Summary
يتكون جدار الخلية البكتيرية من الببتيدوكليكان، وهي شبكة من الخلايا الجزيئية الكلية من خيوط السكر التي يرتبط بها الببتيدات. الترا الأداء الكروماتوغرافيا السائل يوفر دقة عالية والإنتاجية لاكتشافات جديدة من تكوين peptidoglycan. نقدم إجراء لعزل جدران الخلايا (sacculi) وإعدادها للتحليل لاحقا عبر UPLC.
Abstract
جدار الخلية البكتيرية أمر بالغ الأهمية لتحديد شكل الخلية أثناء النمو والانقسام، ويحافظ على السلامة الميكانيكية للخلايا في مواجهة الضغوط turgor عدة أجواء في الحجم. عبر الأشكال والأحجام المتنوعة للمملكة البكتيرية ، يتكون جدار الخلية من peptidoglycan ، وهي شبكة من فروع السكر الجزيئية المتقاطعة بواسطة الببتيدات القصيرة. تكمن الأهمية المركزية ل Peptidoglycan في علم وظائف الأعضاء البكتيرية وراء استخدامه كهدف للمضادات الحيوية وقد حفزت الدراسات الوراثية والهيكلية والبيولوجية للخلايا حول كيفية تجميعها بقوة أثناء النمو والانقسام. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة إلى تحقيقات واسعة النطاق لتوصيف الأنشطة الأنزيمية الرئيسية بشكل كامل في تخليق peptidoglycan والتركيب الكيميائي لجدران الخلايا البكتيرية. يعتبر التصوير الكروماتوغرافي السائل عالي الأداء (HPLC) طريقة تحليلية قوية لقياس الاختلافات في التركيب الكيميائي لجدران البكتيريا التي تزرع في ظل مجموعة متنوعة من الظروف البيئية والجينية ، ولكن إنتاجيتها غالبا ما تكون محدودة. هنا، نقدم إجراء مباشرا لعزل وإعداد جدران الخلايا البكتيرية للتحليلات البيولوجية peptidoglycan عبر HPLC و Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)، وهو امتداد ل HPLC يستخدم مضخات لتقديم ضغوط عالية للغاية تصل إلى 15000 رطل في الثانية، مقارنة ب 6000 رطل في PSI ل HPLC. في تركيبة مع إعداد جدران الخلايا البكتيرية المعروضة هنا ، فإن حاقنات العينة منخفضة الحجم ، والكاشفات ذات معدلات أخذ العينات العالية ، وحجم العينة الأصغر ، وأوقات التشغيل الأقصر ل UPLC ستمكن من دقة عالية وإنتاجية لاكتشافات جديدة لتكوين peptidoglycan وبيولوجيا الخلايا البكتيرية الأساسية في معظم المختبرات البيولوجية مع إمكانية الوصول إلى جهاز طرد فائق و UPLC.
Introduction
الهدف من الطريقة الموصوفة هنا هو عزل جدران الخلايا البكتيرية السليمة (sacculi) وهضم peptidoglycan (PG) بحيث يمكن استخدام التصوير اللوني السائل فائق الأداء (UPLC) لتوفير معلومات مثل هوية مكونات الموروببتيد وتركيزاتها ، ومتوسط طول خيوط الجليكان ، وجزء من المواد المشاركة في الروابط المتقاطعة بين الخيوط. لمناقشة مفصلة للكيمياء الحيوية PG والأنواع muropeptide، وهناك العديد من الاستعراضات الممتازة التي تصف بنية PG ودورها في العدوى والمقاومة، مورفوجينيسيس، والنمو1-6. تم تطوير الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) لتحليل PG في البداية من قبل Glauner و Schwarz في الثمانينيات ، وفي الآونة الأخيرة تم تعزيزها وتطبيقها على نطاق واسع في مختبرات ميغيل دي بيدرو وفالدمار فولمر. استخدمت الأساليب السابقة تحليل الأحماض الأمينية أو الكروماتوغرافيا الورقية ، والتقنيات المستهلكة للوقت والمملة التي لا تسفر عن تقييمات دقيقة أو كاملة لمكونات جدار الخلية.
يمكن تنفيذ تحليل UPLC بسهولة في أي مختبر أبحاث أساسي يمكنه الوصول إلى جهاز طرد مركزي فائق و UPLC. إن طريقة UPLC التي نقدمها أدناه تعزل التكشير الكامل ، وبالتالي توفر معلومات كمية شاملة عن جميع الأنواع الكيميائية فيها. هذه الطريقة تسفر عن تحديد كمي دقيق لجميع muropeptides عبر مجموعة من البكتيريا، وكلها في غضون 20 دقيقة تشغيل UPLC. ولا ينطوي تنفيذ هذه الطريقة إلا على المهارات المختبرية الأساسية، دون استثمار مالي كبير في المواد. من أجل تنفيذ الخطوات في هذه الطريقة ، يحتاج الباحثون فقط إلى أن يكونوا ماهرين في الأنابيب ، وإعداد المخازن المؤقتة والإنزيمات ، وضبط درجة الحموضة ، مما يجعلها في متناول مجموعة واسعة من التخصصات العلمية. اختيار الانزيمات المستخدمة في هذا البروتوكول يعتمد على أنواع البكتيريا التي يجري تحليلها. البروتوكول الموصوف هنا مفيد لEscherichia coli، وقد وجد بشكل عام أنه مناسب لعزل الساكولي عن الكائنات الأخرى السلبية للجرام. ينصح بالتشاور مع الأدب عند تطبيق هذه الطريقة على البكتيريا إيجابية الغرام. في هذه الأنواع، كان تنقية sacculus تقليديا أكثر صعوبة. على وجه الخصوص ، قد يكون من الضروري تغيير هذه الطريقة من حيث اختيار الإنزيم وطول أوقات الهضم لاستيعاب الجدران الأكثر سمكا والبوليمرات الملحقة مثل الأحماض التيتشويك من البكتيريا الإيجابية الغرام. الانزيم الأول في هذا البروتوكول يشق الغشاء الخارجي البروتين الدهني (مثل بروتين الدهون براون، أو Lpp) مرفق peptidoglycan، وبالتالي الإفراج عن جميع ما عدا C-محطة دي -(أو ثلاثي) الببتيد من Lpp من جدار الخلية. هذه الخطوة ضرورية عند فحص Enterobacteria ، ولكن العديد من البكتيريا السلبية الغرام الأخرى ليس لها مكافئات Lpp ، وبالتالي يمكن تخطي هذه الخطوة. إنزيم ثان يشق على وجه التحديد بعد مكون حمض الموميكم من peptidoglycan، solubilizing وحدة فرعية disaccharide التي تشكل الأنواع muropeptide. لتوفير تقييم دقيق لبنية PG ، يجب توخي الحذر في هضم الساكولي لمنع انشقاق الممرات أو أي جزء آخر من جذع الببتيد.
على الرغم من أن التركيبات الكيميائية للبيبتيدوغليكان من أكثر من 100 سلالة من ~ 40 نوعا بكتيريا قد تم تحليلها من قبل HPLC ، لم يتم إجراء أي تحليلات باستخدام تقنية UPLC. بالإضافة إلى ذلك ، تميزت الأعمال السابقة peptidoglycan من جزء صغير فقط من المجال البكتيري ، محدودة جزئيا من إنتاجية HPLC. لذلك ، فإن نشر هذه الطريقة على أكبر عدد ممكن من الباحثين ، والتنفيذ على منصات UPLC ، سيكون حاسما لدفع الدراسات الفسيولوجية للكسر الكبير من الأنواع البكتيرية التي لم يتم تصنيف peptidoglycan لها بعد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تنمو الثقافات البكتيرية في 2.5 مل من وسائل الإعلام بين عشية وضحاها
العودة المخفف الثقافات 1:100 إلى 250 مل من وسائل الإعلام الطازجة وتنمو إلى OD600 من 0.7-0.8. إعداد محلول من كبريتات دودسيل الصوديوم 6٪ (SDS) في الماء.
تنبيه: مسحوق SDS خطر - تجنب استنشاق مسحوق SDS؛ ارتداء قناع على الأنف والفم.
2. يوم 1 -- يتم تنفيذ الثقافات البكتيرية Lysing على مدار يوم واحد وبين عشية وضحاها
- في حين أن الثقافات المخففة تنمو، قم بإعداد حمام ماء مغلي على طبق ساخن في كوب 1 L. مرة واحدة في الماء يغلي، aliquot 6 مل من 6٪ SDS في أنابيب البولي بروبلين 50 مل، إضافة شريط واحد ضجة صغيرة إلى كل أنبوب، وتأمين أغطية أنبوب إلى إصبع ضيق، ووضع أنابيب في حمام الماء، وبدوره على اثارة إلى 500 دورة في الدقيقة على لوحة ساخنة.
- حصاد الثقافات 250 مل في 5000 × غرام لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والكريات resuspend في 3 مل من وسائل الإعلام أو 1x الفوسفات العازلة المالحة. تعليق الخلية ماصة ببطء في أنابيب 50 مل مع 6٪ SDS الغليان لlyse الخلايا (التركيز النهائي 4٪ SDS) في حين أن الأنابيب غارقة في حمام الماء المغلي، وإعادة حبس الأغطية إلى إصبع ضيق. يجب نقل تعليق الخلية بسرعة إلى SDS المغلي بمجرد إعادة الإنفاق. وينبغي تجنب التغيرات البيئية المفاجئة، لأن هذا يمكن أن يسبب تغيير خاطئ في هيكل جدار الخلية.
- يغطى حمام الماء المغلي ويسمح للخلايا بالغليان لمدة 3 ساعات، والتحقق من مستوى الماء بشكل دوري وإعادة ملء حمام الماء عند الضرورة. بعد 3 ساعات، قم بإيقاف تشغيل عنصر التدفئة في الطبق الساخن، والاستمرار في إثارة بين عشية وضحاها في 500 دورة في الدقيقة.
3. يوم 2 -- يتم تنفيذ الهضم الأنزيمية على مدار يوم واحد
- إذا عجلت SDS في أنابيب 50 مل بين عشية وضحاها، تعيين حمام الماء ليغلي لمدة 1-2 ساعة إضافية. تشغيل كتلة الحرارة إلى 60 درجة مئوية. إعداد 1 ملغ / مل مخزون من Pronase E في 10 mM تريس-HCl (الرقم الحموضة 7.2) + 0.06٪ ث / ضد NaCl وتنشيط Pronase E في 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- استخدام جهاز طرد فائق ضبط في 400،000 × ز لتدور عينات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من أجل بيليه البوليمرات PG كبيرة وبالتالي تنقيتها من المكونات الخلوية الأخرى. إزالة supernatant بعناية، ومن ثم إعادة إنفاق كل بيليه في درجة حرارة الغرفة المياه فائقة البور. ملاحظة: يعتمد حجم إعادة الإنفاق على حجم أنابيب الطرد المركزي الفائق المستخدمة؛ استخدام وحدة تخزين تملأ الأنابيب على الأقل في منتصف الطريق ولكن لا يتجاوز الحد الأقصى لحجم الأنابيب. كرر الطرد المركزي / الغسيل حتى الماء لا تشكل فقاعات أثناء إعادة الإنفاق، مما يشير إلى أن SDS قد أزيلت تماما (عادة ثلاثة يغسل). التوقف عن غسل بيليه إذا شكل ترسب أبيض، وهذا يشير إلى أن sacculi تتجمع معا. تكتل ليست كارثية، ولكن كتل ربط بقوة إلى البلاستيك والأواني الزجاجية مما تسبب في فقدان عينة كبيرة. في هذه الحالة، المضي قدما في البروتوكول باستخدام نموذج sacculi متجمعة.
- في الخطوة الأخيرة الطرد المركزي / الغسيل، resuspend العينات في 900 ميكروغرام من 10 mM تريس-HCl (الرقم الحموضة 7.2) + 0.06٪ ث / ضد NaCl ونقلها إلى أنابيب 2 مل مطعون سابقا مع ثقوب في قمم مع إبرة صغيرة. إضافة 100 ميكرولتر من 1 ملغ / مل تنشيط Pronase E (100 ميكروغرام / مل التركيز النهائي) إلى كل عينة واحتضان في 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. تعيين كتلة حرارة مختلفة إلى 100 درجة مئوية.
- أوقف عملية الهضم Pronase E بإضافة 200 ميكرولتر من 6٪ SDS إلى كل عينة وغلي العينات في كتلة الحرارة 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تعيين كتلة حرارة مختلفة إلى 37 درجة مئوية وجعل 1 ملغ / مل من مخزون muramidase (mutanolysin) في 50 متر فوسفات العازلة (درجة الحموضة 4.9).
- كما هو الحال في الخطوة 3.2، استخدم جهاز طرد فائق الحرارة محدد ب 400,000 × غرام لتدور العينات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتغسل بالماء فائق الحرارة لدرجة حرارة الغرفة حتى تتم إزالة SDS بالكامل (عادة ثلاثة يغسل). يعتمد حجم إعادة الإنفاق على حجم أنابيب الطرد المركزي الفائق المستخدمة؛ استخدام وحدة تخزين تملأ الأنابيب على الأقل في منتصف الطريق ولكن لا يتجاوز الحد الأقصى لحجم الأنابيب.
- في الخطوة الأخيرة للطرد المركزي/الغسيل، أعيد تثبيت عينات في 200 ميكرولتر من حاجز فوسفات الصوديوم سعة 50 مليون متر (درجة الحموضة 4.9). يمكن تعديل هذا الحجم وفقا لكمية peptidoglycan في العينة ، ويمكن أن تعتمد على الأنواع. إذا كانت هناك تقارير منشورة سابقا لتحليل HPLC للأنواع ذات الاهتمام ، يمكن تقدير هذا المجلد استنادا إلى هذه الكميات (يمكن العثور على تجميع لدراسات HPLC PG في المعلومات التكميلية للمرجع7). وبالنسبة للأنواع الأخرى، يمكن تنفيذ الإعدادية التكلسية حتى هذه الخطوة، ثم يمكن إضافة كميات مختلفة من أحجام إعادة الإنفاق لتكرار العينات من أجل تحديد الحد الأدنى من الحجم الذي يسمح ل PG بالبقاء في الحل (انظر المناقشة لمزيد من التقديرات). إذا كانت العينة تحتوي على أكثر peptidoglycan, زيادة حجم إعادة الإنفاق; إذا كان لدى العينة peptidoglycan قليلا، والحد من حجم إعادة الإنفاق إلى الحد الأدنى من 50 ميكرولتر.
- نقل العينات إلى أنابيب 1.5 مل وإضافة 1 ملغ / مل muramidase لإعطاء تركيز النهائي من 40 ميكروغرام / مل. حضانة 6-8 ساعة أو بين عشية وضحاها في 37 °C.
4. اليوم الثالث - إعداد العينات ل UPLC يتم في اليوم الأخير
- تشغيل كتلة الحرارة إلى 100 درجة مئوية. غلي العينات دون SDS لمدة 5 دقائق لوقف الهضم muramidase. عينات الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 16000 × غرام في درجة حرارة الغرفة ، ثم نقل supernatant (muropeptides قابلة للذوبان الآن) إلى أنابيب زجاجية 13 ملم × 100 ملم. في محاولة لاستعادة أكبر قدر ممكن من supernatant، والحصول على مقربة جدا من بيليه دون إزعاج ذلك.
- ضبط درجة الحموضة بإضافة 500 mM بورات العازلة (درجة الحموضة 9) إلى عينة لتركيز النهائي من 100 متر بورات المخزن المؤقت. البورات العازلة متوافق مع عامل الحد من بوروهيدريد الصوديوم. إضافة 1-2 حبات من بوروهيدريد الصوديوم للحد من كل عينة والسماح للتفاعل المضي قدما لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. تنبيه: بوروهيدريد الصوديوم هو رد فعل للغاية وخطير للتعامل مع - تجنب الاتصال مع الجلد (ارتداء قفازات) وتجنب الاتصال مع العينين (ارتداء نظارات السلامة).
- ضبط العينات إلى درجة الحموضة 3-4 (نقطة الموروببتيد isoelectric ~ 3.5) مع 50٪ v/v حمض orthophosphoric باستخدام زيادات 20 ميكرولتر حتى الرقم القياسي 6، كما تقاس مع ورقة مؤشر درجة الحموضة، ثم باستخدام زيادات 2 ميكرولتر. تنبيه: حمض Orthophosphoric هو تآكل وخطير للتعامل مع - تجنب الاتصال مع الجلد (ارتداء قفازات) وتجنب الاتصال مع العينين (ارتداء نظارات السلامة). وينبغي أن فقاعة العينة استجابة لإضافة حمض orthophosphoric; عندما يتوقف العينة bubbling، يشير هذا عادة إلى pH من 6 تم الوصول إليها. إذا لم يحدث أي فقاعات في العينة، وهذا قد يشير إلى أن كمية بوروهيدريد الصوديوم المضافة كانت صغيرة جدا. في هذه الحالة، والتوقف عن خفض درجة الحموضة، إضافة بعناية واحدة أو حبتين من بوروهيدريد الصوديوم، والسماح للرد لمدة 5-10 دقيقة، ثم استئناف التكيف درجة الحموضة.
- عينة تصفية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر مباشرة في قارورة UPLC. إذا تشكلت عجلة، تسخين الأنبوب مع عدة يمر عبر لهب قبل التصفية. إذا لم يتم حقن العينة في أداة UPLC خلال اليوم، قم بالتجميد عند -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. يمكن تخزين العينات لمدة تصل إلى سنة عند -80 درجة مئوية. يمكن إذابة العينة عن طريق المرور عبر لهب عدة مرات.
- حقن 10 ميكرولتر من كل عينة على أداة UPLC مجهزة C18 1.7 ميكرومتر عكس المرحلة العمود وكاشف امتصاص مجموعة لرصد 202-208 نانومتر. يتم حقن العينات بشكل تسلسلي ، ولكن قدرات autosampler تسمح بمعالجة ما يصل إلى 96 عينة دفعة واحدة. استخدام 50 مليون فوسفات الصوديوم (الرقم الحموضة 4.35) + 0.4٪ v/v آزيد الصوديوم للمذيبات A، و 75 مليون فوسفات الصوديوم (الرقم الحموضة 4.95) + 15٪ v/v الميثانول للمذيب B. ملاحظة: يتم إضافة ثاني أكسيد الصوديوم للتعويض عن امتصاص 205 نانومتر من الميثانول لتجنب الانجراف الأساسي. تعيين تدفق إلى 0.25 مل / دقيقة واستخدام التدرج الخطي أكثر من 25 دقيقة لتحقيق 100٪ المذيبات B واليون متسلسلة من muropeptides في غضون 30 دقيقة. إذا كان سيتم استخدام قياس الطيف الكتلي لتوصيف muropeptides بعد UPLC، وجمع أجزاء من ذروة الاهتمام في جامع الكسور وتجفيف الكسور باستخدام المبخر الطرد المركزي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الإجراء المبين في الشكل 1، يجب أن تتكون العينة النهائية من 200 ميكرولتر على الأقل من محلول واضح تم تصفيته مباشرة في قارورة UPLC (الخطوة 4.4). يعتمد فصل UPLC لمختلف الموروببتيدات في عينة بكتيرية على قابليتها النسبية للذوبان بين مرحلة الهاتف المحمول السائل والمرحلة الثابتة للعمود. عكس المرحلة C18 الأعمدة توفير مصفوفة مسعور بقوة لفصل الأنواع muropeptide على أساس رهاب الماء وحجم8; القطبية، وانخفاض الوزن الجزيئي مونومرات elute الأولى، والقطبي، وارتفاع الجزيئية الوزن الأوليغومرات elute بعد (الشكل 2). تظهر نتيجة UPLC نموذجية في الشكل 2، مع الكشف عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 202-208 نانومتر كدالة للوقت الذي يحدد وقت استبقاء muropeptide معين. تظهر هذه النتيجة التمثيلية دقة واضحة بين معظم أنواع الموروببتيد وقوة الإشارة القوية عبر الطيف ، مما يتيح التحليل ، ومتوسط طول حبلا الجليكان.
تتضمن الخطوة الأخيرة الموضحة في الشكل 1 ضبط درجة الحموضة وتصفية أي جسيمات دقيقة قد تسد الأبعاد الصغيرة للأنابيب المستخدمة في UPLC. إذا تم تركيز عينة فائقة، على سبيل المثال عن طريق إعادة تعليق في 100 ميكرولتر من العازلة فوسفات الصوديوم في الخطوة 3.5 بدلا من 200 ميكرولتر، قد تتحول العينة غائم، مما يشير إلى أنه تم تحقيق تركيز حرج وعجلت muropeptides. سيؤدي فقدان الذوبان هذا إلى انسداد فلتر المحاقن المستخدم في الخطوة 4.4 ، مما يمنع ترسب الموروبيدات في قارورة UPLC و / أو انسداد قنوات وعمود آلة UPLC ، وهي عناصر مكلفة لاستبدالها. يظهر مثال على الرسم اللوني يعكس معالجة العينة الشاذة هذه في الشكل 3؛ لا قمم eluted، مما أدى إلى عدم وجود أي بيانات عن تكوين PG. قد يؤدي أيضا تعديل درجة الحموضة إلى أقل بكثير من نقطة الأيزوليكتريك في الموروببتيدات(على سبيل المثال إلى درجة الحموضة من 2) إلى هطول الأمطار من الموروببتيدات وبالتالي عدم وجود قمم ملحوظة من تحليل UPLC.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 تخطيطي لإعداد السكولي. تعتمد هذه الطريقة على جولات متكررة من الطرد المركزي الفائق لتنقية SDS بعيدا عن الساكولي الحبيبي.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم مثال على ذلك الرسم اللوني UPLC من PG من sacculi هضمها من خلايا E. coli MG1655. لاحظ أن يتم تحقيق دقة قابلة للمقارنة من جميع muropeptides في 10٪ من الوقت من تشغيل HPLC نموذجية. تسميات موروبيبتيد - M = مونومر، D = ديمر، T = تريمر. (2,3,4,5) تشير إلى عدد الببتيدات الجذعية الأحماض الأمينية; التعديلات - G = الجليسين استبدال L-ألانين، L = اثنين من الأحماض الأمينية إضافية من شق E Pronase، D = 3،3-diaminopimelic حمض (DAP) - DAP الجسر المتقاطع، N = إنهاء أنهيدرو موروبيبتيد. على سبيل المثال، D33DL هو ديمر مع الببتيدات الجذعية 3-aa، مرتبطة من خلال جسر متقاطع DAP-DAP، تحتوي على اثنين إضافيين من الأحماض الأمينية من شق Pronase E.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن تحليل UPLC غير ناجحة من sacculi هضمها من خلايا E. القولونية MG1655. غياب القمم، مما يدل على أنه لم يكن هناك muropeptides موجودة في العينة، ويرجع ذلك إلى muropeptides تحطمها من الحل قبل استخراج في قارورة UPLC (الخطوة 4.4). قد يكون هذا هطول الأمطار بسبب التركيز المفرط للمروببتيدات أو إلى أن الحموضة منخفضة جدا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوة حاسمة في هذا الإجراء هي الخطوة 3.1 من اليوم الثاني لإعداد العينة. إذا عجلت SDS بين عشية وضحاها، أو إذا تم تخزين العينات في 4٪ SDS لعدة أسابيع في درجة حرارة الغرفة، يجب إعادة الحصول على العينات لمدة ساعة واحدة على الأقل لإعادة إصدار SDS. السبب الشائع لهطول الأمطار SDS هو استخدام وسائل الإعلام مع أملاح البوتاسيوم، لذلك ينبغي تجنب البوتاسيوم في وسائل الإعلام إذا كان ذلك ممكنا. كما ذكر في قسم النتائج التمثيلية، من المهم أيضا ضبط درجة الحموضة على داخل نقطة الأيزوليكتريك للمروبيدات (~3.5)، ولكن ليس أقل بكثير من درجة الحموضة 3، أو قد تعجل المادة. وأخيرا، يجب أن يحدث إعادة إنفاق العينة في الحجم المناسب من العازلة فوسفات الصوديوم (الخطوة 3.5)، والتي يجب أن يحكم عليها الباحث. عند اختيار حجم إعادة الإنفاق من العازلة فوسفات الصوديوم، من المهم النظر في كمية المواد muropeptide من المرجح أن يتم إنشاؤها من ثقافة بكتيرية معينة. على سبيل المثال، إذا كان حجم الثقافة النهائية هو 250 مل، كما هو موضح أعلاه، يجب إعادة إنفاق العينة في ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من العازلة فوسفات الصوديوم. إذا قام الباحث بتعديل الطريقة إلى 50 مل من الثقافات ، فقد يتم إعادة إنفاق العينات في 100 ميكرولتر من حاجز فوسفات الصوديوم أو أقل. ومن المهم أيضا النظر في الكميات المتوقعة من الببتيدوغوريكان في الأنواع؛ على سبيل المثال، تحتوي شفرات الإشريكية القولونية على بيبتيدوغليكان أقل بكثير (حوالي 7٪ من الكمية في خلايا الإشريكية القولونية من النوع البري10)،وبالتالي فإن إعادة الإنفاق في 100 ميكرولتر أو أقل من حاجز فوسفات الصوديوم مناسب. إذا كان من الصعب زراعة نوع بكتيري معين أو سلالة إلى كميات كبيرة (250 مل) ، يمكن تقليل حجم الثقافة النهائي و / أو تخفيف الثقافة بين عشية وضحاها. وأخيرا، يتطلب الحقن في نظام HPLC حدا أدنى من الحجم يبلغ 200 ميكرولتر، في حين أن 10 ميكرولتر كافية لنظام UPLC.
يمكن ضبط تنقية مكونات PG في كائنات حية مختلفة أو لتطبيقات مختلفة عن طريق تغيير نوع المرحلة المتنقلة والعمود والتدرج على أداة UPLC. ويمكن استخدام المراحل المتنقلة القائمة على المذيبات، مثل الأستونيتريل، لتحلية العينات قبل قياس الطيف الكتلي. قد تكون هناك حاجة أيضا كيمياء عمود مختلفة لتحلية عينات بدقة للتحليل اللاحق. ويبين الشكل 2 ملامح elution المشتركة من muropeptides لجراثيم على شكل قضيب سلبية غرام E. القولونية MG1655; تحليل PG من البكتيريا إيجابية غرام و / أو الأنواع مع الأشكال الأخرى قد تتطلب صقل التدرج المبينة في الخطوة 4.5. على الرغم من أن أطياف UPLC مثل تلك الموضحة في الشكل 2 تولد العديد من فئات المعلومات المتعلقة peptidoglycan ، مثل هوية muropeptide ، والنسبة المئوية المتقاطعة ، وطول حبلا الجليكان ، فإن الطريقة لديها العديد من القيود ، بما في ذلك عدم القدرة على رسم خريطة التوزيع المكاني للميزات الهيكلية عبر sacculi. على سبيل المثال، لا يمكن تمييز مواقع التشنج عبر سلسلة الجليكان ولا مواقع البروتينات الدهنية المقيدة عبر HPLC أو UPLC.
مزايا تحليل التركيب الكيميائي للPG مع HPLC تشمل ارتفاع القرار، أقصر وقت التحليل، وكمية دقيقة11 مقارنة مع التقنيات التقليدية مثل تحليل الأحماض الأمينية12-14 أو الكروماتوغرافيا ورقة15،16. تقدم UPLC سرعة وحساسية أعلى من HPLC بسبب الضغوط العالية التي تمكن من تدفق أسرع وبالتالي أوقات تشغيل أقصر. لا يتم التضحية القرار مع UPLC، كما دون 2 ميكرومتر أعمدة حجم الجسيمات، وأجهزة الكشف عن معدل أخذ العينات عالية، وحقن منخفضة الحجم قادرة على تحمل الضغوط العالية جدا، وبالتالي تعمل بدقة بسرعات عالية17،18. وهذا يؤدي إلى القدرة على تحليل أحجام العينة على ترتيب 1 ميكرولتر في عشرات الدقائق، مقارنة مع 200 ميكرولتر وساعات لHPLC.
وتشمل التقنيات التي تكمل UPLC تحليل كتلة الموروبيبتيد عن طريق قياس الطيف الكتلي. UPLC ليست تقنية مدمرة؛ بل هي تقنية مدمرة. يمكن جمع اليوات من العمود بعد الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية وتجفيفها باستخدام جهاز التبخير الطرد المركزي المتاحة عادة في معظم المختبرات. على الرغم من أن العينة يمكن تحليتها لإعدادها لقياس الطيف الكتلي (الخطوة 4.5) ، فإن تقنية Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization - وقت قياس الطيف الكتلي للرحلة تمكن من التحليل دون حساسية كبيرة لتركيز الملح19، وتسفر عن بيانات كتلية قادرة على تحديد محدد للمروبيدات. تبلغ تكلفة إعداد عينة جدار الخلية الواحدة ل UPLC حوالي 6-7 دولارات ، بما في ذلك تكاليف الإنزيمات والمواد الكيميائية والإمدادات المستخدمة. نظرا لتكاليف التشغيل غير المكلفة ، وسهولة الوصول ، وفائدة واضحة لدراسات جدار الخلية البكتيرية ، يجب أن تصبح UPLC الطريقة المفضلة للقياس الكمي عالي الدقة وعالي الإنتاجية والدقيق لتكوين peptidoglycan في جميع أنحاء المملكة البكتيرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تم رعاية تكاليف الإنتاج لهذه المقالة من قبل شركة ووترز.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مدير المعاهد القومية للصحة جائزة المبتكر الجديد DP2OD006466 (إلى K.C.H.). يشكر المؤلفون راسل موندز على العرض العملي للطريقة وعلى المناقشات العلمية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler |
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A.
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A.
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U.
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D'Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , Walter De Gruyter Incorporated. (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
