Introduction
Hücre içi bakteri Chlamydia türlerinin neden Bulaşıcı hastalıklar cinsel yolla bulaşan hastalık, pelvik inflamatuar hastalık, körlük, zatürre ve muhtemelen ateroskleroz 1-4 dahil olmak üzere küresel sağlığı üzerinde önemli bir yük, ortaya. Bir vakuol içinden, konakçı hücre ile etkileşime Chlamydia kabiliyeti (dahil olarak adlandırılır), hücre ve ev sahibi başarılı enfeksiyonu için kritik bir belirleyicidir. Içerme chlamydia büyümesini sağlayan ve dinamik Chlamydia 5 tüm 2-3 gün gelişimsel döngüsü boyunca değiştirilmiş yeni bir patojen bölme olduğunu. Klamidyalar ve zorunlu hücre içi doğası doğrudan dahil eşsiz biyoloji eğitimi için özellikle araştırma topluluğuna sayısız zorluklarla, sunar. Büyük bir handikap verimli hücre içi Klamidya veya floresan yaklaşımla kendi eklenmesi ya görselleştirmek için yetersizlik olmuşturcanlı hücrelerde es. Bir son keşif sonunda GFP C ifade oluşturmak için bir araç ortaya çıkarmıştır trachomatis 6; Ancak bu bulgu henüz dahil belirli etiketlenmesine yol açmamıştır. Bazı teknikler bakteri ve inklüzyonlar 7,8 etiketlenmesi için tarif edilmiştir, fakat bu ışıkla ağartma olmayan spesifite, geçicilik ve duyarlılık gibi bazı eksikleri vardır. Grubumuz tarafından anahtar keşif konakçı hücreleri 9 ifade GFP kullanarak içermenin aydınlatılması için yeni bir strateji kurdu. Bu strateji, rasyonel daha büyük 520 Da 10 molekülüne dahil membran iç sızdırmazlık patlatır. Hücreler stabil belirli bir sitozolik floresan proteini (örneğin, GFP veya mCherry) ifade etmek için tasarlanmıştır zaman Chlamydia inklüzyonlar floresan onların tam dışlama yoluyla kayda değer bir açıklıkla görebilir. Bu ters görüntüleme stratejisi, tüm Chl için kapanım derhal görselleştirme sağlaramydia türleri ve havaalanı en konakçı hücreler için adapte edilebilir. Kendi programını bir göstergesi olarak, bu yöntem Chlamydia spp 9 hücresel çıkış yollarını ortaya çıkarmak ve tanımlamak için önceden kullanıldı.
Burada, biz daha fazla bu yöntem gerçekleştirilir ve içerme büyüme dinamikleri hakkında önemli nicel veriler elde etmek için istismar edilebilir gösterilmektedir. Bundan başka, etkili bir şekilde pahalı antikor bazlı sayım yöntemleri yerine kullanılabilir ve bu tür Chlamydia 11 mKate2 ifade eden diğer floresan etiketler, ile birlikte de kullanılabilir. Araçlar Bu güçlü kombinasyon yaşayan konak hücrelerin içinde klamidya içerme zarının fiziksel özelliklerinin araştırılmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Floresan ana hücre dizilerinin 1. Üretim
- / Oyuk 2 x 10 6 hücre, 6-yuvalı plakalar üzerinde gün 1. Plaka 293T hücreleri (ya da daha başka retroviral paketleme çizgisi) ~% 75 konfluent ertesi gün için. Eğer arzu edilirse, her bir retrovirüs için tabak çift kuyu kullanılır.
- 2. Gün aspire hücreleri ve 2 ml ilave taze büyüme ortamı (DMEM +% 10 FBS + 2 mM L-glutamin). Lipofectamine 2000 veya benzeri bir reaktif kullanılarak ve imalatçının talimatları takip 5-8 ug retroviral vektör (GFP ihtiva eden) ve paketleme vektörünün her biri için (örn., PVSVg) ile hücrelerin transfekte.
- 1 ml büyüme ortamı ile orta yerine, daha sonra 37 ° C CO2 inkübatöründe 4-6 st için DNA ile inkübe hücreleri, vb.
- 37 ° C CO2 inkübatöründe 48 saat süreyle inkübe hücreleri.
- 3. Gün Plaka hedef hücreler (örn., HeLa) 10 5 hücre yaklaşık yoğunluğunda 6 oyuklu plakalar üzerine / kuyu olmak ~% 50 konfluentertesi gün. Ters bir mikroskop GFP floresan izleyerek 293T hücrelerinde pozitif transfeksiyon doğrulayın.
- 4. Gün Collect retrovirüs-ihtiva eden bir 0.45 mikron selüloz asetat şırınga filtre ile süpernatan bir pipet kullanılarak ve filtre 293T hücrelerinde rahatsız süpernatantlar.
- HeLa hücreleri Ortamı çıkarın ve 16 ug / ml ihtiva eden 0.5 ml polybrene büyüme ortamı ilave edin. Hücrelere süzüldü retrovirüs ~ 0.5 ml ilave akıllı-damla ve 24 saat boyunca 37 ° C CO2 inkübatöründe inkübe hücreleri. 4 ° C 'de (de yinelenen, örn) kalan herhangi bir retrovirüs saklayın.
- Yinelenen kuyuları seri kalan retroviral parçacıklar ile enfekte için ekstra retrovirüs adımı yineleyin 1.7 üretmek için yapılmış ise Günü 5..
- (Örneğin, 500 ug / ml neomisin) 10 cm'lik bir çanak içeren seçim antibiyotik olarak 1: Gündüz 6. Geçiş HeLa hücreleri 1 transfekte edildi.
- Seçim Antibiyotik varlığında tekrar büyümeye kalıt aktarımlı hücrelerin için yeterli bir süre bekleyinHücreler ayıklama antibiyotiğin daha düşük bir konsantrasyonu ile standart teknikler tarafından yayılan olabilir sonra tlc, (örn., 200 ug / ml neomisin).
Not: Gerekirse Hücreler de klonal, şu anda ideal bir parlaklık için seçilmiş olabilir.
GFP-ifade Chlamydia trachomatis 'in 2. Üretim
- 2x CaCl2 tamponu (20 mM Tris pH 7.4, 100 mM CaCl2) ile 4SP tamponu (0.4 M sukroz, 16 mM Na 2 HPO 4) hazırlayın.
- Gün 1. çözülme dondurulmuş C. trachomatis stok buz üzerinde ve hemen 50 ul 2x CaCl2 tampon içine 10 ul bakteri sulandırmak. 3 ug plazmid DNA ekleyin (örn.,, PASK-GFP-mKate2-L2), iyice karıştırın ve 25 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
- Bu adım sırasında, bir santrifüj tüpüne McCoy hücreleri, T-75 balon trypsinizing konakçı hücrelerin hazırlanması. 5 dakika boyunca 50 xg'de hücre süspansiyonu santrifüj ve supernatant atın. Resuspen1x CaCI2 tampon uygun hacimde d hücre topağı 4 x 10 7 hücre / ml bir nihai konsantrasyon elde edilmiştir.
- (Adım 2.2) 30 dakika süreyle inkübe edildikten sonra, transformasyon karışımı borusu (toplam hacim 200 ul) ile McCoy hücreleri hazırlandı 100 ul ve 25 ° C'de ek bir 20 dakika inkübe edilir. 2 ml büyüme ortamı ile bir 6-yuvalı plaka ve kaplama tek bir kuyusuna bu dönüştürülmüş hücre karışımı 100 ul ekle. 2 gün bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
- 3. Gün Lyse McCoy hücreleri C ile enfekte bükülmüş 1000 ul pipet ucu ile hücreleri, 1 ml dH 2 O ile orta yerine ve kazıyarak trachomatis. C. verimli hücre erimesi ve serbest bırakılması için 5 kez 1 ml 4SP tamponu ekleyin ve ~ 27.5 G iğne ile süspansiyon geçmektedir trachomatis.
- C ihtiva eden hücre lizatı devri 2 mi Taze kaplama MM konfluent tek tabaka ihtiva eden bir T-75 balonuna trachomatisoy hücreleri; (FBS'siz) 8 ml DMEM ekleyebilir ve C izin vermek için 25 ° C'de 2 saat boyunca inkübe trachomatis hücrelerine yapışma.
- Aspire hücreler 10 U / ml penisilin G ve 1 ug / ml siklohegzimid ile desteklenmiş taze büyüme ortamı eklemek. 37 ° C CO2 inkübatöründe 48 saat boyunca balon inkübe edin.
- 4. Gün hücreleri enfekte ve inklüzyonlar anormal Klamidya ihtiva ışık mikroskobu ile doğrulayın. 2'den büyük mikron çapında olan kapanım içinde halka benzeri nesneler gibi standart ışık mikroskobu üzerinde parlak vakuol ve anormal Chlamydia organları olarak kapanımlar tanımlayın.
- Bir süspansiyon içine hücreleri 2 ml dH 2 O ile orta yerine ve kazıma tarafından Gün 5. lizleyin kültürü. 2 ml 4SP tamponu ekleyin ve ~ 27.5 G iğne ile 5 kez süspansiyon geçmektedir.
- Bir 6-çukurlu plaka içindeki tek bir kuyuda McCoy hücreleri taze tek tabaka enfekte hücre lizatı 2 ml kullanın. 25 ° C, aspirat 2 saat süreyle lisatı ile inkübe hücreleri ve taze büyüme eklemePenisilin G ve sikloheksimid içeren ortam.
- Hücrelerin genel sağlığına bağlı olarak 3-5 gün boyunca 37 ° C CO2 inkübatöründe inkübe hücreleri.
- Tekrarlama (anormal cisimlerin yoksun) Normal görünümlü inklüzyonlar ortaya çıkmıştır kadar 6 plaka taze kuyulara 2,9-2,10 bir veya birkaç kez, gerektiğinde, Pasajlanması kültürleri yineleyin. Şu anda kontrol etmek ters bir floresan mikroskop kullanmak C. trachomatis mKate2 (kırmızı) ifade eder.
- T-150 şişelerinde yetişen enfekte McCoy veya HeLa hücrelerinden Chlamydia transformantların hasat örneğin yüksek titre klamidyal stoklarının oluşturulması için enfekte kültürler, büyütmek.
3. Chlamydia ile Hücreler bulaşmasını
- IFU tespit edilmesi ve çok-yuvalı tarama için, örneğin cam alt yemekler ya da oda slaytlar yüksek çözünürlüklü görüntüleme için, ya da 24 oyuklu plakalar için istenen kültür kabı Plaka GFP-HeLa hücreleri,.
- Fro ÇözülmeC içeren zen tüp trachomatis, C. muridarum veya C örnek İçişleri Bakanlığı 1 = buz üzerinde pneumoniae ve enfeksiyon istenen çokluğu (İçişleri Bakanlığı) için HBSS sulandırmak.
- Kullanılacak belirli Chlamydia zorlanma dayalı statik veya santrifüj destekli ya enfeksiyonları gerçekleştirin.
- C ile enfeksiyonlarında trachomatis LGV serovar L2 veya C muridarum, HBSS GFP-HeLa hücreleri yıkayın ve 25 ° C'de 2 saat süre ile seyreltilmiş bakteri ile inkübe edin. Aspire edin ve HBSS ile yıkama hücreleri ve 37 ° C CO2 inkübatör büyüme ortamında hücrelerin inkübe edin.
- C. trachomatis serovar D veya C ile enfeksiyonlarında pneumoniae, HBSS GFP-HeLa hücreleri yıkamak ve hücrelerin seyreltilmiş bakteri ekleyin. Bir tezgah üstü santrifüj içinde sallanan bir kova rotor eki bir multiwell plaka tutucu multiwell plaka ya da (bir multiwell plaka kapağında bant ile güvence altına) cam alt çanak yerleştirin.
- 1 saat boyunca 25 ° C'de 900 x g'de santrifüj hücreleri. 1 saat boyunca 37 ° C CO2 inkübatör santrifüj ve yerine kültür damarları çıkarın.
- Aspire hücreleri biyogüvenlik kabini, HBSS ile iki kez hücreleri yıkayın ve taze besi ekleyin. 37 ° C CO2 inkübatör yerleştirin hücreleri.
Chlamydia İçermelerin 4. Canlı Hücre Görüntüleme
- CO 2 inkübatör Chlamydia bulaşmış GFP-HeLa hücreleri çıkarın ve fenol + 5 kırmızı% FBS'siz RPMI ile orta yerine.
- 20X ya da daha yüksek yağ objektif kullanarak bir ters flüoresan mikroskop (Nikon Eclipse Ti-E veya benzeri) üzerine monte hücreleri.
- Büyük kara delikler (Klamidya kapanımlar) içeren yeşil hücreler: görüntüleme yazılımı (Volocity 6 veya benzeri) kullanarak, odaklanmak ve tespit Chlamydia GFP-HeLa hücreleri enfekte.
- Mark görüntüleme yazılımı kullanarak ilgi Chlamydia ile enfekte olan hücreleri içeren bölgelerin xyz yerleri (Volocity 6 veya benzeri). El XY Sahne görünüm modunda süre 'Puanları ekleyerek' Bu gerçekleştirin. Bu şekilde, xyz koordinatlar her işaretli yeri için kaydedilir.
- Toplama Kurulumu iletişim kutusunda, yeşil (GFP, HeLa sitosol) ve kırmızı (mKate2, C. trachomatis) kanalları ve kanal başına yeni çerçeveler her 5 dk hızında elde etmek yazılımı yapılandırın.
- Protokol "Yakalama / Kaydet" butonuna tıklayarak, yukarıda girilen edinimi kullanarak görüntü dizisi edinin.
Canlı hücreler Eklenmesi Büyüme Parametrelerinin 5. kantitasyonu
- İstenilen zamanlarda enfeksiyon sonrası (örn., 24, 48 hpi) Chlamydia inkübatör GFP-HeLa hücreleri enfekte kaldırmak ve ters floresan mikroskop monte. Not: Bir yüksek NA ile 20X veya 40X hava hedefi 24-kuyucuğu için en uygun olduğunu ve 40X petrol hedefi haznesi slaytlar için tavsiye edilir. Bu eşek için her iki alt tabaka üzerinde hücreleri büyümekay.
- Inklüzyonlar maksimum çapı altındadır hücrelerin Midplanes odaklanın ve net kenarları verim.
- Her bir oyuğa (oyuk başına en az 10) birçok alanları için görüntüler elde; kuyular genellikle çoğaltır veya deneysel değişkenleri temsil etmektedir.
- Gözle (kapanım GFP-HeLa hücrelerinde siyah bölmeleri olan), elle kapanım sayısını numaralandırmak veya otomatik olarak kapanımlar tanımlamak ve saymak için görüntüleme yazılımı algoritmaları kullanır.
- Floresan yoğunluğu ile GFP-HeLa hücreleri bul (komutunu 'Nesneler Bul') ve hücrelerin göreceli yoğunlukları dayalı floresan eşik yoğunluğunu ayarlayın.
- Bu sadece 5'inden um 2 tutmanın büyüklüğü yönergeleri kullanarak Filtre, seçilen nesneler. Bu 'nüfus 1 "dir.
- Girdi olarak 'nüfusu 1' kullanarak komuta 'Nesneler Holes doldurun' uygulayın. Bu adım 'nüfusu 2' oluşturur.
- 'S çıkarınız' nüfus 1 'opulation 2 'nüfusu 3' olumlu olarak belirlenmiş Chlamydia kapanım, işaretli ürün olarak vermek üzere '.
- Örnek tutmak nesneler için, 'nüfus 3' ('Filtre Nüfus' komutu) boyut filtre uygulamak 24 saat veya daha uzun süre enfekte hücrelerde kapanım için daha büyük 25 mikron 2. Bu kapanımlar çok daha küçük gibi önce 18 saat gibi erken enfeksiyon süreleri için, set boyut filtresi, 4 mikron 2'den büyük nesneleri tutmak için. 'Kapanım' olarak adlandırılan nesnelere nüfusu Boyut filtreleme sonuçları.
- Görüntüleme yazılımı kullanarak, kantitatif örneğin görüntü veri, içerme numarası, inklüzyon boyutunu ve içerme çevresi hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sitosolik floresan proteinleri (örneğin GFP) ifade eden memeli hücrelerinin, canlı, enfeksiyonlu hücre kültürlerinde Chlamydia inklüzyonlar aydınlatma sağlamak için tasarlanabilir. Chlamydia enfeksiyonu üzerine, inklüzyonlar konakçı hücrelerde (Şekil 1) siyah noktalar olarak kolaylıkla görebilir. Floresan eksik kapanım netliği görünümü ve / veya tedaviler (Şekil 1) çok sayıda alanları arasında kapanım otomatik tanımlanması için istismar edilebilir. Floresan konakçı hücreler oluşturulduktan sonra, yeni ve güçlü bir iş akışı deneysel örneklerde klamidya enfeksiyonu düzeylerinin hızlı, kantitatif analiz için etkindir. Bir önemli uygulama, canlı, enfekte olmuş hücrelerin Chlamydia eklenmesi oluşturan birim (IFU) (Şekil 2) belirlenmesidir. Bu deneysel strateji vardır rutin alanında kullanılan imüno-prosedürleri için ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır hem zaman alıcı vemaliyetli.
Tarif edilen görüntüleme yaklaşımının diğer bir önemli özelliği, bundan başka, chlamydia inklüzyonların önemli biyolojik özelliklerinin türetilmesi için yararlanılabilir, hali hazırda herhangi bir Chlamydia türü veya suşu için uygulanabilir olduğu, ve. Bir örnek olarak, GFP-HeLa hücrelerinde bir zaman süreci analizi C ile enfekte trachomatis LGV serovar L2, C. trachomatis serovar D, C. muridarum ve C. pneumoniae 16, 24 ve 48 HPI (Şekil 3) yapıldı. Bu Chlamydia türleri ve suşları her biri için, inklüzyonlar işaretlenmiş ve uzunluğu çevre, ortalama alanı hesaplamak için analiz ve zaman zaman hücre başına sayı (Şekil 4) belirtilmiştir. Bu nitelikler chlamydial kapanım biyoloji ile ilgili önemli bilgiler sağlar ve onlar konak hücreye nasıl etkileşimde bilgilendirmek. Tarif edilen yöntem olup su, bir şekilde bu bilgilere erişmek için, basit bir yaklaşım sağlar diğer deneysel tekniklerle gerçekleştirilebilir ne rpasses. Ters etiketleme stratejisinin nihai yarar canlı hücreler Chlamydia kapanım gerçek zamanlı görüntüleme içindir. Bunun bir örneği, film 1 'de gösterilmiştir.
C Şekil 1. Otomatik algılama trachomatis inklüzyonlar. (A) GFP-HeLa hücreleri (B) C mKate2-ifade ile enfekte edilmiştir trachomatis L2 ve 24 HPI canlı görüntülenmiş. Bir görüntüleme yazılım tabanlı algoritma otomatik olarak turuncu işaretlenmiş GFP-HeLa hücrelerinde kara delikler, seçilmesi (C) klamidya inklüzyonları tanımlamak için kullanıldı. (D) paneller A ve B enfekte olmuş hücrelerin bir kompozit görüntü de gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 20 mikron =. .jove.com / files / ftp_upload / 51131 / 51131fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Chlamydia eklenmesi oluşturan birimlerin miktarlandınlması (IFU) hücreleri GFP-HeLa. GFP-HeLa hücreleri C ile enfekte edildi İki farklı enfeksiyon çokluklar 24 HPI görüntülü olarak trachomatis L2. Enfeksiyon başına 10 alanlar için inklüzyonlar tespit ve otomatik yazılım kullanılarak numaralandırılan ve sonuçları verilmektedir (n = 3). Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
OAD / 51131 / 51131fig3.jpg "/>
C Şekil 3. Zaman ders trachomatis serovar L2, C. trachomatis serovar D, C. muridarum ve C. pneumoniae GFP-HeLa hücrelerinde enfeksiyon. GFP-HeLa hücreleri C ile enfekte edildi trachomatis LGV serovar L2 (A) 16 HPI, (B) 24 HPI ve (C) 48 HPI canlı floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir. GFP-HeLa hücreleri C ile enfekte trachomatis serovar D (D) 16 HPI, (E) 24 HPI, ve (F) 48 HPI de görüntülenmiştir. GFP-HeLa hücreleri C ile enfekte muridarum (G) 16 HPI, (H) 24 HPI ve (I) 'in 48 HPI de görüntülenmiştir. GFP-HeLa hücreleri C ile enfekte pneumoniae(J) 16 HPI, (K) 24 HPI ve (L) 48 HPI de görüntülenmiştir. Temsilcisi görüntüleri tüm enfeksiyonların ve zamanlar için gösterilmiştir. Ölçek çubukları 20 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Temsilcisi nicel veriler zaman ders deneyler türetilen. (A) C ile enfekte GFP-HeLa hücrelerinden İnklüzyonlar trachomatis LGV serovar L2, (B) C trachomatis serovar D, (C) C muridarum ve (D) C pneumoniae tespit edilir ve 16, 24 de numaralandırılmış ve 48 HPI (5 alanları zaman aralığı başına n = 3) alındı. Chlam fiziksel özellikleriydial inklüzyonlar dahil yüzey alanı, uzunluğu, çevre dahil, ve tekrar hücre başına inklüzyon sayısı sayıldı. Hata çubukları SEM temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. GFP C ile enfekte MCherry-HeLa hücrelerinde Movie 1 Zaman atlamalı videoyu 48 HPI alınan trachomatis L2. Video 125 dakika 5 dakika aralıklarla alınan time-lapse görüntüleri bir dizi derlenmiştir. MCherry-HeLa hücreleri arasında Yuvarlak bir video dönüşümlü (kırmızı), C. trachomatis L2 (yeşil) ve her iki alanda bir birleştirme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada gerçek zamanlı görselleştirme ve Chlamydia kapanım analizi için floresan konakçı hücreleri üretmek için deneysel bir strateji açıklar. Bu vakuol görselleştirme yaklaşımı zamanla tek hücre hücre popülasyonlarında karşısında ya da klamidya kapanım dinamik özellikleri, aydınlatmak izlemek ve kantitatif ölçmek için güçlü yeteneği kazandırır. Klamidya kapanımlar floresan proteini etiketli hücrelerde çarpıcı iyi kolayca tespit edilir, öyle ki tanımlanır Ek immunofluorescent işleme gerek kalmadan. Ayrıca, bu yaklaşım, hücre ve içerme eğrilik başına vakuollerin sayıları gibi farklı Chlamydia türleri ve suşları sahip olduğu imza morfolojik farklılıkları çözmek için yeterince hassas olduğunu. Buna ek olarak, görüntüleme yazılımı otomatik olarak GFP eksprese eden konakçı hücreler içinde inklüzyon tanımlamak için adapte edilebilir gösterilmektedir. Il için immunofluorescent etiketleme adımlarının önüne geçmechlamydia kapanımlar ettiğiniz ışık gibi içerme oluşturan birim (IFU) belirlenmesi gibi uç nokta deneyleri için kullanıcıya önemli ölçüde zaman ve maliyet tasarrufu sağlar. Enfekte hücrelerin aynı nüfus dolayısıyla zaman ders çalışmaları için kuyu veya gerekli plakaların sayısını azaltarak, klamidya gelişimsel döngüsü üzerinde kesin zamanlarda analiz edilmesi için Dahası, canlı hücreler görüntü kapanım yeteneği verir. Sitosolik GFP, mCherry vb photobleaching zarar vermez parlak, istikrarlı sinyal verir; Bu özellik uzun zaman atlamalı görüntüleme deneyleri için kritik öneme sahiptir. Tekniği Chlamydia gelişim gen ekspresyonunun bağımsız olduğu için, son olarak, bu Chlamydia hücresel enfeksiyon tüm aşamalarında aynı derecede etkilidir.
Etiketleme içi Chlamydia ve membranların 7,8 için mevcut stratejilerin karşılaştırıldığında, bu tekniğin deneysel a için basitlik ve esneklik sunarU ygulamalar. Chlamydia ile enfekte Floresan konakçı hücreler boya yükleme, etiketleme ve diğer hücresel manipülasyonlar için gerek kalmadan, hemen görüntülü olabilir. Bu yaklaşım açıkça yanar ve etiketsiz dahil (ve bakteri) lümen alanı tutarken dahil kenarlarını tanımlar. Aydınlatıcı ve Chlamydia enfekte hücreleri numaralandırılıyor amacıyla, bu yaklaşımın avantajı öncelikle bu nedenle canlı kültürler ve sağladığı önemli zaman tasarrufu ile uyumluluğu yatıyor. Ancak, etiketleme ve Chlamydia içeren vakuol kendisinin nicel parametrelerin türetilmesi için, bu bölmeye ticari antikorlar yaygın olarak kullanılabilir değil. Sonuç olarak, ters GFP yaklaşımı bu patojen bölmesinin zarı çizilmesi için en basit ve doğrudan bir araç olmaya devam etmektedir.
Bir Chlamydia visualizat bu görüntüleme yöntemi uygulamak için kilit hususlar vardıriyon akışı. Bu gibi GFP, mCherry, kararlı ifadesi ile konakçı hücre hatları, önceden oluşturulmuş olması önemlidir. Chlamydia inklüzyonlar kolayca, geçici olarak floresan proteinleri ile transfekte edilir konakçı hücreler olarak tespit edilir, ancak bu şekilde hazırlanan hücreler nüfus içerisindeki tam olmayan transfeksiyon hem de değişken sentezleme seviyelerine çeker. Buna ek olarak, transfeksiyon genel prosedüre gereksiz adımları ekler. Tarif edilen metodun başka bir sınırlama inklüzyonlar farklı Chlamydia spp türetilmiş olmasıdır. morfolojik görünüşü ve bir ev sahibi hücre ile etkileşim içinde çarpıcı bir şekilde farklı olabilir. Bu görüntüleme yaklaşımı tespit ve C içeren görüntüleme kapanım için oldukça sağlamdır trachomatis, C. muridarum ya da C pneumoniae; Ancak, birkaç Chlamydia türleri (en önemlisi C.psittaci ve C. caviae) için kalıntılar G hariç daha az yetenekliOnların lümen uzaydan FP. C ihtiva eden Dahil psittaci veya C caviae GFP-HeLa hücrelerinde kolaylıkla görülebilir, ancak bu inklüzyonlar bazı GFP saldırı kapanımlarının yazılım tabanlı algılama hata oranını artırır.
Genel deneysel strateji şekilde uygulanması edildikten sonra, yeni fırsatlar canlı hücreler Chlamydia kapanım kantitatif analiz için oluşturulur. Görüntüleme yazılımı kullanarak veya manuel puanlama yoluyla otomatik bir şekilde ya da - Bu tekniğin içerme sayımı için bir iş akışı sağlar nasıl gösterilmektedir. Bu yaklaşımın bir roman uygulama örneği alınma alanı, hacim ve şekil için dahil ilgili anlamlı nicel verilerin türetme içindir. Son olarak, bu yöntem, yüksek derecede uyarlanabilir görselleştirme ve örneğin, Chlamydia ile enfekte olmuş konukçu hücrelerinin biyoloji içine ek bilgiler ortaya çıkarmak için diğer floresan işaretleri ile kombinasyon halinde kullanılabilirGFP- ya mKate2 eksprese eden Chlamydia 6,11, floresan aktin 12 veya GFP Inc proteinleri 13 etiketli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
References
- Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).
- Schachter, J. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).
- Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
- Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).
- Hackstadt, T. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).
- Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258 (2011).
- Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
- Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
- Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
- Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949 (2012).
- Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090 (2013).
