante de FM en la célula. Cuando se incuban en tintes FM, células intactas muestran la tinción de la membrana celular (Figura 2A antes de la lesión del panel WF). Después de una lesión localizada de láser de colorante de la membrana celular de FM comienza entrar en la célula y endomembranes, lo que provoca un aumento repentino de FM tinte de fluorescencia (Figura 2B) de unión. Como la capacidad de la membrana celular para reparar después de la lesión con láser es dependiente de Ca ^{2 +,} una célula lesionado en presencia de Ca ^{2 +} es able para reparar, lo que provoca la entrada de colorante FM (y por lo tanto aumentar en celular FM tinte de fluorescencia) cesar dentro de un minuto después de la lesión (Figura 2A, panel superior, Figura 2B, línea azul, y animado Video 1 y Figura 2). Por el contrario, una célula permitido para reparar en ausencia de Ca ^{2 +,} falla para reparar, lo que resulta en la entrada de tinte continua y por lo tanto incremento continuo en FM colorante de fluorescencia incluso 4 min después de la lesión (Figura 2A, panel inferior, Figura 2B, línea roja y animado Video 2 y Figura 2). Por lo tanto, la reparación de la membrana celular conduce a un estancamiento de la tinción de colorante FM, mientras que la falta de reparación de la membrana celular provoca la entrada de tinte permanente que no logra estabilizarse.

Protocolo 3 describe el uso de granel (perlas de vidrio) lesión enfoque para controlar la translocación de la superficie celular de las vesículas y proteínas en respuesta a una lesión. Aquí ªcélulas E son heridas en la presencia de dextrano TRITC por lo tanto, mientras que las células no lesionadas no están etiquetados rojo (Figura 3A), pero todas las células lesionadas se etiquetan rojo (Figuras 3B y 3C). Las células no dañadas que no son tratados con el etiquetado a nivel espectáculo anticuerpo primario de fondo para LAMP1 superficie celular (panel LAMP1 Figura 3A). Sin embargo, cuando las células se lesionan y se dejan curar en presencia de calcio, se someten a los lisosomas exocitosis y por lo tanto hay mayor nivel de tinción LAMP1 en la superficie de los (rojos marcados) células dañadas (Figura 3B). Este aumento en el etiquetado LÁMPARA1 superficie de la célula es mucho menor en las células que se permite curar en ausencia de calcio (Figura 3C). Esto demuestra la naturaleza de calcio regulados de la exocitosis lisosomales y por lo tanto el aspecto superficial de LAMP1. Así, tanto, que cuantifica el número de células con tinción LÁMPARA1 superficie celular alta, así como la medición del nivelde tinción LÁMPARA1 superficie celular en las células lesionadas individuales, proporcionar medidas para la capacidad de la célula de someterse a la lesión desencadena la exocitosis lisosomal.

Protocolo 4 se puede utilizar para la supervisión directa de la cinética, la naturaleza y ubicación de fusión de lisosomas individuo en respuesta a la lesión de la membrana celular. Las células se lesionan por el láser pulsado y la superficie de células lisosomas son imágenes por proyección de imagen TIRF, que permite la vigilancia lesión desencadena la exocitosis de lisosomas en células individuales (Figura 4A y animado de vídeo 3). Figura 4A muestra una célula (se indica en verde) visualizado por de imágenes de contraste de fase (panel izquierdo) y por microscopía TIRF (panel central), antes de la lesión. Panel de la derecha muestra la imagen TIRF de la misma celda 105 segundos después del ataque. Varios lesión desencadena respuestas de los lisosomas se describen en las figuras 4B-E. Figura 4B muestra la lesión provocó la contratación de un lisosoma (marcadopor el círculo gris) a la membrana celular, seguido por exocitosis (animada de vídeo 4 y Figura 4). Este lisosoma no es visible en la imagen TIRF antes de la lesión (Figura 4B: panel de -2,5 s), pero después de una lesión del lisosoma llega a la membrana celular y se vuelve detectable (Figura 4B: panel de 102,5 s), como la vesícula se mueve más cerca de la membrana celular es mejor emocionados por la iluminación TIRF y el dextrano fluorescencia FITC lisosomal alcanza el valor máximo cuando el poro de fusión se abre provocando la neutralización del pH lisosomal y así desatenuación de la fluorescencia de dextrano FITC (Figura 4B: El panel de 104,8 s). Posteriormente, el dextrano se descarga de la vesícula al exterior de la célula causando fluorescencia FITC a extenderse lateralmente y la fluorescencia de vesículas a disminuir gradualmente (Figura 4B: panel de 107,1 s). En la segunda categoría, los lisosomas (marcados con círculo naranja, animado Video 5 Figura 4) está presente antes de la lesión (Figura 4C: Panel -2,5 s), permanece allí en la membrana (Figura 4C: Panel de 91 s) hasta que los exocytoses vesícula. Aquí el lisosoma exocitado parcialmente (Figura 4C: Panel 93 s), dejando detrás de algunas de dextrano FITC en la vesícula después de la fusión (Figura 4C: 94,5 s). Las tercera y cuarta categorías de vesículas no se fusionan a la membrana. El lisosoma se muestra en la Figura 4D (marcada por el círculo azul) se mueve axialmente hacia y lejos de la membrana celular (animada de vídeo 6 y la Figura 4). Este lisosoma no es visible en la membrana celular antes de la lesión (Figura 4D: panel de -2,5 s), pero al acercarse a la membrana celular después de una lesión que se hace visible por microscopía TIRF (Figura 4D: panel de 59,3 s). Se alcanzó más cercana a la membrana de la célula (Figura 4D: panel de 59,6 s) y luego se aleja sin fusión (Figura 4D: panel 63,7 s). El lisosoma en la cuarta categoría llega cerca de la membrana y se mueve horizontalmente a lo largo de la membrana celular (área marcada por el cuadro de color púrpura en la Figura 4A, animada de vídeo 7 y la Figura 4). Figura 4E (panel de 8,7 s) muestra la llegada de la lisosoma , que luego se mueve a lo largo de la membrana y puede ser visto en la secuencia de imágenes después de la lesión (Figura 4E: paneles 10,7, 11,9, 12,8, 18,8 s). Basado en la descripción anterior la cuantificación de la intensidad de fluorescencia FITC dextrano de cada lisosoma - fusión (Figuras 4B y 4C), moviendo axialmente (Figura 4D) o se mueve horizontalmente (Figura 4E) permite la determinación de la respuesta de lisosoma a la lesión.

Figura 1. . Celular a granel lesión de la membrana por cuentas de vidrio Imágenes muestran tinción nuclear (Hoechst, panel izquierdo), lesiones (tinción verde - FITC dextrano), las células no reparados (tinción con rojo - TRITC dextrano), y las imágenes fusionadas (Merge). (A) las células no lesionadas en presencia de calcio, (B) células células dañadas en presencia de calcio, y (C) herido en ausencia de calcio. Barra de escala 10 micras. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. . Imágenes en tiempo real de la reparación de la membrana celular en respuesta a la lesión con láser (A) Imagen de las células (destacada en naranja) antes de lesión [panel de la izquierda - campo claro (BF) yepifluorescencia (epi)], 5 seg, 1 min, y 4 minutos después de la lesión. El sitio de la lesión se indica por una flecha blanca. El panel superior muestra una célula lesionada en presencia de calcio y el panel inferior muestra una célula lesionada en ausencia de calcio. (B) Gráfico que muestra el cambio en la tinción de colorante de FM (ΔF/F0) de las células en el panel A heridas en la presencia de calcio (azul) o en ausencia de calcio (rojo). La región donde colorante de FM entra y por lo tanto, el etiquetado de fluorescencia aumentó se utilizó para la cuantificación de la intensidad de fluorescencia. Barra de escala = 10 micras). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Exocitosis lisosomal de imágenes en respuesta a una lesión mayor. Las imágenes muestran tinción nuclear Hoechst (azul), la tinción LAMP1 superficie celular (verde), TRITC dextrano (rojo) y fusión de todos los canales (overlay) de células no lesionados (A) que no estén etiquetados con el anticuerpo primario, (B) las células lesionadas permite la reparación en presencia de calcio, y (C) las células lesionadas permitidos para reparar en la ausencia de calcio. Barra de escala 10 micras. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4. Imágenes en tiempo real de la exocitosis lisosomales en respuesta a la lesión con láser. Las células con FITC dextrano lisosomas marcados resultaron heridos por un láser pulsado en presencia de calcio. (A) El límite de la celda queresultó herido se perfila (en verde): El panel de la izquierda - campo claro antes de la lesión, panel central - TIRF antes de la lesión y el panel de la derecha - TIRF 105 s después de la lesión. El lugar de la lesión se caracteriza por el cuadro amarillo, y el área representativa indicado por blancos / cajas de color púrpura y círculos de colores dentro de has en paneles SER. El color de la vesícula en la imagen de células enteras (gris, naranja y azul) se corresponde con el color en el zoom de imágenes de lisosomas individuales. Panel (B) de la izquierda muestra un gráfico para el valor ΔF/F0 para la fluorescencia FITC de una vesícula reclutado después de la lesión. Panel de la derecha muestra las instantáneas de la vesícula antes de la lesión (-2,5 s), prefusión (102,5 s), la fusión (104.8 s) y postfusion (107,1 s). Panel (C) de la izquierda muestra un gráfico para el valor ΔF/F0 para la fluorescencia FITC de una vesícula atracado antes de la lesión. Panel de la derecha muestra las instantáneas de la vesícula antes de la lesión (-2,5 s), prefusión (91 s), la fusión (93 s) y postfusion (94,5 s). (<panel de fuerte> D) de la izquierda muestra un gráfico para el valor ΔF/F0 para la fluorescencia de FITC de una vesícula mover axialmente (hacia y fuera de la membrana celular). Panel de la derecha muestra las instantáneas de la vesícula antes de la lesión (-2,5 s), y después de la lesión en la posición diferente cerca de la membrana en 59,3, 59,6 y 63,7 s. (E) Las instantáneas de la vesícula que se movía horizontalmente a lo largo de la membrana celular en varias posiciones antes de la lesión (-2,5 s) y después de una lesión en el (8,7, 10,7, 11,9, 12,8 y 18,8 s). La barra de escala (A = 10 m, B, C, D, E = 1 m). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Animated vídeo 1 Figura 2: . imágenes en tiempo real de la reparación de la membrana celular en respuesta a la lesión con láser en presencia de calcio entrada colorante FM en una celda (destacada en naranja) heridos por impulsosláser en presencia de calcio. La película representa 200 imágenes adquiridas cada 2 s. La célula fue herido (región marcada por el cuadrado cian) después de marco 4. La marca de tiempo muestra el tiempo en horas: minutos: segundos: formato ms. Barra de escala = 10 micras.

Animadas de vídeo 2 Figura 2: . de formación de imágenes en tiempo real de reparación de la membrana celular en respuesta a la lesión por láser en ausencia de calcio entrada de FM colorante en una célula (destacada en naranja) heridos por láser pulsado en ausencia de calcio. La película representa 200 imágenes adquiridas cada 2 s. La célula fue herido (región marcada por el cuadrado cian) después de marco 4. La marca de tiempo muestra el tiempo en horas: minutos: segundos: formato ms. Barra de escala = 10 micras.

Animated vídeo 3 Figura 4: imágenes en tiempo real de exocyt lisosomalOsis en respuesta a la lesión por láser. Diferentes respuestas de los lisosomas en una célula (se indica en verde, de vídeo 3) heridos por láser pulsado. La película representa 2 min de las imágenes de lapso de tiempo secuenciales adquiridas por microscopía TIRF en 5 cuadros / seg. Imágenes de campo claro se adquirieron cada 20 seg. La célula se lesionó (indicado por el cuadro de cian) en 2 segundos en este vídeo. Los círculos de colores (gris, naranja y azul) y el cuadro morado marcan los lisosomas que se describen en la figura 4 y videos animados de 4-7, lo que demuestra la diversidad de sus destinos tras la lesión celular. La marca de tiempo muestra el tiempo en horas: minutos: segundos: formato ms. Barra de escala = 10 micras.

Animated vídeo 4 figura 4 muestra lisosoma exocítica marcada por el círculo de color gris que se reclutó a la membrana en respuesta a una lesión. A los 7 segundos (después de la lesión 5 seg) en este video el lisosoma se reclutó en la membrana celulary luego se funde en este sitio en 1 min y 47 seg. Barra de escala = 1 mm.

Animated vídeo 5 figura 4 muestra lisosoma exocítica marcada por el círculo naranja que estaba atracado en la membrana antes de la lesión y los fusibles en este sitio 1 min y 35 seg. Barra de escala = 1 mm.

Animated vídeo 6 figura 4 muestra los lisosomas marcados por el círculo azul en movimiento hacia y fuera de la membrana celular. Barra de escala = 1 mm.

Animated vídeo 7 figura 4 muestra una región de la célula marcada por cuadro púrpura en Video 3, donde después de una lesión a uno de los lisosomas (círculo blanco) se mueve alOng la membrana celular. Barra de escala = 1 mm.

Discussion

Lesión de la membrana celular in vivo se produce debido a una variedad de factores de estrés fisiológicos y se han desarrollado varios enfoques experimentales para imitar éstos. Estos incluyen hiriendo membrana celular de las células adherentes al quitarlas de la antena o haciendo pasar a través de un estrecho orificio ^9,10 jeringa. Después de este tipo de lesiones se curan las células en suspensión y no adherido a la matriz extracelular como lo hacen normalmente en el tejido. Y otros, tales como el uso de toxinas formadores de poros alteran químicamente la membrana celular por extracción de los lípidos tales como el colesterol, por tanto, no imitando en lesiones mecánicas in vivo ^5. Por lo tanto, el método utilizado para la lesión de las células puede afectar a lo que se puede aprender acerca de la respuesta de reparación. Esto requiere el ejercicio de precaución no sólo en la elección del ensayo de lesión de las células, sino también escoger los métodos que imitan mejor las lesiones mecánicas in vivo. Estos enfoques incluyen lesión cero (donde una monocapa de células se lesionanpor un bisturí o aguja) y cuentas de vidrio lesión (donde la lesión es causada por cuentas de vidrio se extiende sobre células adheridas). Estos enfoques son muy adecuadas para lesionar células en masa, pero no son susceptibles de formación de imágenes en tiempo real de proceso de reparación de la membrana celular. El uso de microagujas y láseres pulsados ​​para crear lesiones localizadas y bien controlados en el punto de impacto imitan la lesión mecánica y traumática in vivo y son susceptibles de formación de imágenes en tiempo real de la respuesta de reparación, pero ofrece la penetración en la reparación de una célula a la vez. Vale la pena señalar que el enfoque lesión láser pulsado es distinto del uso de la irradiación prolongada de la membrana celular con láseres nonpulsed donde la lesión de la membrana es causado por el calentamiento localizado, que se sabe que induce efectos no fisiológicas, tales como daños Photoxidative y fototérmica a lípidos de membrana y componentes citosólicos ^11.

Los protocolos descritos aquí permiten aprovechar el potencial de uno of el enfoque en masa lesión, que se basa en el uso de perlas de vidrio y uno de los método lesión localizada (láser pulsado) para el seguimiento de la capacidad, la cinética y el tráfico subcelular involucrados en la reparación de la membrana celular después de una lesión de tamaño micrométrico. Estos enfoques son mutuamente gratuito - lesión mayor permite el uso de una población de células para identificar un déficit en la capacidad de reparación y el tráfico subcelular asociado con él. Al permitir la visualización en tiempo real de reparación en las células individuales, enfoque lesión láser permite la identificación de qué paso de la reparación de la membrana celular y subcelular qué eventos están asociados con el déficit en la reparación. Este enfoque ha sido utilizado para el seguimiento de reparación de la membrana celular en organismos de mamíferos e invertebrados ^7,12,13. Sobre la base de las necesidades del experimento cualquiera de estos dos enfoques se puede utilizar por sí mismo. Sin embargo, cuando la naturaleza del déficit de reparación no se conoce el mecanismo o subcelular involucrado en Tsu proceso no conocido, utilizando una combinación de estos enfoques es útil.

Debido a la variabilidad inherente en el número de células dañadas entre las muestras en el punto final a base ensayos de lesión celular es necesario para identificar de forma independiente todas las celdas que están lesionados, que lograron reparar y aquellos que no pudieron reparar. El enfoque de la lesión de perlas de vidrio que hemos descrito aquí permite la identificación de estas células. Al llevar a cabo la cuenta de vidrio hiriendo, es importante que al hacer un esfuerzo para maximizar el número de células heridos las lesiones leves por lo que ellos mismos son células no reciben golpes múltiples. Esto es importante, ya que las lesiones repetitivas hará que las células (de manera selectiva aquellos que son buenos para la reparación) para mueren y se desprenden de la cubreobjetos durante el procedimiento. Esto daría lugar a una subestimación de las células que no se pudieron reparar. También es importante evitar cualquier rodadura de las perlas de vidrio durante la manipulación y el lavado de los cubreobjetos para eliminar cualquier nueva lesión quedará lugar a una tinción de color rojo (células positivas falsas). Este enfoque para la lesión también permite el seguimiento de una población de células para la translocación de la superficie celular de la proteína de interés, como se ha demostrado aquí para lisosoma asociada proteína de membrana 1 (LÁMPARA1). Al supervisar sólo las proteínas localizadas de la superficie celular por inmunofluorescencia un requisito clave es usar anticuerpos que se unen al dominio extracelular de la proteína de interés y inmunomarcador células antes de la fijación. Esto permite comparar el nivel LÁMPARA1 en la membrana celular en las células lesionadas con células no lesionadas o entre diferentes poblaciones de células. Mientras que este protocolo se ha ilustrado utilizando LÁMPARA1, que se puede aplicar a cualquier otra proteína de elección para los que no es un anticuerpo específico al dominio extracelular de la proteína. Cuando la lesión provocada lisosomal exocitosis necesita compararse entre dos líneas de células que no han sido establecidos para tener la dosis basal similar (no provocada por una lesión) de la exocitosis lisosomales, Tinción LÁMPARA1 superficie celular en las células no lesionadas también se debe medir. Por esta una muestra adicional se trata igual que la muestra C2, excepto que en el paso 9 las células deben ser incubadas con el anticuerpo primario. Esto proporcionará una medida de la tasa basal de la exocitosis lisosomal.

Para el protocolo de la lesión con láser de las membranas celulares son lesionados por una alta intensidad de fotón único láser pulsado ns. Hiriente se lleva a cabo en presencia de células de colorante impermeable a cuya fluorescencia aumenta a endomembrane de unión (por ejemplo, FM 1-43). Por lo tanto después de la fluorescencia celular asociada colorante proporciona una medida para el tiempo tomado por la célula para curar ^3. Lesión láser hace que el colorante de FM para entrar en la célula y unirse endomembranes, lo que resulta en aumento de la fluorescencia del colorante de FM. La reparación de la membrana celular dañada impide aún más la entrada de colorante en la célula. Por lo tanto, para una célula que las reparaciones, la fluorescencia del colorante alcanza una meseta, mientras que para una célula que falla para reparar colorantela fluorescencia aumenta continuamente.

Imágenes de células vivas de acontecimientos subcelulares individuales implicadas en la reparación de la membrana celular requiere la supervisión de la membrana celular a alta relación señal a ruido. Total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía es un enfoque muy adecuado para eventos de la superficie celular de formación de imágenes en una elevada relación señal-ruido de ^14-16. Existen varios sistemas de TIRF disponibles comercialmente y cualquiera de estos sistemas compatibles con imágenes de células vivas pueden ser utilizados. Además, hemos descrito los enfoques para la creación de microscopios TIRF caseras otras partes ^17,18. Independientemente de la configuración TIRF existe la necesidad de establecer criterios que permitan el seguimiento de diversos destinos de vesículas subcelulares antes y después de la lesión. Por otra parte, hemos aportado un análisis de este tipo de enfoques que permitan el monitoreo naturaleza, la duración y el grado de fusión de cada una lisosoma ^19. Para controlar la lesión exocitosis de FITC-dextrano marcado lysoso desencadenómes que se describen en el protocolo 4 el eje básico de observar son los flashes. El flash implica la liberación de dextrano FITC contenida en lisosoma individual en un solo paso que resulta en la propagación lateral de la fluorescencia. Mientras que cada destello suele indicar una fusión única de exocítica lisosoma, es importante establecer esto monitoreando el número de lisosomas están presentes en el lugar de la fusión antes y después de que el flash.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS	Sigma	H1387	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
HEPES	Fisher	BP410	Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)
FITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1820	2 mg/ml in CIM or PBS
Glass beads	Sigma	G8772
TRITC dextran (Lysine fixable)	Invitrogen	D1818	2 mg/ml in CIM or PBS
PFA 16%	EMS	15710	4% in PBS
Hoechst	Invitrogen	H3570	1/10 000 in PBS
FM dye	Invitrogen	T3163	1 µg/µl in CIM or PBS
FITC dextran	Sigma	FD40S	2 mg/ml in growth medium
LAMP1	Santa Cruz	sc-19992	1/300 in growth medium
Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG	Invitrogen	A21470	1/500 in blocking solution
Mounting media	Dako	S3023
Coverslips	Fisher	12-545-86
Glass bottom petridish	MatTek corporation	P35G-1.0-14-C
Silicone O ring	Bellco	1943-33315
Coverslip holder	Bellco	1943-11111
Invitrogen	A-7816
DMEM	VWR	12001-566
FBS	VWR	MP1400-500H	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Penicillin/Sreptomycin	VWR	12001-350	Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM
Chicken serum	Sigma	C5405	5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining
PBS (Ca2+ and Mg2+ free)	VWR	12001-664
Epifluorescence microscope	Olympus America, PA	IX81
TIRF illuminator	Olympus America, PA	Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)
Epifluorescence illuminator	Sutter Instruments, Novato CA	Lambda DG-4 (DG-4 30)
CCD Camera	Photometrics, Tucson, AZ	Evolve 512 EMCCD
Image acquisition and anaysis software	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Slidebook 5
Pulsed laser	Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO	Ablate (3iL13)
Stage top incubator	Tokaihit, Japan	INUBG2ASFP-ZILCS