Summary
세균성 세포벽은 펩티드에 의해 교차된 당가닥의 거대 분자 네트워크인 펩티도글리칸으로 구성됩니다. 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피는 펩티도글리칸 조성물의 새로운 발견을 위한 고해상도 및 처리량을 제공합니다. 우리는 세포벽 (sacculi)의 격리와 UPLC를 통해 분석을위한 후속 준비를위한 절차를 제시합니다.
Abstract
세균성 세포벽은 성장과 분열 시 세포 모양의 결정에 중요하며, 강압에 직면하여 세포의 기계적 무결성을 유지합니다. 세균 왕국의 다양한 모양과 크기에 걸쳐, 세포 벽은 펩티도글리칸, 짧은 펩티드에 의해 교차 설탕 가닥의 매크로 분자 네트워크로 구성되어 있습니다. 세균 생리학에 대한 Peptidoglycan의 중앙 중요성은 항생제 표적으로 그것의 사용을 기초하고 성장과 분열 도중 강하게 조립되는 방법의 유전, 구조 및 세포 생물학 연구 결과를 동기를 부여했습니다. 그럼에도 불구 하 고, 광범위 한 조사 는 여전히 완전히 펩 티도 글리칸 합성및 세균 성 세포 벽의 화학 구성에 주요 효소 활동을 특성화 하는 데 필요한. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 다양한 환경 및 유전적 조건하에서 자란 박테리아의 벽의 화학적 조성에 대한 차이를 정량화하는 강력한 분석 방법이지만, 처리량은 종종 제한적이다. 여기서, 우리는 HPLC및 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피 (UPLC)를 통해 펩티도글리칸의 생물학적 분석을 위한 세균성 세포벽의 격리 및 준비를 위한 간단한 절차를 제시합니다, HPLC에 대한 6,000 psi에 비해 최대 15,000 psi의 초고압을 제공하기 위하여 펌프를 이용하는 HPLC의 확장. 여기에 제시 된 세균성 세포벽의 준비와 함께, 낮은 볼륨 샘플 인젝터, 높은 샘플링 비율을 가진 검출기, 더 작은 샘플 볼륨, UPLC의 짧은 실행 시간은 초음파 심분리기 및 UPLC에 대한 액세스 와 대부분의 생물학적 실험실에서 펩티도글리칸 조성 및 기본 세균 세포 생물학의 새로운 발견을위한 고해상도 및 처리량을 가능하게 할 것이다.
Introduction
본 명세서에 기재된 방법의 목적은 그대로 세균세포벽(sacculi)을 분리하고, 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피(UPLC)가 점혈구 성분의 정체성과 농도, 글리칸 가닥의 평균 길이 및 가닥 사이의 교차링크와 관련된 물질의 분획과 같은 정보를 제공하는 데 사용될 수 있도록 펩티도글리칸(PG)을 소화하는 것이다. PG 생화학 및 무로프타이드 종에 대한 상세한 논의를 위해, PG 구조와 감염, 저항, 형태 발생 및 성장1-6의역할을 설명하는 몇 가지 우수한 리뷰가 있습니다. PG 분석을 위한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 1980년대에 글라우너와 슈바르츠에 의해 처음 개발되었으며, 최근에는 미겔 드 페드로와 발데마르 볼머의 실험실에서 광범위하게 강화되고 적용되었습니다. 이전 방법은 아미노산 분석 또는 종이 크로마토그래피, 세포벽 성분의 정확하거나 완전한 평가를 산출하지 않는 시간 소모적이고 지루한 기술을 활용했습니다.
UPLC 분석은 초원심분리기 및 UPLC에 접근할 수 있는 모든 기본 실험실에서 쉽게 구현될 수 있습니다. 우리가 아래에 존재하는 UPLC 방법은 완전한 사쿠리를 분리하여 그 안에있는 모든 화학 종에 대한 포괄적이고 정량적 인 정보를 제공합니다. 이 방법은 박테리아의 인구에 걸쳐 모든 muropeptides의 정확한 정량화를 산출, 모두 20 분 UPLC 실행 내에서. 이 방법의 구현은 재료에 상당한 재정적 투자없이, 기본적인 실험실 기술을 포함한다. 이 방법의 단계를 실행하기 위해, 연구원은 파이펫팅, 완충제 및 효소를 준비하고, pH를 조정하는 데만 숙련되어 광범위한 과학적 분야에 접근할 수 있어야 합니다. 이 프로토콜에 사용되는 효소의 선택은 분석되는 박테리아의 종에 따라 달라집니다; 여기에 설명된 프로토콜은 대장균에유용하며 일반적으로 다른 그람 음성 유기체로부터 사쿠리를 분리하기에 적합한 것으로 나타났습니다. 문헌과의 상담은 그램 양성 균에이 방법을 적용 할 때 권장됩니다; 이 종에서, 타분 정화는 전통적으로 더 어려웠다. 특히, 이러한 방법은 그람 양성 균의 테이초크산과 같은 두꺼운 벽 및 부속품 폴리머를 수용하기 위해 효소 선택 및 소화 시간의 길이 측면에서 변경되어야 할 수 있다. 이 프로토콜의 첫 번째 효소는 펩티도글리칸에 부착된 외부 막 지단백(Braun의 지단백질 또는 Lpp)을 갈라서 세포벽으로부터 Lpp의 C-말단 디-(또는 트라이-) 펩타이드를 제외한 모든 것을 방출한다. 이 단계는 Enterobacteria를 검사할 때 필요합니다, 그러나 많은 그밖 그람 음성 박테리아에는 Lpp 등가물이 없습니다, 그러므로 이 단계는 건너뛸 수 있습니다. 두 번째 효소는 특히 펩티도글리칸의 무암산 성분 을 쫓아, 무로프티드 종을 형성하는 불각체 서브유닛을 용해한다. PG의 아키텍처에 대한 정확한 평가를 제공하기 위해, 크로스브릿지 또는 펩티드 줄기의 다른 부분의 분열을 방지하기 위해 사쿠리를 소화하는 데 주의를 기울여야 한다.
100종 이상의 세균성 종의 펩티도글리칸의 화학 조성물은 HPLC에 의해 분석되었지만 UPLC 기술로는 분석이 수행되지 않았습니다. 또한, 이전 작품은 세균 영역의 극히 일부만에서 펩티도글리칸을 특징으로 하며, 일부는 HPLC의 처리량에 의해 제한된다. 따라서, 가능한 한 많은 연구자에 이 방법의 보급, UPLC 플랫폼에 구현, 그의 펩티도글리칸아직 분류되지 않은 세균성 종의 큰 부분의 생리학적 연구를 구동하는 데 중요 할 것이다.
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Protocol
1. 하룻밤 미디어의 2.5 ml에서 세균 배양을 성장
백 희석 배양 1:100 ~ 250 ml의 신선한 미디어 및 0.7-0.8의 OD600으로 성장합니다. 물에 6 % 나트륨 도데실 황산염 (SDS)의 용액을 준비합니다.
주의: SDS 분말은 위험합니다 - SDS 분말을 흡입하지 마십시오. 코와 입에 마스크를 착용하십시오.
2. 1 일 - 세균 배양은 하루 와 하룻밤 동안 수행됩니다
- 희석 된 문화가 성장하는 동안, 1 L 비커에 뜨거운 접시에 끓는 물 목욕을 설정합니다. 물이 끓으면 6% SDS6 ml를 50ml 폴리프로필렌 튜브에 넣고, 각 튜브에 작은 교반 바를 추가하고, 튜브 뚜껑을 손가락에 고정하고, 튜브를 수조에 넣고, 뜨거운 접시에 500 rpm으로 저어줍니다.
- 실온에서 10분 동안 5,000g의 × 250ml 배양을 수확하고 3ml의 매체 또는 1x 인산완충식식염으로 펠릿을 재보습하십시오. 천천히 파이펫 셀 서스펜션은 6%의 끓는 SDS로 50ml 튜브로 천천히 피펫 을 사용하여 세포를 lyse(최종 농도 4% SDS)하고 튜브는 끓는 물 욕조에 침수되고 뚜껑을 손가락으로 닫습니다. 셀 서스펜션은 다시 중단되면 끓는 SDS로 신속하게 전달되어야 합니다. 이 세포 벽 구조의 잘못된 변경을 일으킬 수 있기 때문에 갑작스런 환경 변화를피해야한다.
- 끓는 수조를 덮고 세포가 3 시간 동안 끓여 서 수위를 주기적으로 확인하고 필요한 경우 수조를 다시 채울 수 있습니다. 3 시간 후, 핫 플레이트의 발열체를 끄고 500 rpm에서 밤새 저어계속합니다.
3. 2일차 - 효소 소화는 하루 동안 수행됩니다.
- SDS가 하룻밤 사이에 50ml 튜브에 침전된 경우 수조를 1-2시간 더 끓이십시오. 60 °C에 열 블록을 켭니다. 10mM Tris-HCl(pH 7.2) + 0.06% w/v NaCl에서 Pronase E의 1 mg/ml 스톡을 준비하고 최소 30분 동안 60°C에서 Pronase E를 활성화시합니다.
- 400,00 ×0 g의 초원심분리기를 사용하여 실온에서 20분 동안 샘플을 회전시켜 큰 PG 폴리머를 펠릿하고 다른 세포 성분으로부터 정화합니다. 주체를 조심스럽게 제거한 다음 각 펠릿을 실온 초순수물로 재보펜합니다. 참고: 재서스펜션 볼륨은 사용되는 초원심분리기 튜브의 부피에 따라 달라집니다. 튜브의 최대 부피를 초과하지 는 않지만 튜브를 절반 이상 채우는 부피를 사용합니다. 물이 재서스펜션 중에 거품을 형성하지 않을 때까지 원심분리/세척을 반복하여 SDS가 완전히 제거되었음을 나타냅니다(일반적으로 세 개의 세척). 이는 사쿠리가 함께 뭉쳐 있음을 나타내므로 백색 침전물 형태가 형성되면 펠릿 세척을 중단합니다. 덩어리는 치명적이지는 않지만 덩어리는 플라스틱과 유리 제품에 매우 강하게 결합하여 큰 시료 손실을 초래합니다. 이 경우, 응집된 사쿨리 샘플을 사용하여 프로토콜을 진행한다.
- 마지막 원심분리/세척 단계에서는 10mM Tris-HCl(pH 7.2) + 0.06% w/v NaCl의 900 μl에서 샘플을 재연하고 이전에 작은 바늘로 상판에 구멍을 뚫은 2ml 튜브로 옮긴다. 각 샘플에 1 mg/ml 활성 Pronase E(100 μg/ml 최종 농도)의 100 μl을 넣고 2시간 동안 60°C에서 배양합니다. 다른 열 블록을 100°C로 설정합니다.
- 각 샘플에 6% SDS의 200 μl을 추가하여 Pronase E 소화를 중지하고 30 분 동안 100 °C 열 블록에서 샘플을 끓입니다. 다른 열 블록을 37°C로 설정하고 50mM 인산염 버퍼(pH 4.9)에서 무라아마다아제(mutanolysin)의 1 mg/ml 스톡을 만듭니다.
- 3.2 단계에서와 마찬가지로, 400,00 ×0 g에서 설정된 초원심분리기를 사용하여 실온에서 20분 동안 시료를 회전시키고 SDS가 완전히 제거될 때까지 실온 초순수수로 세척합니다(일반적으로 3개의 세척). 재서스펜션 부피는 사용되는 초원심분리기 튜브의 부피에 따라 달라집니다. 튜브의 최대 부피를 초과하지 는 않지만 튜브를 절반 이상 채우는 부피를 사용합니다.
- 마지막 원심분리/세척 단계에서는 50mM 나트륨 인산염 버퍼(pH 4.9)의 200μl에서 시료를 재중단합니다. 이 부피는 시료에서 펩티도글리칸의 양에 따라 조절될 수 있으며 종 의존적일 수 있다. 관심있는 종에 대한 HPLC 분석의 이전에 발표 된 보고서가있는 경우,이 볼륨은 이러한 수량에 따라 추정 될 수있다 (HPLC PG 연구의 편집은 참조의 보충 정보에서 찾을 수 있습니다7). 다른 종의 경우, 타큘러스 준비는 이 단계까지 실행될 수 있고, PG가 용액에 남아 있을 수 있는 최소 볼륨을 결정하기 위해 샘플을 복제하기 위해 다양한 양의 재서스펜션 볼륨을 추가할 수 있습니다(추가 추정을 위한 토론 참조). 시료에 펩티도글리칸이 더 많이 함유되어 있는 경우, 리서스펜션 부피를 증가시키는 행위; 시료에 펩티도글리칸이 거의 없는 경우, 재서스펜션 부피를 최소 50μl로 줄입니다.
- 샘플을 1.5ml 튜브로 옮기고 무라아마다아제 1mg/ml를 추가하여 최종 농도를 40 μg/ml로 제공합니다. 37 °C에서 6-8 시간 또는 하룻밤을 배양하십시오.
4. 3 일 - UPLC 샘플 준비는 마지막 날에 수행됩니다.
- 열 블록을 100°C로 켭니다. 무라메다아제 소화를 막기 위해 SDS없이 샘플을 5 분 동안 끓입니다. 원심분리기 샘플은 실온에서 16,000 g에서 10분 동안 ×, 수퍼나티(muropeptides는 이제 용해성)에서 13mm x 100mm 유리 튜브로 이송합니다. 가능한 한 많은 상체를 복구하려고, 그것을 방해하지 않고 펠릿에 매우 가까이 점점.
- 100mM 붕산염 버퍼의 최종 농도를 위해 500m borate 버퍼(pH 9)를 샘플에 추가하여 pH를 조정한다. 붕산 완충제는 감소제 인 보하이드라이드 나트륨과 호환됩니다. 각 샘플을 줄이고 실온에서 적어도 30 분 동안 반응을 진행할 수 있도록 1-2 알갱이를 보로 하이드라이드 나트륨을 추가하십시오. 주의: 보하이드라이드 나트륨은 반응성이 매우 높고 취급하기에 위험합니다 - 피부와의 접촉을 피하고 (장갑을 착용)하고 눈과의 접촉을 피하십시오 (안전 안경 착용).
- pH 표시기 종이로 측정된 바와 같이 pH 6까지 20 μl 증분을 사용하여 pH 3-4(무로프타이드 등산지점은 ~3.5)로 샘플을 조정한 다음 2μl 증분을 사용합니다. 주의: 정형외과는 부식성이며 취급이 위험합니다 - 피부와의 접촉을 피하고 (장갑을 착용)하고 눈과의 접촉을 피하십시오 (안전 안경 착용). 시료는 정형 외과 산의 첨가에 대한 응답으로 거품이 있어야합니다; 샘플이 버블링을 중지하면 일반적으로 6의 pH에 도달했음을 나타냅니다. 시료에서 버블링이 발생하지 않으면, 이것은 추가된 borohydride 나트륨의 양이 너무 작다는 것을 나타낼 수 있습니다. 이 경우 pH 를 낮추는 것을 멈추고, 조심스럽게 1~2개의 알갱이를 추가하여 5-10분 동안 반응한 다음 pH 조정을 재개합니다.
- 0.22 μm 주사기 필터를 통해 샘플을 UPLC 바이알로 직접 필터링합니다. 침전소가 형성된 경우 튜브를 여러 번 가열하여 필터를 통과합니다. 샘플이 하루 내에 UPLC 기기에 주입되지 않으면 하룻밤 사이에 -20 °C에서 동결하십시오. 샘플은 -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다. 샘플을 여러 번 화염을 통과하여 해동 할 수 있습니다.
- C18 1.7 μm 반전 상 열과 202-208 nm를 모니터링하도록 설정된 흡광도 검출기가 장착된 UPLC 기기에 각 샘플의 10 μl을 주입합니다. 샘플은 순차적으로 주입되지만 자동 샘플러 기능을 통해 최대 96개의 샘플을 일괄 처리할 수 있습니다. 50mM 나트륨 인산염(pH 4.35) + 0.4% v/v 나트륨 아지드용매A용, 75mM 나트륨 인산염(pH 4.95) + 15% v/v 메탄올용 용매 B. 참고: 아지드 나트륨을 사용하여 205nm의 나단흡수를 방지한다. 흐름을 0.25 ml/min으로 설정하고 25분 이상 선형 그라데이션을 사용하여 100% 용매 B및 30분 이내에 무로프타이드의 순차적 용출을 달성합니다. 질량 분광법이 UPLC 후 무로프프티드를 특성화하는 데 사용되는 경우, 분수 수집기에 대한 관심피크의 일부를 수집하고 원심 증발기를 사용하여 분수를 건조시.
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Representative Results
도 1에설명된 절차를 사용하여 최종 샘플은 UPLC 바이알(Step 4.4)으로 직접 필터링된 명확한 용액의 최소 200μl로 구성되어야 합니다. 세균 샘플에서 다양한 무로프티드의 UPLC 분리는 액체 이동 상과 컬럼의 고정 단계 사이의 상대적 용해도에 의존한다. 반전 단계 C18 컬럼은 소수성 및 크기8에기초하여 무로프타이드 종을 분리하기 위해 강하게 소수성 매트릭스를 제공한다. 극성, 저분자-중량 단량체 는 먼저, 그리고 극성, 더 높은 분자량 올리고머 엘루트 후(그림 2). 일반적인 UPLC 결과는 도 2에나타내며, 특정 muropeptide의 보존 시간을 설정하는 시간의 함수로서 202-208 nm에서 UV 흡광도를 통해 검출된다. 이 대표적인 결과는 대부분의 무로프타이드 종과 스펙트럼 전반에 걸쳐 강력한 신호 강도 사이의 명확한 해상도를 보여 주며, 이는 분석과 평균 글리칸 가닥 길이를 가능하게 합니다.
도 1에 설명된 마지막 단계는 UPLC에 사용되는 튜브의 작은 치수를 막을 수 있는 pH를 조정하고 미세미립자를 필터링하는 것을 포함합니다. 시료가 200 μl 대신 3.5 단계에서 인산염 화충의 100 μl에서 재연하여 초농축되는 경우, 시료가 흐려져 임계 농도가 달성되고 점막이 침전되었음을 나타냅니다. 이러한 용해도 손실로 인해 4.4단계에서 사용되는 주사기 필터가 막히고, UPLC 유리병으로 무로프프티드의 증착및/또는 교체비용이 많이 드는 UPLC 기계 도관 및 기둥의 막히는 것을 방지할 수 있습니다. 이 비정상적인 샘플 처리를 반영하는 예제 크로마토그램은 도 3에도시된다. 피크가 출루되지 않아 PG 컴포지션에 대한 데이터가 없습니다. pH를 muropeptides의 동전점 보다 훨씬 낮은 것으로 조정하면(예를들어 2의 pH)도 점막의 침전을 초래할 수 있으므로 UPLC 분석에서 눈에 띄는 피크가 없을 수 있다.
그림 1. 사쿠리 준비의 회로도. 이 방법은 펠릿 사쿨리에서 SDS를 정화하기 위해 초원심 분리의 반복적 인 라운드에 의존한다.
그림 2. 대장균 MG1655 세포에서 소화된 사큐리로부터 PG의 예 UPLC 크로마토그램. 모든 점막의 유사한 해상도는 일반적인 HPLC 실행 시간의 10%에서 달성됩니다. 무로프타이드 라벨 - M = 단조량, D = 이머, T = 트리머; (2,3,4,5)는 아미노산 줄기 펩티드의 수를 나타낸다; 수정 - L-알라닌을 대체하는 G = 글리신, L = Pronase E 분열에서 두 개의 추가 아미노산, D = 3,3-다이미노 피멜산 (DAP)-DAP 크로스 브리지, N = 단하이드로 -muropeptide를 종결. 예를 들어, D33DL은 Pronase E 분열에서 추가 2개의 아미노산을 포함하는 DAP-DAP 크로스브리지를 통해 연결된 3-aa 줄기 펩티드를 가진 디머입니다.
그림 3. 대장균 MG1655 세포에서 소화된 사큐리의 UPLC 분석에 성공하지 못했다. 샘플에 무로프프티드가 없음을 나타내는 피크의 부재는 UPLC 바이알(Step 4.4)으로 추출하기 전에 액면에서 무로프프티드가 충돌하기 때문입니다. 이 강수량은 점막의 과농도 또는 pH가 너무 낮기 때문일 수 있습니다.
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Discussion
이 절차의 중요한 단계는 샘플 준비 둘째 날의 3.1 단계입니다. SDS가 하룻밤 사이에 침전되었거나 실온에서 몇 주 동안 4% SDS에 샘플을 저장한 경우 샘플을 SDS를 재해석하려면 최소 1시간 동안 다시 끓여야 합니다. SDS 강수량의 일반적인 원인은 칼륨 염을 가진 매체의 사용입니다, 그래서 칼륨은 가능하면 매체에서 피해야한다. 대표 결과 섹션에서 언급했듯이, 또한 pH를 점동점(~3.5)의 등전점 내에서 조정하는 것이 중요하지만 pH 3보다 너무 낮거나 물질이 침전될 수 있다. 마지막으로, 시료의 재현탁은 연구원에 의해 판단되어야 하는 인산나트륨 완충액(step 3.5)의 적당한 부피에서 이루어져야 한다. 인산나트륨 완충제의 회수부량을 선택할 때, 특정 세균 배양에서 얼마나 많은 무로프페드 물질이 생성될 가능성이 있는지 를 고려하는 것이 중요하다. 예를 들어, 최종 배양 부피가 250ml인 경우, 위에서 설명한 바와 같이, 시료는 인산염 나트륨 버퍼의 적어도 200μl에서 재주중단되어야 한다. 연구원이 50ml 배양 방식으로 방식을 수정하면, 시료는 인산염 화충의 100 μl 이하로 재장매될 수 있다. 종에서 펩티도글리칸의 예측된 양을 고려하는 것도 중요하다; 예를 들어, 대장균 구획은 실질적으로 펩티도글리칸(야생형 대장균 세포(10)의약 7%를 함유하고 있으므로 100 μl 이하의 인산염 완충제에서 재서스펜션이 적절하다. 특정 세균종또는 균주를 대량(250ml)으로 성장시키기 어려운 경우, 최종 배양부피를 감소시킬 수 있고/또는 야간 배양물의 희석을 줄일 수 있다. 마지막으로 HPLC 시스템에 주입하려면 최소 200 μl이 필요한 반면 10 μl은 UPLC 시스템에 충분합니다.
상이한 유기체 또는 상이한 응용 분야에서 PG 성분의 정제는 UPLC 계측기의 이동상, 기둥 및 그라데이션의 유형을 변화시킴으로써 조정할 수 있다. 아세토닐릴과 같은 용매 기반의 이동상은 질량 분광법 이전에 시료를 탈염하는 데 사용될 수 있다. 다른 열 화학은 또한 후속 분석을 위해 철저하게 염분 샘플을 제염하는 데 필요할 수 있습니다. 도 2는 그람 음성 막대 모양의 박테리아 대장균 MG1655에 대한 뮤로프티드의 일반적인 용출 프로파일을 나타낸다; 다른 형상을 가진 그람 양성 박테리아 및/또는 종으로부터 PG의 분석은 4.5 단계에 설명된 그라데이션의 미세 조정을 요구할 수 있다. 도 2에 도시된 것과 같은 UPLC 스펙트럼은 무로프티드 정체성, 교차 연결 비율 및 글리칸 가닥 길이와 같은 펩티도글리칸에 관한 많은 종류의 정보를 생성하지만, 이 방법은 sacculi를 통해 구조적 피처의 공간 분포를 매핑할 수 없음을 포함하여 몇 가지 한계를 가지고 있다. 예를 들어, 글리칸 사슬을 따라 교차브리딩의 위치나 결합된 지단백질의 위치는 HPLC 또는 UPLC를 통해 분별될 수 없습니다.
HPLC를 사용하여 PG의 화학 조성을 분석하는 이점은 아미노산 분석12-14 또는 종이 크로마토그래피(15, 16)와 같은 전통적인 기술과 비교하여 더 높은 해상도, 짧은 분석 시간 및 정확한수량(11)을포함한다. UPLC는 더 빠른 흐름과 따라서 짧은 실행 시간을 가능하게 하는 높은 압력으로 인해 HPLC보다 더 빠른 속도와 감도를 제공합니다. 2μm 입자 크기 컬럼, 고샘플링 속도 검출기 및 저용량 인젝터가 매우 높은 압력을 견딜 수 있으므로17,18의고속으로 정확하게 작동할 수 있기 때문에 UPLC로 분해가 희생되지 않습니다. 이로 인해 HPLC의 경우 200 μl 및 시간에 비해 수십 분 만에 1 μl의 순서로 샘플 볼륨을 분석할 수 있습니다.
UPLC에 보완되는 기술은 질량 분석법에 의한 무로프티드 질량 분석을 포함한다. UPLC는 파괴적인 기술이 아닙니다. 컬럼으로부터의 용루는 대부분의 실험실에서 일반적으로 이용 가능한 원심 증발기를 사용하여 UV 검출 후 수집및 건조될 수 있다. 샘플은 질량 분석법(단계 4.5) 에 대비하기 위해 염솔화할 수 있지만, 매트릭스 보조 레이저 탈광/이온화 - 비행 시간 질량 분석법은 염농도19에대한 민감도 없이 분석을 가능하게 하고, 점로프타이드를 확실하게 식별할 수 있는 질량 데이터를 산출한다. UPLC에 대한 하나의 세포벽 샘플을 준비하는 비용은 약 $6-7이며, 사용되는 효소, 화학 물질 및 공급 비용을 포함합니다. 저렴한 운영 비용, 접근성 및 세균 성 세포 벽연구를 위한 입증된 유틸리티를 감안할 때 UPLC는 세균 왕국 을 가로지르는 펩티도글리칸 조성물의 고해상도, 고처리량, 정확한 정량화를 위한 선택의 방법이 되어야 합니다.
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Disclosures
이 기사의 생산 비용은 워터스 코퍼레이션이 후원했습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 디렉터의 새로운 혁신상 DP2OD006466(K.C.H.)의 지원을 받았습니다. 저자는 방법의 실질적인 데모와 과학적 토론에 대한 러셀 몬즈 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler |
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A.
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
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- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A.
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