Introduction
الأمراض المعدية التي تسببها أنواع من البكتيريا المتدثرة الخلايا تثير عبئا كبيرا على الصحة العالمية، بما في ذلك الأمراض المنقولة جنسيا ومرض التهاب الحوض، والعمى، والالتهاب الرئوي، وربما تصلب الشرايين 1-4. قدرة الكلاميديا للتفاعل مع الخلية المضيفة، من خلال فجوة (وهو ما يسمى إدراج)، هو عامل حاسم للعدوى الناجح للخلايا والمضيف. إدراج هو حجرة المسببة للأمراض الجديدة التي تمكن النمو الناجمة عن المتدثرة ويتم تعديل حيوي طوال دورة كاملة 2-3 يوم التنموية المتدثرة 5. طبيعة الخلايا تلزم من الكلاميديا تقدم العديد من التحديات للمجتمع العلمي، ولا سيما لدراسة مباشرة بيولوجيا الفريد للإدراج. وثمة عائقا كبيرا في عدم القدرة على تصور بكفاءة إما الكلاميديا داخل الخلايا أو إدراجها من قبل نهج الفلورسنتوفاق في الخلايا الحية. وقد كشفت الاكتشاف الأخير أخيرا وسيلة لتوليد GFP معربا عن C. الحثرية 6؛ ومع ذلك، لم يؤد هذا الاستنتاج بعد أن وضع العلامات المحددة لإدراج. وقد وصفت بعض التقنيات لوضع العلامات من البكتيريا والادراج 7،8، لكنها تعاني من قصور مثل عدم التحديد، transiency والقابلية للphotobleaching من. A اكتشاف رئيسي من قبل مجموعتنا إنشاء استراتيجية جديدة لإلقاء الضوء على إدراج باستخدام GFP معربا عن الخلايا المضيفة 9. هذه الاستراتيجية يستغل بعقلانية الكتامة الجوهرية للغشاء إدراج جزيئات أكبر من 520 دا 10. عندما صممت الخلايا للتعبير ثابت معين بروتين فلوري عصاري خلوي (على سبيل المثال، أو GFP mCherry)، شوائب الكلاميديا واضحة مع وضوح ملحوظا من قبل استبعادهم كاملة من مضان. هذه الاستراتيجية التصوير العكسي تمكن التصور فوري من الادراج لجميع كلوروفيلالأنواع amydia ويمكن تكييفه بسهولة لمعظم الخلايا المضيفة من الفائدة. كدليل على فائدتها، وقد استخدمت هذه الطريقة سابقا للكشف وتحديد مسارات الخروج الخلوية لالكلاميديا النيابة 9.
هنا، علينا أن نظهر كذلك كيف يتم تنفيذ هذه الطريقة، ويمكن استغلاله لاستخلاص البيانات الكمية الرئيسية حول ديناميات النمو إدراج. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن تحل محل فعال للطرق التعداد القائم على الضد مكلفة، ويمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع العلامات الفلورية الأخرى، مثل mKate2، معربا عن الكلاميديا 11. هذه تركيبة قوية من الأدوات تتيح استكشاف الخصائص الفيزيائية للغشاء إدراج المتدثرة داخل الخلايا الحية المضيفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جيل من خطوط الخلية المضيفة الفلورسنت
- اليوم 1. لوحة الخلايا 293T (أو غيرها من خط التعبئة والتغليف فيروسات) على 6 لوحات جيدا في 2 × 10 6 خلايا / جيد، لتكون ~ 75٪ متكدسة في اليوم التالي. إذا رغبت في ذلك، لوحة الآبار مكررة لكل الارتجاعي لاستخدامها.
- 2. يوم الخلايا نضح وإضافة 2 مل متوسطة النمو الطازجة (DMEM + 10٪ FBS + 2 مم L-الجلوتامين). Transfect الخلايا مع 5-8 ميكروغرام لكل من ناقلات فيروسات (التي تحتوي على GFP) وناقلات التعبئة والتغليف (على سبيل المثال، pVSVg) باستخدام Lipofectamine 2000 أو كاشف مماثلة وبعد تعليمات الشركة الصانعة.
- احتضان الخلايا مع الحمض النووي لمدة 4-6 ساعة في 37 ° C CO 2 الحاضنة، وبعد ذلك استبدال المتوسطة مع 1 مل متوسطة النمو.
- احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة في 37 ° C CO 2 الحاضنة.
- يوم الخلايا 3. لوحة الهدف (على سبيل المثال، هيلا) على 6 لوحات جيدة في كثافة التقريبية لل10 5 خلايا / جيد، لتكون ~ 50٪ متكدسة فياليوم التالي. تحقق ترنسفكأيشن إيجابيا في الخلايا 293T من خلال رصد GFP مضان على مجهر مقلوب.
- اليوم 4. اجمع supernatants من الخلايا 293T باستخدام ماصة وتصفية طاف من خلال 0.45 ميكرون السليلوز مرشح خلات حقنة تحتوي على الفيروس الارتجاعي.
- إزالة المتوسطة من خلايا هيلا والمتوسطة إضافة 0.5 مل نمو تحتوي على 16 ميكروغرام / مل polybrene. إضافة ~ 0.5 مل من الفيروس الارتجاعي تصفيتها إلى خلايا قطرة من الحكمة واحتضان خلايا في 37 ° C CO 2 الحاضنة لمدة 24 ساعة. تخزين أي الارتجاعي المتبقية (أي من تكرار جيد) في 4 درجات مئوية.
- اليوم 5. إذا قدمت الآبار مكررة لتوليد الارتجاعي إضافية، كرر الخطوة 1.7 لتصيب بشكل متسلسل مع الرجعية الجسيمات المتبقية.
- اليوم 6. مرور transfected خلايا هيلا 1: 1 إلى 10 سم صحن يحتوي على اختيار المضادات الحيوية (على سبيل المثال، 500 ميكروغرام / مل النيومايسين).
- انتظر وقتا كافيا للخلايا transduced لتنمو مرة أخرى في وجود اختيار المضاداتالتشنج، وبعد ذلك الخلايا يمكن تروجها التقنيات القياسية مع تركيز أقل من اختيار المضاد الحيوي (على سبيل المثال، 200 ميكروغرام / مل النيومايسين).
ملاحظة: يمكن أيضا خلايا يتم اختيار متطابق بسلالة لسطوع المثالي في هذا الوقت، إذا لزم الأمر.
2. جيل، معربا عن GFP الكلاميديا
- إعداد 2X CaCl 2 العازلة (20 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 100 ملي CaCl 2) و4SP العازلة (0.4 M السكروز، 16 ملي نا 2 هبو 4).
- اليوم 1. ذوبان المجمدة C. الأسهم الحثرية على الجليد وتمييع 10 ميكرولتر البكتيريا على الفور إلى 50 ميكرولتر 2X CaCl 2 العازلة. إضافة 3 ميكروغرام DNA البلازميد (على سبيل المثال، باسك-GFP-mKate2-L2)، تخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية.
- خلال هذه الخطوة، وإعداد الخلايا المضيفة التي كتبها trypsinizing قارورة T-75 من خلايا مكوي في أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي تعليق خلية في 50 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. Resuspenد بيليه الخلية في حجم مناسب من 1X CaCl 2 العازلة لإعطاء تركيز النهائي من 4 × 10 7 خلية / مل.
- بعد حضانة 30 دقيقة (من الخطوة 2.2)، إضافة 100 ميكرولتر أعدت خلايا مكوي لأنبوب خليط التحول (الحجم الكلي 200 ميكرولتر) واحتضان لمدة 20 دقيقة إضافية عند 25 درجة مئوية. إضافة 100 ميكرولتر من هذا الخليط الخلية تتحول إلى بئر واحدة من لوحة 6 جيدا وتراكب مع 2 مل النمو المتوسطة. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 ل 2 أيام.
- اليوم 3. الخلايا ليز مكوي المصابة مع C. الحثرية عن طريق استبدال المتوسطة مع 1 مل درهم 2 O وكشط الخلايا مع عازمة 1000 ميكرولتر طرف الماصة. إضافة 1 مل 4SP العازلة وتمرير تعليق من خلال إبرة 27.5 G ~ 5 مرات لتحلل الخلايا كفاءة وإطلاق C. الحثرية.
- نقل 2 مل من المحللة الخلية التي تحتوي C. الحثرية إلى T-75 قارورة تحتوي على أحادي الطبقة متموجة من مطلي حديثا مؤسسة تحدي الألفيةخلايا أوي؛ إضافة 8 مل DMEM (بدون FBS)، واحتضان لمدة 2 ساعة على 25 درجة مئوية للسماح C. الحثرية التمسك الخلايا.
- الخلايا نضح وإضافة المتوسطة نمو جديدة تستكمل مع 10 U / مل G البنسلين و1 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد. احتضان قارورة لمدة 48 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية CO 2.
- اليوم 4. التحقق من قبل المجهر الضوئي أن الخلايا يصاب والادراج يحتوي الكلاميديا الشاذة. تحديد الادراج كما فجوات مشرقة في المجهر ضوء معيار، والهيئات الكلاميديا الشاذة ككائنات مثل حلقة داخل الادراج التي هي أكبر من 2 ميكرون القطر.
- اليوم 5. ليز الثقافة من خلال استبدال المتوسطة مع 2 مل درهم 2 O وتتخلص من الخلايا في التعليق. إضافة 2 مل 4SP العازلة وتمرير تعليق من خلال إبرة 27.5 G ~ 5 مرات.
- استخدام 2 مل من المحللة الخلية لتصيب أحادي الطبقة جديدة من الخلايا مكوي في بئر واحدة في لوحة 6 جيدا. احتضان الخلايا مع المحللة لمدة 2 ساعة على 25 درجة مئوية، ونضح وإضافة النمو العذبةالمتوسط تحتوي على البنسلين G وسيكلوهيكسيميد.
- احتضان الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية CO 2 لمدة 3-5 أيام، وهذا يتوقف على الصحة العامة للخلايا.
- كرر الخطوات من 2،9 حتي 2،10 مرة أو أكثر، حسب الاقتضاء، الثقافات الركض في آبار جديدة في لوحة 6 جيدا حتى ظهرت العادية الادراج تبحث (خالية من الهيئات الشاذة). في هذا الوقت استخدام المجهر مضان مقلوب للتأكد من أن C. الحثرية تعبير عن mKate2 (الحمراء).
- توسيع نطاق الثقافات المصابة لتوليد الأسهم الناجمة عن المتدثرة عيار عالية، على سبيل المثال عن طريق حصاد transformants الكلاميديا من المصابين مكوي أو هيلا الخلايا المزروعة في T-150 قوارير.
3. التي تصيب الخلايا مع الكلاميديا
- لوحة الخلايا GFP-هيلا على سفينة الثقافة المطلوبة، على سبيل المثال الأطباق أسفل الزجاج أو الشرائح غرفة لارتفاع القرار التصوير، أو 24 لوحات جيدا لتحديد IFU وفحص multiwell.
- ذوبان الجليد جيئة وذهاباأنبوب زن تحتوي على C. الحثرية، C. muridarum، أو C. الرئوية على الجليد وتمييع في HBSS إلى تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية)، على سبيل المثال وزارة الداخلية = 1.
- أداء العدوى إما ثابتة أو بمساعدة الطرد المركزي بناء على سلالة معينة الكلاميديا التي سيتم استخدامها.
- للعدوى مع C. الحثرية LGV ضرب مصلي L2 أو C. muridarum، وغسل الخلايا GFP-هيلا مع HBSS واحتضان مع البكتيريا المخفف لمدة 2 ساعة على 25 درجة مئوية. نضح وغسل الخلايا مع HBSS، واحتضان الخلايا في النمو المتوسطة في 37 ° C CO 2 الحاضنة.
- للعدوى مع C. الحثرية ضرب مصلي D أو C. الرئوية، وغسل الخلايا GFP-هيلا مع HBSS وإضافة البكتيريا المخفف للخلايا. وضع لوحة multiwell أو الزجاج طبق أسفل (المضمون الشريط في لوحة غطاء multiwell) في حامل لوحة multiwell من الدوار المرفق الدلو المتأرجح في جهاز للطرد المركزي الفوق.
- خلايا الطرد المركزي في 900 x ج عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إزالة السفن الثقافة من أجهزة الطرد المركزي ووضعه في الحاضنة 37 درجة مئوية CO 2 لمدة 1 ساعة.
- الخلايا نضح في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، وغسل الخلايا مرتين مع HBSS، وإضافة متوسطة النمو الطازجة. خلايا مكان في 37 ° C CO 2 الحاضنة.
4. لايف التصور خلية من الكلاميديا الادراج
- إزالة الكلاميديا الخلايا المصابة GFP-هيلا من CO 2 الحاضنة واستبدال المتوسطة مع RPMI دون الفينول الحمراء + 5٪ FBS.
- خلايا جبل على مضان المجهر المقلوب (نيكون الكسوف تي-E أو ما شابه ذلك) باستخدام الهدف 20X أو ارتفاع أسعار النفط.
- باستخدام برامج التصوير (Volocity 6 أو ما شابه ذلك)، والتركيز على تحديد والكلاميديا الخلايا المصابة GFP-هيلا: الخلايا الخضراء التي تحتوي على ثقوب سوداء كبيرة (الادراج الكلاميديا).
- كافة المواقع XYZ المناطق التي تحتوي على خلايا الكلاميديا -infected الاهتمام باستخدام برامج التصوير (المجلدocity 6 أو ما شابه). تنفيذ هذا يدويا "إضافة نقاط" أثناء وجوده في وضع العرض XY المرحلة. في هذه الطريقة، يتم حفظ إحداثيات XYZ لكل موقع ملحوظ.
- في مربع الحوار إعداد الاستحواذ وتكوين برنامج للحصول على الأخضر (GFP، هيلا العصارة الخلوية) والأحمر (mKate2، C. الحثرية) القنوات، وبمعدل إطارات جديدة لكل قناة كل 5 دقائق.
- الحصول على تسلسل الصور باستخدام اكتساب دخل بروتوكول أعلاه من خلال النقر على "لقطة / سجل" زر.
5. الكميات من معلمات النمو إدراج في الخلايا الحية
- في بعض الأحيان المرجوة بعد الإصابة (على سبيل المثال، 24، 48 HPI) إزالة الكلاميديا الخلايا المصابة GFP-هيلا من الحاضنة وجبل على مجهر مضان مقلوب. ملاحظة: A الهدف 20X 40X أو الهواء مع ارتفاع NA هو أفضل مناسبة ل24 لوحات جيدة، وينصح هدف النفط 40X الشرائح للغرفة. تنمو الخلايا على أي ركيزة لهذا الحمارعبد المنعم يوسف.
- التركيز على midplanes من الخلايا، حيث شوائب في أقصى قطر وتسفر عن حواف حادة.
- الحصول على صور للعديد من المجالات في كل بئر (لا يقل عن 10 لكل بئر)؛ الآبار تمثل عادة مكررات أو المتغيرات التجريبية.
- تعداد عدد من شوائب يدويا، من خلال العين (شوائب مقصورات سوداء في الخلايا GFP-هيلا) أو استخدام خوارزميات برامج التصوير لتحديد تلقائيا والاعتماد الادراج.
- البحث عن خلايا GFP-هيلا بواسطة كثافة مضان ('البحث عن كائنات "الأوامر) وضبط شدة عتبة مضان على أساس كثافة نسبية من الخلايا.
- مرشح الكائنات المحددة باستخدام المبادئ التوجيهية حجم حفظ تلك فقط أكبر من 5 ميكرون 2. هذا هو "السكان 1.
- تطبيق 'ملء ثقوب في كائنات "الأوامر باستخدام' السكان 1 'كإدخال. هذه الخطوة بإنشاء "السكان 2.
- طرح "السكان 1 'من' صopulation 2 "لانتاج علامة إيجابيا الادراج الكلاميديا، تسمى" السكان 3.
- تطبيق فلتر حجم "السكان 3 '(' تصفية سكان" الأوامر)، على سبيل المثال الأجسام حفظ أكبر من 25 ميكرون 2 للشوائب في الخلايا المصابة لمدة 24 ساعة أو أكثر. للمرة العدوى المبكرة، مثل قبل 18 ساعة، تعيين مرشح حجم للحفاظ على الأشياء أكبر من 4 ميكرون 2، وهذه الادراج هي أصغر من ذلك بكثير. النتائج حجم تصفية في عدد الأجسام تسمى "شوائب".
- حساب البيانات الكمية من الصور، على سبيل المثال، عدد إدراج، حجم إدراج، ومحيط إدراج، وذلك باستخدام برامج التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خلايا الثدييات التعبير عن البروتينات الفلورية عصاري خلوي (على سبيل المثال، GFP) يمكن هندستها لتمكين إضاءة الادراج الكلاميديا في الحي، مزارع الخلايا المصابة. على العدوى مع الكلاميديا، شوائب مرئية بسهولة على شكل بقع سوداء في الخلايا المضيفة (الشكل 1). وضوح الادراج-تفتقر مضان يمكن استغلالها لتحديد الآلية من شوائب عبر مجالات واسعة للعرض و / أو العلاج (الشكل 1). مرة واحدة وقد تم توليد الخلايا المضيفة الفلورسنت، يتم تمكين سير عمل جديدة وقوية للالسريع، والتحليل الكمي من مستويات العدوى الناجمة عن المتدثرة في العينات التجريبية. طلب واحد رئيسي هو تحديد إدراج تشكيل وحدات الكلاميديا (IFU) في الخلايا المصابة الحية (الشكل 2). هذه الاستراتيجية التجريبية يغني عن الحاجة إلى إجراءات المناعي التي تستخدم بشكل روتيني في الميدان، وكلاهما وقتا طويلا ومكلفة.
ميزة أساسية أخرى لنهج التصوير وصفها هو أنه يمكن تطبيقها بسهولة إلى أي نوع الكلاميديا أو سلالة، وعلاوة على ذلك، يمكن استغلالها لاشتقاق الخصائص البيولوجية الهامة من شوائب المتدثرة. وكمثال على ذلك، تحليلا مدار الساعة من الخلايا GFP-هيلا بفيروس C. الحثرية LGV ضرب مصلي L2، C. الحثرية ضرب مصلي D، C. muridarum، وC. تم تنفيذ الرئوية في 16 و 24 و 48 HPI (الشكل 3). لكل من هذه الأنواع الكلاميديا والسلالات، وتميزت الادراج وتحليلها لحساب متوسط منطقتهم، محيط طول، وعدد كل خلية في أوقات أشار (الشكل 4). وتوفر هذه الصفات معلومات هامة حول بيولوجيا الادراج المتدثرة وتبلغ كيف تتفاعل مع الخلية المضيفة. يوفر الأسلوب هو موضح نهج سطحي للوصول إلى هذه المعلومات بطريقة سو rpasses ما يمكن تحقيقه من خلال تقنيات تجريبية أخرى. وهناك فائدة النهائية للاستراتيجية العلامات العكسية في الوقت الحقيقي التصوير من شوائب الكلاميديا في الخلايا الحية. ويرد مثال على ذلك في الفيلم 1.
الشكل 1. الآلي الكشف عن C. الادراج الحثرية. والخلايا المصابة (A) GFP-هيلا مع (B) mKate2، معربا عن C. الحثرية L2 وتصويرها على الهواء مباشرة في 24 HPI. تم استخدام خوارزمية برامج التصوير تستند إلى تحديد تلقائيا الادراج الناجمة عن المتدثرة التي كتبها (C) اختيار الثقوب السوداء في خلايا GFP-هيلا، تميزت باللون البرتقالي. (D) صورة مركبة من الخلايا المصابة من لوحات A و B يظهر أيضا. = شريط نطاق 20 ميكرون. .jove.com / ملفات / ftp_upload / 51131 / 51131fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الكميات من إدراج تشكيل وحدات الكلاميديا (IFU) في GFP-هيلا الخلايا. أصيب خلايا GFP-هيلا مع C. الحثرية L2 على اثنين من مولتيبليكيتييس مختلفة من العدوى وتصويرها في 24 HPI. تم الكشف عن شوائب ل10 حقول في العدوى وتعداد باستخدام البرمجيات الآلي وتعطى النتائج (ن = 3). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
OAD / 51131 / 51131fig3.jpg "/>
الرقم 3. وقت مسار C. الحثرية ضرب مصلي L2، C. الحثرية ضرب مصلي D، C. muridarum، وC. الرئوية العدوى في خلايا GFP-هيلا. والخلايا المصابة GFP-هيلا مع C. الحثرية LGV ضرب مصلي L2 وتصويرها بواسطة المجهر مضان الحية في (A) 16 HPI، (B) 24 HPI، و (C) 48 HPI. خلايا GFP-هيلا المصابة مع C. تم تصوير الحثرية ضرب مصلي D في (D) 16 HPI، (E) 24 HPI، و (F) 48 HPI. خلايا GFP-هيلا المصابة مع C. muridarum تم تصويرها في (G) 16 HPI، HPI (H) 24، و (I) 48 HPI. خلايا GFP-هيلا المصابة مع C. الرئويةتم تصوير في (J) 16 HPI، (K) 24 HPI، و (L) 48 HPI. وتظهر الصور التمثيلية لجميع الأمراض والأوقات. الحانات النطاق = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. البيانات الكمية التمثيلية مستمدة من تجارب الوقت بالطبع. الادراج من خلايا GFP-هيلا المصابين (A) C. الحثرية LGV ضرب مصلي L2، (B) C. الحثرية ضرب مصلي D، (C) C. muridarum، و (D) C. تم الكشف عن الرئوية والمذكورة في 16 و 24 و 48 HPI (5 حقول في الفاصل الزمني، ن = 3). الخصائص الفيزيائية للchlamوتم قياس كمية الادراج ydial لمنطقة إدراج السطح، إدراج محيط طول، وعدد من الادراج في الخلية. أشرطة الخطأ تمثل SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. الفيلم 1. الوقت الفاصل بين الفيديو الخلايا mCherry-هيلا المصابين GFP C. الحثرية L2، الذي اتخذ في 48 HPI. وقد تم تجميع الفيديو من سلسلة من الصور الوقت الفاصل بين المتخذ في 5 فترات دقيقة 125 دقيقة. المناوبين الفيديو يحلق عبر خلايا mCherry-هيلا (الأحمر)، C. الحثرية L2 (الأخضر)، ودمج كل المجالات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا تصف استراتيجية تجريبية لتوليد الخلايا المضيفة الفلورسنت التصور في الوقت الحقيقي وتحليل الادراج الكلاميديا. هذا النهج فجوة التصور يمنح القدرة القوية لإلقاء الضوء، تتبع وكميا قياس الخصائص الديناميكية للشوائب المتدثرة عبر السكان من الخلايا أو في زنازين انفرادية مع مرور الوقت. شوائب الكلاميديا في خلايا البروتين المسمى الفلورسنت واضحة المعالم لافت للنظر، مثل أنهم التعرف عليها بسهولة دون الحاجة إلى معالجة مناعي إضافية. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج هو حساسة بما يكفي لحل توقيع الصرفي الخلافات التي الأنواع المختلفة الكلاميديا وسلالات تمتلك مثل أرقام من فجوات في كل خلية وإدراج انحناء. وبالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر كيف يمكن تكييفها برامج التصوير لتحديد تلقائيا الادراج في GFP معربا عن الخلايا المضيفة. والتحاش من الخطوات العلامات مناعي لايلLUMINATION من شوائب المتدثرة ينتج في الوقت والتكلفة وفورات كبيرة للمستخدم لفحوصات نقطة النهاية مثل تحديد إدراج تشكيل وحدات (IFU). وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على الادراج الصورة في الخلايا الحية تسمح لنفس عدد سكان الخلايا المصابة ليتم تحليلها في أوقات محددة خلال دورة التنموية المتدثرة، مما يقلل من عدد من الآبار أو لوحات اللازمة للدراسات دوام. عصاري خلوي GFP، mCherry، وما إلى ذلك، تسفر عن، إشارة ساطعة المستقرة التي لا تعاني من photobleaching من؛ هذه الميزة هو أمر حاسم لالمطولة تجارب التصوير الوقت الفاصل. وأخيرا، لأن تقنية مستقلة عن الكلاميديا التعبير الجيني التنموي، فمن فعالة على قدم المساواة في جميع مراحل العدوى الخليوي عن الكلاميديا.
مقارنة الاستراتيجيات القائمة لوضع العلامات داخل الخلايا الكلاميديا والأغشية 7،8، هذه التقنية توفر البساطة والمرونة لالتجريبيpplications. الخلايا المضيفة الفلورسنت المصابين المتدثرة ولا يمكن تصوير فورا، دون الحاجة إلى تحميل صباغة، ووضع العلامات أو التلاعب الخلوية الأخرى. هذا النهج ينير بشكل واضح ويحدد حواف إدراج مع الحفاظ على مساحة اللمعية إدراج (والبكتيريا) الخالي من الملصقات. لغرض إلقاء الضوء على وتعداد الخلايا المصابة الكلاميديا، والاستفادة من هذا النهج في المقام الأول يكمن في مدى توافقه مع الثقافات الحية، وبالتالي توفير الوقت الكبيرة التي يقدمها. ومع ذلك، من أجل وضع العلامات واشتقاق المعايير الكمية لالكلاميديا التي تحتوي على فجوة نفسها، والأجسام المضادة التجارية لهذا الحيز لا تتوفر على نطاق واسع. ونتيجة لذلك، لا يزال النهج GFP مقلوب أكثر الوسائل السهلة والمباشرة لترسيم غشاء من هذا الممرض المقصورة.
هناك اعتبارات أساسية لتطبيق هذا الأسلوب التصوير إلى visualizat الكلاميدياأيون سير العمل. من المهم أن خطوط الخلايا المضيفة مع التعبير مستقر من GFP، mCherry، وما إلى ذلك، يتم إنشاء مقدما. على الرغم من شوائب المتدثرة يتم الكشف بسهولة في الخلايا المضيفة التي عابر. مع البروتينات الفلورية، والخلايا التي أعدت بهذه الطريقة تعاني من ترنسفكأيشن غير مكتمل لجميع السكان وكذلك مستويات التعبير المتغيرة. بالإضافة إلى ذلك، ترنسفكأيشن يضيف الخطوات غير الضرورية لإجراء الشامل. قيود أخرى على الطريقة الموضحة هو أن الادراج المستمدة من مختلف النيابة الكلاميديا. يمكن أن تكون مختلفة لافت للنظر في مظهرها الشكلي والطريقة التي تتفاعل مع الخلية المضيفة. هذا النهج التصوير قوي جدا للكشف عن والادراج التصوير التي تحتوي على C. الحثرية، C. muridarum أو C. الرئوية. ومع ذلك، لعدد قليل من الأنواع الكلاميديا (وأبرزها C. الببغائية وC. القبيعية) شوائب أقل قدرة على استبعاد GFP من حيزها اللمعية. C. تحتوي على شوائب الببغائية أو C. القبيعية هي مرئية بسهولة في الخلايا GFP-هيلا، ولكن تدخل بعض GFP في هذه الادراج يزيد من نسبة الخطأ البرمجيات القائمة على الكشف عن شوائب.
مرة واحدة وقد تم تنفيذ الاستراتيجية التجريبية الشاملة بشكل صحيح، وخلقت فرصا جديدة للتحليل الكمي من شوائب الكلاميديا في الخلايا الحية. علينا أن نظهر كيف تسمح هذه التقنية لتبسيط العمل لإدراج التعداد - إما بطريقة الآلي باستخدام برامج التصوير، أو عن طريق التسجيل اليدوي. تطبيق جديد من هذا النهج هو اشتقاق من البيانات الكمية ذات مغزى حول إدراج، على سبيل المثال منطقة إدراج والحجم والشكل. وأخيرا، وهذه الطريقة التصور هو متكيف جدا، ويمكن استخدامها في تركيبة مع علامات الفلورسنت أخرى للكشف عن نظرة إضافية في بيولوجيا الخلايا المضيفة المصابة الكلاميديا، على سبيل المثالGFP- أو mKate2، معربا عن الكلاميديا 6،11، الأكتين فلوري 12 أو GFP الموسومة البروتينات المؤتمر الوطني العراقي (13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
References
- Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).
- Schachter, J. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).
- Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
- Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).
- Hackstadt, T. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).
- Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258 (2011).
- Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
- Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
- Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
- Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949 (2012).
- Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090 (2013).
