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Immunology and Infection

कल्पना और quantitate फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग Published: October 13, 2015 doi: 10.3791/51131
Automatic Translation
1,2, 2, 1
1Division of Allergy and Infectious Diseases, Department of Medicine, University of Washington, 2Program in Infectious Diseases, School of Public Health, University of California at Berkeley

Introduction

इंट्रासेल्युलर जीवाणु क्लैमाइडिया की प्रजातियों की वजह से संक्रामक रोगों यौन संचारित रोग, श्रोणि सूजन बीमारी, अंधापन, निमोनिया और संभवतः atherosclerosis 1-4 सहित वैश्विक स्वास्थ्य पर एक बड़ा बोझ, प्रकाश में लाना। एक रिक्तिका के भीतर से, मेजबान सेल के साथ बातचीत करने के लिए क्लैमाइडिया की क्षमता (शामिल किए जाने कहा जाता है), कोशिकाओं और मेजबान के अपने सफल संक्रमण के लिए एक महत्वपूर्ण निर्धारक है। शामिल किए जाने chlamydial विकास के लिए सक्षम बनाता है और गतिशील क्लैमाइडिया 5 की पूरी 2-3 दिन विकास चक्र के दौरान संशोधित किया गया है कि एक उपन्यास रोगजनक कम्पार्टमेंट है। chlamydiae की लाचार इंट्रासेल्युलर प्रकृति सीधे शामिल किए जाने की अनूठी जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए विशेष रूप से अनुसंधान समुदाय के लिए कई चुनौतियों प्रस्तुत करता है। एक बड़ी बाधा कुशलता इंट्रासेल्युलर क्लैमाइडिया या फ्लोरोसेंट दृष्टिकोण से उनके शामिल किए जाने या तो कल्पना करने में असमर्थता कर दिया गया हैजीवित कोशिकाओं में ते। हाल ही में एक खोज अंत में GFP सी व्यक्त उत्पन्न करने के लिए साधन से पता चला है ट्रैकोमैटिस 6; हालांकि, यह निष्कर्ष अभी तक शामिल किए जाने की विशिष्ट लेबलिंग करने के लिए नेतृत्व नहीं किया है। कुछ तकनीकों बैक्टीरिया और समावेशन 7.8 की लेबलिंग के लिए वर्णित किया गया है, लेकिन वे इस तरह के photobleaching के लिए गैर विशिष्टता, भंगुरता और संवेदनशीलता के रूप में कमियों से ग्रस्त हैं। हमारे समूह द्वारा एक महत्वपूर्ण खोज मेजबान कोशिकाओं 9 व्यक्त GFP का उपयोग कर शामिल किए जाने रोशन के लिए एक नई रणनीति की स्थापना की। इस रणनीति के तर्क से अधिक से अधिक 520 से दा 10 अणुओं को शामिल किए जाने की झिल्ली की आंतरिक अछिद्रता कारनामे। कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक एक विशेष साइटोसोलिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, GFP या mCherry) को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर हैं, क्लैमाइडिया समावेशन प्रतिदीप्ति की उनकी पूरी बहिष्कार से उल्लेखनीय स्पष्टता के साथ दिखाई दे रहे हैं। इस रिवर्स इमेजिंग रणनीति सभी Chl के लिए समावेशन के तत्काल दृश्य में सक्षम बनाता हैamydia प्रजातियों और यह आसानी से ब्याज की सबसे मेजबान कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसकी उपयोगिता के एक प्रदर्शन के रूप में, इस विधि क्लैमाइडिया एसपीपी 9 के लिए सेलुलर बाहर निकलने के रास्ते का पता चलता है और परिभाषित करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया था।

यहाँ, हम आगे इस विधि से किया जाता है, और शामिल किए जाने के विकास की गतिशीलता के बारे में महत्वपूर्ण मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, यह प्रभावी ढंग से महंगा एंटीबॉडी आधारित गणन तरीकों के लिए स्थानापन्न कर सकते हैं और इस तरह क्लैमाइडिया 11 mKate2 व्यक्त के रूप में अन्य फ्लोरोसेंट लेबल, के साथ मिलकर में इस्तेमाल किया जा सकता है। उपकरण के इस शक्तिशाली संयोजन रहने वाले मेजबान कोशिकाओं के अंदर chlamydial शामिल किए जाने की झिल्ली के भौतिक गुणों के अन्वेषण के लिए सक्षम बनाता है।

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Protocol

फ्लोरोसेंट होस्ट सेल लाइनों की 1. पीढ़ी

  1. अच्छी तरह / 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं, पर 6 अच्छी तरह प्लेटों पर दिन 1. प्लेट 293T कोशिकाओं (या अन्य रेट्रोवायरल पैकेजिंग लाइन) ~ 75% मिला हुआ अगले दिन किया जाना है। अगर वांछित, प्रत्येक रेट्रोवायरस के लिए थाली डुप्लिकेट कुओं इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. 2 दिवस महाप्राण कोशिकाओं और 2 मिलीलीटर जोड़ने ताजा मध्यम विकास (DMEM + 10% FBS + 2 मिमी एल glutamine)। 2000 Lipofectamine या इसी तरह के अभिकर्मक का उपयोग और निर्माता के निर्देशों का पालन 5-8 ग्राम रेट्रोवायरल वेक्टर (GFP युक्त) और पैकेजिंग वेक्टर के प्रत्येक (उदाहरण के लिए।, PVSVg) के साथ कोशिकाओं Transfect।
  3. 1 मिलीलीटर मध्यम विकास के साथ मध्यम जगह बाद में एक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में 4-6 घंटे के लिए डीएनए के साथ कोशिकाओं को सेते हैं, और।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
  5. 3 दिन प्लेट लक्ष्य कोशिकाओं (जैसे।, हेला) 10 5 कोशिकाओं की एक अनुमानित घनत्व में 6 अच्छी तरह प्लेटों पर / अच्छी तरह से हो सकता है, के लिए ~ 50% मिला हुआअगले दिन। एक औंधा माइक्रोस्कोप पर GFP प्रतिदीप्ति की निगरानी के द्वारा 293T कोशिकाओं में सकारात्मक अभिकर्मक सत्यापित करें।
  6. 4 दिन लीजिए रेट्रोवायरस युक्त एक 0.45 माइक्रोन सेलूलोज एसीटेट सिरिंज फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला एक विंदुक का उपयोग और फिल्टर 293T कोशिकाओं बंद supernatants।
  7. हेला कोशिकाओं से मध्यम निकालें और 16 माइक्रोग्राम / एमएल polybrene युक्त 0.5 मिलीलीटर मध्यम विकास जोड़ें। कोशिकाओं के लिए फ़िल्टर रेट्रोवायरस की ~ 0.5 मिलीलीटर जोड़ें बुद्धिमान छोड़ देता है और 24 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर (अच्छी तरह से नकल से, यानी) किसी भी शेष रेट्रोवायरस स्टोर।
  8. डुप्लिकेट कुओं क्रमानुसार शेष रेट्रोवायरल कणों के साथ संक्रमित करने के लिए अतिरिक्त रेट्रोवायरस, दोहराने कदम 1.7 उत्पन्न करने के लिए किए गए थे डे 5.।
  9. (उदाहरण के लिए, 500 माइक्रोग्राम / एमएल neomycin) एक 10 सेमी पकवान युक्त चयन एंटीबायोटिक में 1: 6 दिन बीतने हेला कोशिकाओं 1 ट्रांसफ़ेक्ट।
  10. चयन antibio की उपस्थिति में वापस जाना transduced कोशिकाओं के लिए पर्याप्त समय तक इंतजारकोशिकाओं चयन एंटीबायोटिक का एक कम एकाग्रता के साथ मानक तकनीक द्वारा प्रचारित किया जा सकता है, जो बाद टिक, (उदाहरण के लिए।, 200 माइक्रोग्राम / एमएल neomycin)।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो प्रकोष्ठों भी clonally, इस समय आदर्श चमक के लिए चुना जा सकता है।

GFP व्यक्त क्लैमाइडिया ट्रैकोमैटिस 2. जनरेशन

  1. 2x 2 CaCl बफर (20 ​​मिमी Tris पीएच 7.4, 100 मिमी CaCl 2) और 4SP बफर (0.4 एम सुक्रोज, 16 मिमी ना 2 4 HPO) तैयार करें।
  2. 1 दिवस पिघलना जमे हुए सी ट्रैकोमैटिस शेयर बर्फ पर और तुरंत 50 μl 2x 2 CaCl बफर में 10 μl बैक्टीरिया पतला। 3 माइक्रोग्राम प्लास्मिड डीएनए जोड़ें (जैसे।, पास्क GFP-mKate2-एल 2), अच्छा मिश्रण है और 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. इस चरण के दौरान, एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में मैककॉय कोशिकाओं की एक टी -75 फ्लास्क trypsinizing द्वारा मेजबान कोशिकाओं को तैयार। 5 मिनट के लिए 50 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। Resuspen1x 2 CaCl बफर का उचित मात्रा में डी सेल गोली 4 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए।
  4. (2.2 कदम से) 30 मिनट ऊष्मायन के बाद, परिवर्तन मिश्रण ट्यूब (कुल मात्रा 200 μl) को मैककॉय कोशिकाओं से तैयार 100 μl जोड़ने और 25 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 20 मिनट सेते हैं। 2 मिलीलीटर मध्यम विकास के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली और ओवरले से एक भी अच्छी तरह से करने के लिए इस तब्दील सेल मिश्रण के 100 μl जोड़ें। 2 दिनों के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. 3 दिन Lyse मैककॉय कोशिकाओं सी से संक्रमित एक तुला 1,000 μl pipet टिप के साथ कोशिकाओं 1 मिलीलीटर DH 2 हे के साथ मध्यम जगह और scraping द्वारा ट्रैकोमैटिस। सी के कुशल सेल और रिहाई के लिए 5 बार 1 मिलीलीटर 4SP बफर जोड़ें और ~ 27.5 जी सुई के माध्यम से निलंबन पारित ट्रैकोमैटिस।
  6. सी युक्त सेल lysate के स्थानांतरण 2 मिलीलीटर हौसले चढ़ाया एमसीसी का एक मिला हुआ monolayer युक्त एक टी -75 फ्लास्क ट्रैकोमैटिसओए कोशिकाओं; (एफबीएस के बिना) 8 मिलीलीटर DMEM जोड़ने और सी अनुमति देने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते ट्रैकोमैटिस कोशिकाओं का पालन करने के लिए।
  7. महाप्राण कोशिकाओं 10 यू / एमएल पेनिसिलिन ग्राम और 1 ग्राम / मिलीलीटर cycloheximide के साथ पूरक ताजा मध्यम विकास जोड़ें। एक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए कुप्पी सेते हैं।
  8. 4 दिन कोशिकाओं को संक्रमित कर रहे हैं और समावेशन न्यायपालिका क्लैमाइडिया होते हैं कि प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा सत्यापित करें। अधिक से अधिक से अधिक 2 मीटर व्यास हैं कि समावेशन के भीतर अंगूठी की तरह वस्तुओं के रूप में एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर उज्ज्वल रिक्तिकाएं, और न्यायपालिका क्लैमाइडिया निकायों के रूप में समावेशन को पहचानें।
  9. एक निलंबन में कोशिकाओं 2 मिलीलीटर DH 2 ओ के साथ मध्यम जगह और परिमार्जन ब दिन 5. Lyse संस्कृति। 2 मिलीलीटर 4SP बफर जोड़ें और ~ 27.5 जी सुई के माध्यम से 5 बार निलंबन से गुजरती हैं।
  10. 6 अच्छी तरह से थाली में एक भी अच्छी तरह से में मैककॉय कोशिकाओं की एक ताजा monolayer संक्रमित करने के लिए सेल lysate के 2 मिलीलीटर का प्रयोग करें। 25 डिग्री सेल्सियस, महाप्राण पर 2 घंटे के लिए lysate के साथ कोशिकाओं को सेते हैं और ताजा वृद्धि जोड़नेपेनिसिलिन जी और cycloheximide युक्त मध्यम।
  11. कोशिकाओं के सामान्य स्वास्थ्य पर निर्भर करता है, 3-5 दिन के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
  12. दोहराएँ (न्यायपालिका निकायों से रहित) सामान्य लग समावेशन उभरा है जब तक 6 अच्छी तरह से थाली में ताजा कुओं में 2.9-2.10 एक या अधिक बार, के रूप में आवश्यक, passaging संस्कृतियों कदम। इस समय यह है कि जांच करने के लिए एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग सी ट्रैकोमैटिस mKate2 (लाल) व्यक्त करते हैं।
  13. टी 150 बोतल में उगाई संक्रमित मैककॉय या हेला कोशिकाओं से क्लैमाइडिया transformants कटाई द्वारा उदाहरण के लिए उच्च अनुमापांक chlamydial शेयरों की पीढ़ी के लिए संक्रमित संस्कृतियों, ऊपर स्केल।

3. क्लैमाइडिया के साथ कोशिकाओं को संक्रमित

  1. IFU दृढ़ संकल्प और multiwell स्क्रीनिंग के लिए उदाहरण के गिलास नीचे बर्तन या कक्ष स्लाइड उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए, या 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए वांछित संस्कृति पोत पर प्लेट GFP-हेला कोशिकाओं।
  2. Fro गला लेंसी युक्त ज़ेन ट्यूब ट्रैकोमैटिस, सी muridarum, या सी उदाहरण के MOI 1 = के लिए बर्फ पर निमोनिया और संक्रमण के वांछित बहुलता (MOI) HBSS में पतला।
  3. उपयोग किया जाएगा कि विशेष रूप से क्लैमाइडिया तनाव के आधार पर स्थिर या centrifugation सहायता प्राप्त या तो संक्रमण के प्रदर्शन करना।
    1. सी के साथ संक्रमण के लिए ट्रैकोमैटिस LGV serovar एल 2 या सी muridarum, HBSS के साथ GFP-हेला कोशिकाओं को धोने और 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए पतला बैक्टीरिया के साथ सेते हैं। महाप्राण और HBSS के साथ कोशिकाओं को धोने, और 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में मध्यम विकास में कोशिकाओं को सेते हैं।
    2. सी ट्रैकोमैटिस serovar डी या सी के साथ संक्रमण के लिए निमोनिया, HBSS के साथ GFP-हेला कोशिकाओं को धोने और कोशिकाओं को पतला बैक्टीरिया जोड़ें। एक benchtop अपकेंद्रित्र में एक झूलते बाल्टी रोटर लगाव की एक multiwell थाली धारक में multiwell थाली या (एक multiwell थाली ढक्कन में टेप के द्वारा सुरक्षित) गिलास नीचे डिश रखें।
    3. 1 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 900 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। 1 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेंट्रीफ्यूज और जगह से संस्कृति वाहिकाओं निकालें।
    4. महाप्राण कोशिकाओं को एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, HBSS के साथ कोशिकाओं को दो बार धोने, और ताजा मध्यम विकास जोड़ें। एक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ 2 इनक्यूबेटर में जगह कोशिकाओं।

क्लैमाइडिया समावेशन 4. लाइव सेल विज़ुअलाइज़ेशन

  1. सीओ 2 इनक्यूबेटर से क्लैमाइडिया संक्रमित GFP-हेला कोशिकाओं को हटाने और फिनोल 5 + लाल% FBS के बिना RPMI के साथ मध्यम जगह।
  2. एक 20X या उच्च तेल उद्देश्य का उपयोग कर एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (Nikon ग्रहण तिवारी ई या समान) पर माउंट कोशिकाओं।
  3. बड़े काला छेद (क्लैमाइडिया समावेशन) युक्त हरे रंग की कोशिकाओं: इमेजिंग सॉफ्टवेयर (Volocity 6 या इसी तरह) का उपयोग करना, पर ध्यान केंद्रित करने और पहचान क्लैमाइडिया GFP-हेला कोशिकाओं को संक्रमित।
  4. मार्क इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग ब्याज की क्लैमाइडिया -infected कोशिकाओं से युक्त क्षेत्रों के xyz स्थानों (वॉल्यूमocity 6 या समान)। मैन्युअल XY स्टेज दृश्य मोड में है, जबकि 'अंक जोड़ने' के द्वारा इस कार्य करें। इस तरीके में, xyz निर्देशांक प्रत्येक चिह्नित स्थान के लिए सहेज कर रहे हैं।
  5. अधिग्रहण सेटअप संवाद बॉक्स में, हरे (GFP, हेला साइटोसॉल) और लाल (mKate2, सी ट्रैकोमैटिस) चैनल, और चैनल के अनुसार नया फ्रेम हर 5 मिनट की दर से प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर विन्यस्त।
  6. प्रोटोकॉल "कब्जा / रिकार्ड" बटन पर क्लिक करके ऊपर दर्ज किए गए अधिग्रहण का उपयोग कर छवि अनुक्रम मोल।

जीवित कोशिकाओं में समावेशन वृद्धि मानदण्डों के 5. Quantitation

  1. वांछित समय के बाद संक्रमण (जैसे।, 24, 48 एचपीआई) क्लैमाइडिया इनक्यूबेटर से GFP-हेला संक्रमित कोशिकाओं को हटाने और एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर माउंट। नोट: एक उच्च एनए के साथ एक 20x या 40X हवा उद्देश्य 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए सबसे उपयुक्त है, और एक 40x तेल उद्देश्य चैम्बर स्लाइड्स के लिए सिफारिश की है। इस गधे के लिए या तो सब्सट्रेट पर कोशिकाओं को विकसितप्र।
  2. समावेशन उनके अधिकतम व्यास कहाँ पर हैं कोशिकाओं के midplanes पर ध्यान दें और कुरकुरा किनारों उपज।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से (प्रति अच्छी तरह से कम से कम 10) में कई क्षेत्रों के लिए छवियों का मोल; कुओं आम तौर पर प्रतिकृति या प्रयोगात्मक चर का प्रतिनिधित्व करते हैं।
  4. आंखों से (समावेशन GFP-हेला कोशिकाओं में काला डिब्बों कर रहे हैं), मैन्युअल समावेशन की संख्या की गणना करें या स्वतः समावेशन की पहचान और गिनती करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर एल्गोरिदम का उपयोग करें।
    1. प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा GFP-हेला कोशिकाओं का पता लगाएं (कमांड 'वस्तुएँ खोजें') और कोशिकाओं के रिश्तेदार तीव्रता के आधार पर प्रतिदीप्ति दहलीज तीव्रता को समायोजित।
    2. उन केवल अधिक से अधिक 5 माइक्रोन 2 रखने का आकार दिशानिर्देशों का उपयोग फ़िल्टर चयनित वस्तुओं। इस 'जनसंख्या 1' है।
    3. इनपुट के रूप में 'जनसंख्या 1' का उपयोग कमांड 'वस्तुओं में छेद भरने' लागू करें। यह कदम 'जनसंख्या 2' उत्पन्न करता है।
    4. 'पी से घटाना' जनसंख्या 1 'opulation 2 'जनसंख्या 3' सकारात्मक रूप में नामित क्लैमाइडिया समावेशन, चिह्नित उपज के लिए '।
    5. उदाहरण रखते हुए वस्तुओं के लिए, 'आबादी 3' ('फिल्टर जनसंख्या' कमांड) के आकार फिल्टर लागू 24 घंटा या उससे अधिक समय के लिए संक्रमित कोशिकाओं में समावेशन के लिए अधिक से अधिक 25 माइक्रोन 2। इन समावेशन बहुत छोटे होते हैं, जैसे से पहले 18 घंटा के रूप में जल्दी संक्रमण समय के लिए, सेट आकार फिल्टर, 4 माइक्रोन 2 से अधिक से अधिक वस्तुओं रखने के लिए। 'समावेशन' के रूप में नामित वस्तुओं की आबादी में आकार छानने का परिणाम है।
    6. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, मात्रात्मक उदाहरण के लिए छवियों से डेटा, शामिल किए जाने की संख्या, शामिल किए जाने के आकार, और शामिल किए जाने की परिधि की गणना।

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Representative Results

साइटोसोलिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, GFP) व्यक्त स्तनधारी कोशिकाओं रहते हैं, संक्रमित कोशिका संस्कृतियों में क्लैमाइडिया समावेशन की रोशनी को सक्षम करने के लिए इंजीनियर की जा सकती है। क्लैमाइडिया के साथ संक्रमण पर, समावेशन मेजबान कोशिकाओं (चित्रा 1) में काले धब्बे के रूप में आसानी से दिखाई दे रहे हैं। प्रतिदीप्ति कमी समावेशन की स्पष्टता देखने और / या उपचार (चित्रा 1) के कई क्षेत्रों में समावेशन की स्वचालित पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। फ्लोरोसेंट मेजबान कोशिकाओं उत्पन्न किया गया है एक बार, एक नया शक्तिशाली कार्यप्रवाह प्रयोगात्मक नमूनों में chlamydial संक्रमण के स्तर की तेजी, मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सक्षम है। एक प्रमुख आवेदन रहते हैं, संक्रमित कोशिकाओं में क्लैमाइडिया शामिल किए जाने के गठन इकाइयों (IFU) (चित्रा 2) के दृढ़ संकल्प है। इस प्रयोगात्मक रणनीति हैं जो नियमित रूप से क्षेत्र में उपयोग किया जाता है कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रक्रियाओं, के लिए की जरूरत अनावश्यक दोनों समय लेने वाली औरमहंगा।

वर्णित इमेजिंग दृष्टिकोण की एक और महत्वपूर्ण विशेषता इसके अलावा, chlamydial समावेशन के महत्वपूर्ण जैविक विशेषताओं की व्युत्पत्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह आसानी से किसी भी क्लैमाइडिया प्रजाति या तनाव के लिए लागू किया जा सकता है, और। एक उदाहरण के रूप में, GFP हेला कोशिकाओं के एक समय के पाठ्यक्रम विश्लेषण सी से संक्रमित ट्रैकोमैटिस LGV serovar एल 2, सी ट्रैकोमैटिस serovar डी, सी muridarum, और सी निमोनिया 16, 24, और 48 HPI (चित्रा 3) पर प्रदर्शन किया गया था। इन क्लैमाइडिया प्रजातियों और दबाव से प्रत्येक के लिए, समावेशन चिह्नित और लंबाई परिधि, उनकी औसत क्षेत्रफल की गणना करने के लिए विश्लेषण, और कई बार सेल प्रति संख्या (चित्रा 4) संकेत दिया गया था। इन विशेषताओं chlamydial समावेशन के जीव विज्ञान के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं और वे मेजबान सेल के साथ बातचीत कैसे सूचित करें। वर्णित विधि कि सु एक तरीके से इस जानकारी तक पहुँचने के लिए एक सतही दृष्टिकोण प्रदान करता है अन्य प्रयोगात्मक तकनीक के द्वारा पूरा किया जा सकता है क्या rpasses। रिवर्स लेबलिंग रणनीति का अंतिम उपयोगिता जीवित कोशिकाओं में क्लैमाइडिया समावेशन के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए है। इस का एक उदाहरण मूवी 1 में दिखाया गया है।

चित्र 1
सी चित्रा 1. स्वचालित पता लगाने ट्रैकोमैटिस समावेशन। (ए) GFP-हेला कोशिकाओं (बी) सी mKate2 व्यक्त से संक्रमित थे ट्रैकोमैटिस एल 2 और 24 HPI पर लाइव imaged। एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर आधारित एल्गोरिथ्म स्वचालित रूप से नारंगी में चिह्नित GFP-हेला कोशिकाओं में ब्लैक होल के चयन, (सी) द्वारा chlamydial समावेशन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। (डी) पैनलों ए और बी से संक्रमित कोशिकाओं के एक समग्र छवि भी दिखाया गया है। स्केल बार 20 माइक्रोन =। .jove.com / फ़ाइलें / ftp_upload / 51,131 / 51131fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. क्लैमाइडिया शामिल किए जाने के गठन इकाइयों के quantitation (IFU) कोशिकाओं GFP-हेला में। GFP-हेला कोशिकाओं सी से संक्रमित थे दो अलग-अलग संक्रमण के multiplicities और 24 HPI पर imaged पर ट्रैकोमैटिस एल 2। संक्रमण प्रति 10 क्षेत्रों के लिए समावेशन का पता चला और स्वचालित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रगणित और परिणाम दिया जाता था (एन = 3)। त्रुटि सलाखों मतलब की मानक त्रुटि प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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सी चित्रा 3. समय पाठ्यक्रम ट्रैकोमैटिस serovar एल 2, सी ट्रैकोमैटिस serovar डी, सी muridarum, और सी निमोनिया GFP-हेला कोशिकाओं में संक्रमण। GFP-हेला कोशिकाओं सी से संक्रमित थे ट्रैकोमैटिस LGV serovar एल 2 और (ए) 16 HPI, (बी), 24 HPI, और (सी) 48 HPI पर लाइव प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged। GFP-हेला कोशिकाओं सी से संक्रमित ट्रैकोमैटिस serovar डी (डी) 16 HPI, (ई) 24 HPI, और (एफ) 48 HPI पर imaged थे। GFP-हेला कोशिकाओं सी से संक्रमित muridarum (जी) 16 HPI, (एच) 24 HPI, और (आई) 48 HPI पर imaged थे। GFP-हेला कोशिकाओं सी से संक्रमित निमोनिया(जम्मू) 16 HPI, (कश्मीर) 24 HPI, और (एल) 48 HPI पर imaged थे। छवियों प्रतिनिधि सभी संक्रमणों और समय के लिए दिखाया गया है। स्केल सलाखों 20 माइक्रोन =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रतिनिधि मात्रात्मक डेटा समय बेशक प्रयोगों से निकाली गई। (ए) सी से संक्रमित GFP-हेला कोशिकाओं से समावेशन ट्रैकोमैटिस LGV serovar एल 2, (बी) सी ट्रैकोमैटिस serovar डी, (सी) सी muridarum, और (डी) सी निमोनिया का पता चला और 16, 24 में प्रगणित, और 48 HPI (5 क्षेत्रों समय अंतराल के अनुसार, एन = 3) थे। Chlam की शारीरिक विशेषताओंydial समावेशन शामिल किए जाने की सतह क्षेत्र, लंबाई परिधि में शामिल किए जाने, और सेल प्रति समावेशन की संख्या के लिए मात्रा निर्धारित किया गया। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1 मूवी फ़्रेम
इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। GFP सी से संक्रमित mCherry-हेला कोशिकाओं की मूवी 1. समय चूक वीडियो 48 HPI पर लिया ट्रैकोमैटिस एल 2,। वीडियो 125 मिनट के लिए 5 मिनट के अंतराल पर लगने वाले समय चूक छवियों की एक श्रृंखला से संकलित किया गया। MCherry-हेला कोशिकाओं भर looped वीडियो बारी-बारी (लाल), सी ट्रैकोमैटिस एल 2 (हरा) और दोनों क्षेत्रों की एक मर्ज।

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Discussion

यहाँ हम वास्तविक समय दृश्य और क्लैमाइडिया समावेशन के विश्लेषण के लिए फ्लोरोसेंट मेजबान कोशिकाओं को पैदा करने के लिए प्रयोगात्मक रणनीति का वर्णन है। इस रिक्तिका दृश्य दृष्टिकोण समय के साथ एकल कक्षों कोशिकाओं की आबादी के पार या में chlamydial समावेशन के गतिशील गुण, रोशन ट्रैक और मात्रात्मक को मापने के लिए शक्तिशाली क्षमता प्रदान करता है। क्लैमाइडिया समावेशन फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल की कोशिकाओं में ऊँची अच्छी तरह से वे आसानी से पहचान कर रहे हैं कि इस तरह परिभाषित कर रहे हैं अतिरिक्त Immunofluorescent प्रसंस्करण के लिए आवश्यकता के बिना। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण इस तरह के सेल और शामिल किए जाने वक्रता प्रति रिक्तिकाएं की संख्या के रूप में अलग अलग क्लैमाइडिया प्रजातियों और दबाव के अधिकारी है कि हस्ताक्षर रूपात्मक मतभेद को सुलझाने के लिए काफी संवेदनशील है। इसके अलावा, हम इमेजिंग सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से GFP व्यक्त मेजबान कोशिकाओं में समावेशन की पहचान करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है। आईएल के लिए Immunofluorescent लेबलिंग कदम की obviationchlamydial समावेशन की Lumination इस तरह के शामिल किए जाने के गठन इकाइयों (IFU) के निर्धारण के रूप में समापन बिंदु assays के लिए उपयोगकर्ता के लिए महत्वपूर्ण समय और लागत बचत में यह परिणाम है। संक्रमित कोशिकाओं का एक ही आबादी जिससे समय पाठ्यक्रम के अध्ययन के लिए कुओं या आवश्यक प्लेटों की संख्या को कम करने, chlamydial विकास चक्र पर सटीक समय पर विश्लेषण किया जा करने के लिए इसके अलावा, जीवित कोशिकाओं में छवि समावेशन करने की क्षमता देता है। साइटोसोलिक GFP, mCherry, आदि, photobleaching से ग्रस्त नहीं है कि एक उज्ज्वल, स्थिर संकेत उपज; इस सुविधा लंबा समय चूक इमेजिंग प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। तकनीक क्लैमाइडिया विकासात्मक जीन अभिव्यक्ति की स्वतंत्र है, क्योंकि अंत में, यह क्लैमाइडिया द्वारा सेलुलर संक्रमण के सभी चरणों में समान रूप से प्रभावी है।

लेबलिंग इंट्रासेल्युलर क्लैमाइडिया और झिल्ली 7.8 के लिए मौजूदा रणनीति की तुलना में, इस तकनीक प्रयोगात्मक एक के लिए सादगी और लचीलापन प्रदान करता हैpplications। क्लैमाइडिया से संक्रमित फ्लोरोसेंट मेजबान कोशिकाओं डाई लोड हो रहा है, लेबलिंग या अन्य सेलुलर जोड़तोड़ के लिए किसी की जरूरत के बिना, तुरंत imaged किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण स्पष्ट रूप से illuminates और unlabeled शामिल किए जाने (और बैक्टीरिया) की ल्यूमिनल अंतरिक्ष रखते हुए शामिल किए जाने के किनारों को परिभाषित करता है। रोशन और क्लैमाइडिया संक्रमित कोशिकाओं की गणना के प्रयोजन के लिए, इस दृष्टिकोण का लाभ मुख्य रूप से इसलिए जी संस्कृतियों, और यह प्रावधान महत्वपूर्ण समय बचत के साथ अपनी संगतता में निहित है। हालांकि, लेबलिंग और क्लैमाइडिया युक्त रिक्तिका ही की मात्रात्मक मापदंडों की व्युत्पत्ति के लिए, इस डिब्बे के लिए वाणिज्यिक एंटीबॉडी व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। नतीजतन, उल्टे GFP के दृष्टिकोण इस रोगज़नक़ डिब्बे की झिल्ली Demarcating के लिए सबसे सुगम और सीधा मतलब रहता है।

एक क्लैमाइडिया visualizat को यह इमेजिंग विधि को लागू करने के लिए महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैंआयन कार्यप्रवाह। यह आदि GFP, mCherry, के स्थिर अभिव्यक्ति के साथ मेजबान सेल लाइनों, अग्रिम में उत्पन्न कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है। Chlamydial समावेशन आसानी से क्षणिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं कि मेजबान कोशिकाओं में पाया जाता है, इस तरीके से तैयार की कोशिकाओं आबादी भर अधूरा अभिकर्मक के साथ ही चर अभिव्यक्ति के स्तर से पीड़ित हैं। इसके अलावा, अभिकर्मक समग्र प्रक्रिया को अनावश्यक कदम कहते हैं। वर्णित विधि की एक और सीमा समावेशन अलग क्लैमाइडिया एसपीपी से निकाली गई है। उनकी रूपात्मक उपस्थिति और वे मेजबान सेल के साथ बातचीत में जो तरीके से भिन्न हो सकता है। इस इमेजिंग दृष्टिकोण का पता लगाने और सी युक्त इमेजिंग समावेशन के लिए काफी मजबूत है ट्रैकोमैटिस, सी muridarum या सी निमोनिया; हालांकि, कुछ क्लैमाइडिया प्रजातियों (सबसे विशेष रूप से सी psittaci और सी caviae) के लिए समावेशन जी को छोड़कर कम सक्षम हैंउनकी ल्यूमिनल अंतरिक्ष से एफपी। सी युक्त समावेशन psittaci या सी caviae GFP-हेला कोशिकाओं में आसानी से दिखाई दे रहे हैं, लेकिन इन समावेशन में कुछ GFP की घुसपैठ समावेशन के सॉफ्टवेयर आधार पर पता लगाने की त्रुटि दर बढ़ जाती है।

समग्र प्रयोगात्मक रणनीति ठीक तरह से लागू किया गया है, नए अवसरों जीवित कोशिकाओं में क्लैमाइडिया समावेशन के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए बनाई गई हैं। इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, या मैनुअल स्कोरिंग द्वारा एक स्वचालित ढंग से या तो - हम इस तकनीक को शामिल किए जाने की गणना के लिए एक सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह के लिए अनुमति देता है कि कैसे प्रदर्शित करता है। इस दृष्टिकोण का एक उपन्यास आवेदन उदाहरण के शामिल किए जाने के लिए क्षेत्र, मात्रा और आकार के लिए शामिल किए जाने के बारे में सार्थक मात्रात्मक डेटा, की व्युत्पत्ति के लिए है। अंत में, इस दृश्य विधि अत्यधिक अनुकूलनीय है और उदाहरण के लिए, क्लैमाइडिया संक्रमित मेजबान कोशिकाओं के जीव विज्ञान में अतिरिक्त जानकारी प्रकट करने के लिए अन्य फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकताGFP- या mKate2 व्यक्त क्लैमाइडिया 6,11, फ्लोरोसेंट actin के 12 या GFP इंक प्रोटीन 13 चिह्नित।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668
Opti-Mem Invitrogen 31985
Polybrene Sigma H9268
0.45 µm filters Fisher 09-719D
G418 Invitrogen 10131
HBSS Invitrogen 14025
DMEM Invitrogen 11995
RPMI 1640 Invitrogen 11875
RPMI 1640 w/o phenol red Cellgro 17-105-CV
Penicillin G Sigma 13752
Cycloheximide Sigma C7698
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II Nunc 154526, 154534

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References

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संक्रमण अंक 104, शामिल किए जाने कोटर GFP mCherry प्रतिदीप्ति रहते सेल इमेजिंग सूक्ष्म जीव विज्ञान
कल्पना और quantitate फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग<em&gt; क्लैमाइडिया</em&gt; रिक्तिका विकास की गतिशीलता जीवित कोशिकाओं में
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Zuck, M., Feng, C., Hybiske, K.… More

Zuck, M., Feng, C., Hybiske, K. Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells. J. Vis. Exp. (104), e51131, doi:10.3791/51131 (2015).

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