Summary
在体外测定法来测量病毒的复制已经由重组RNA病毒表达荧光素酶或能生物发光的其它酶的开发大大提高。这里我们详细介绍，结合麻疹和基孔肯雅病毒，从化学文库分离出广谱抗病毒药物，例如重组菌株的高通量筛选的管道。
Abstract
RNA病毒是负责重大人类疾病，如感冒，支气管炎，登革热，丙型肝炎或麻疹。他们还表示，因为增加了世界各地的交流与人群渗透越来越多的自然生态系统的一个新威胁。这样的情况出现的一个很好的例子是2005-2006年在印度洋基孔肯雅病毒的流行。在我们的细胞途径控制病毒复制的了解最新进展表明，靶向宿主细胞的功能的化合物，而不是病毒本身，能抑制RNA病毒的大面板。一些广谱抗病毒化合物被确定，与主机针对性的分析。然而，测量病毒复制的细胞培养物的抑制使用减少的细胞病变效应的读出还是代表一个最重要的筛选策略。这种功能的屏幕已经由重组病毒表达记者的发展有了很大的提高酶CA帕布尔生物发光如荧光素酶。在本报告中，我们详细介绍了高通量筛选的管道，它结合了重组麻疹和基孔肯雅病毒与细胞活力检测，以确定化合物具有广谱抗病毒配置文件。
Introduction
RNA病毒负责了大量的各种人类感染，并同时拥有在公共健康和经济成本方面对全世界的人口产生巨大的影响。有效的疫苗已经开发了针对几个人RNA病毒，并且被广泛地用作预防性治疗。然而，仍然有严重缺乏的治疗药物抗RNA病毒的感染。事实上，有效的疫苗不提供对主要的人类病原体，如登革热病毒，丙型肝炎病毒或人类呼吸道合胞病毒（hRSV的）。此外，RNA病毒是负责大部分新出现的疾病，它已经在频率，因为全球性的交流和对生态系统人为的影响，增加的。针对代表RNA病毒这一威胁，我们的治疗阿森纳是极其有限的，相对低效的1-3。目前的治疗方法基本上都是基于重组I型干扰素（IFN-α/β），以刺激先天性免疫，或利巴韦林的管理。虽然这核苷类似物的作用方式是有争议的，可能依赖于各种机制，细胞IMPDH（次黄嘌呤核苷酸脱氢酶），这耗尽细胞内GTP池的抑制作用，显然是必要的4。利巴韦林，与聚乙二醇化干扰素-α结合，是对丙型肝炎病毒的主要治疗手段。然而，IFN-α/β和利巴韦林治疗的疗效是比较差在体内对大多数RNA病毒的，因为它们通过毒力表达的有效钝的IFN-α/β信号因子5和经常逃避利巴韦林3。这增加了一个事实，即利巴韦林治疗是提高重要的毒性问题，尽管它最近被批准对严重hRSV的疾病，有争议的好处6。最近，一些病毒特异性治疗方法已被销售，特别是对流感病毒与发展Õf神经氨酸酶抑制剂3。但是，大的多样性和RNA病毒的出现永久排除了对他们在一个相对紧密的未来每一个具体的治疗方法的发展。总之，这强调需要有效的战略，以确定并开发强大的抗病毒分子在不久的将来。
这是微不足道的说，一个广谱抑制剂有效对抗RNA病毒大面板会解决这个问题。虽然这样的分子仍然是一个病毒学家的梦想，我们更好地了解细胞防御机制和先天免疫系统表明，一些可能性存在7,8。几个学术和工业实验室正在寻求刺激的细胞防御机制或代谢途径钝病毒复制的特定方面的分子。虽然这种化合物可能会显示出显著的副作用，对急性病毒感染的治疗会辖编为一相对短的时间，使得即使在长期的一些潜在毒性他们可以接受的。各种策略已经被开发，以识别这样的广谱抗病毒药分子。一些研究项目旨在寻找针对特定抗辩或代谢途径的分子。这包括，例如，病原体识别受体诱发的抗病毒基因的表达和9激活抗病毒因子如引入RNaseL 10，自噬机械，以促进病毒降解11，核苷合成途径12,13，或凋亡级联反应以沉淀病毒感染细胞的死亡14。其他小组已经开发出不是目标为基础13,15-17表型的屏幕。在这种情况下，抗病毒分子通过它们的能力简单地识别，以阻止病毒复制的一个给定的蜂窝式系统中。一般的假设是，抑制2-3无关RNA病毒的化合物，将有一个合适的模式为广大-SPectrum抗病毒分子。有这样的经验方法选择的命中化合物的作用方式只是在第二次确定的，最终，可能导致新的细胞目标的识别抗病毒药物。有趣的是，1999年和2008年间获得美国食品药品监督管理局新药的回顾性分析表明，在一般情况下，这种表型筛查往往表现比目标为基础的方法更好地发现先入类小分子药物18 。
在高通量的基于细胞的测定病毒的复制通常由病毒致细胞病变效应测定。细胞被感染并培养在96 - 或384 - 孔板中测试的化合物的存在。之后的几天，细胞层被固定和染色的染料如结晶紫。最后，吸光度用酶标仪和化合物抑制病毒复制是由它们的能力确定为往复保存细胞层确定米病毒诱导的细胞病变效应。另外，病毒介导的细胞病变效应正在使用标准的可行性分析，如MTS减少评估。此类测定法是高度易处理的和具有成本效益的，但三个主要的限制受到影响。首先，它们需要一个病毒-细胞组合，其中病毒的复制是细胞病变中只有几天，但情况并非总是可能的，从而要求替代方法19。其次，他们都缺乏定量的，因为它们是基于对病毒复制的间接测量。最后，有毒化合物可以评价为阳性命中，并且因此必须与一个计数器屏幕测定细胞活力来消除。要克服一些障碍，重组病毒或复制子已设计通过反向遗传学表达报告蛋白，如绿色荧光蛋白或荧光素酶，由一个附加的转录单位或以帧为与病毒蛋白的基因（几个例子是20-23）。当这些病毒的复制，记者公关oteins与病毒蛋白本身产生在一起。这提供了一个非常定量测定来测量病毒的复制和评估候选分子的抑制活性。这是用于重组病毒表达荧光素酶（或生物发光能力的其他酶），因为此报告系统显示出一个很宽的动态范围内具有高灵敏度，几乎没有背景，尤其如此。此外，不存在激发光源，从而防止干扰化合物的荧光24。
在这里，我们详细地高通量协议来筛选的RNA病毒的广谱抑制剂，化学文库。化合物在感染了重组麻疹病毒（MV）表达萤火虫荧光素酶25（rMV2/Luc， 如图1所示 ，主要画面）人体细胞先进行测试。 MV属于Mononegavirales秩序，往往被视为负链RNA病毒的原型成员ES。因此，MV的基因组作为模板，通过病毒聚合酶合成mRNA分子对病毒蛋白质进行编码。在重组MV株称为rMV2/Luc，萤光素酶表达是由P和M基因（ 图2A）之间插入一个附加的转录单位表达。平行地，化合物使用的是商业荧光素酶为基础的试剂，用于评估，由ATP定量测试它们的毒性对人体细胞，代谢活性细胞中培养的数量（ 图1，主屏幕）。整个化学文库可以很容易地筛选出与这两个试验，以便选择是没有毒性的，有效地阻止MV复制的化合物。然后，点击是重新测试剂量-反应抑制的MV复制，缺乏毒性以及其对损害基孔肯雅病毒（CHIKV）复制（ 图1，二次屏）的能力。 CHIKV是披膜病毒科家族的成员，其基因组是apositive单链RNA分子。因此，它是完全无关的麻疹和化合物抑制两个MV和CHIKV站在一个很好的机会，以抑制RNA病毒大面板。 CHIKV非结构蛋白是直接从病毒基因组的转化，而结构蛋白是由转录和一个亚基因组mRNA分子的翻译编码。对CHIKV我们的体外复制的测定是基于重组菌株称为CHIKV /韧，它通过NSP3和NSP4序列26（ 图2B）之间的报告基因的插入表达的Renilla荧光素酶作为非结构性多蛋白的裂解的部分。海肾荧光素酶活性的度量允许病毒复制的监视在CHIKV生命周期的早期阶段。
这种高通量的协议被用于快速识别化合物在10000 molec商业库一个合适的模式为广谱抗病毒药物ULES丰富的化学多样性。化合物基本上按照五个平斯基的规则，分子量范围从250至600道尔顿，和日志D值低于5。大多数这些分子分别在其他商业库无法使用新的化学实体。
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Protocol
96孔子板1。准备与化合物
- 将包含化合物的DMSO中的10mM储备溶液在-20℃至室温的96孔母板上。稀释5倍的化合物在DMSO在2毫米，以获得中间96孔稀释板。稀释吹打5微升到20微升的DMSO和混合来实现。
- 吸取1微升的稀释板成白色，条形码组织培养96孔板干井。这第一组子板（D1）将被用来评估化合物以20μM的终浓度的毒性。店子板在-20℃备用。
- 吹打从稀释板4微升到36微升的DMSO和混合再稀释化合物1:10。吸取1μL成白色，平底，条形码组织培养的96孔板干井。这第二组子板（D2）将被用来评估MV replicatio的抑制n可在化合物的2μM的最终浓度。店子板在-20℃备用。
2，细胞培养制备确定化合物的毒性
- 生长的HEK-293T细胞，在37℃和5％CO 2中的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）与稳定化的L-谷氨酰胺并补充有10％胎牛血清（FCS），链霉素（100微克/毫升）和青霉素（100国际单位/毫升）。细胞被胰蛋白酶消化传代，每4-5天，和1:10稀释到一个新的烧瓶中。细胞应在对数期为实验。
- 在实验的当天，通过胰蛋白酶处理回收细胞，并进行细胞计数。离心沉淀细胞，并重新悬浮于其中3×10 5个细胞/培养基毫升。认为12.5毫升细胞悬液要求每个屏蔽板。
- 细胞转移到低谷，并免除100微升细胞悬液中含有尖刺化学康波D1板unds。料槽内的细胞悬液定期搅动以避免沉淀。
- 秒杀对照孔A1，C1，E1，G1，A12，C12，E12和G12采用1微升的DMSO。相应孔将被用作用于活细胞的参考（无毒性）。穗对照孔B1，D1，F1，H1，B12，D12，F12和H12与1微升的DMSO和2.5微升的0.5％IGEPAL溶液杀死细胞。相应井将被用作死细胞的参考（毒性高）。
- 孵育细胞24小时，在37℃和5％CO 2。
3，制备rMV2/Luc感染的细胞培养的
- 成长，在2.1和2.2中所述恢复细胞。再次，重悬的细胞以3×10 5个细胞/培养基毫升。认为12.5毫升细胞悬液要求每个屏蔽板。
- 可选：与尿苷在20微克/毫升补充培养基。
注意：当筛查病毒replicatio化学库Ñ 抑制剂，似乎靶向早期步骤的嘧啶生物合成途径中的化合物经常被分离13,16,27,28。加尿苷的培养基中，用于过滤掉这样的抗病毒分子。事实上，这有效地恢复时嘧啶生物合成途径上游的酶被阻断病毒的复制。 - 保存细胞悬液1:10对照孔与非感染的细胞，然后继续感染剩余量。
- 解冻rMV2/Luc原液合适的音量。 MV股票的解决方案通常是在每毫升10 6 -10 8传染性颗粒。培养必须感染rMV2/Luc每个靶细胞0.1感染性颗粒，其对应于0.1感染复数（MOI）的。注：rMV2/Luc从MV疫苗（Schwarz株）得出，并操纵在BSL2环境。
- 病毒加入细胞悬液，轻轻混匀。转让感染细胞的低谷，并免除100微升的感染的细胞悬浮液中含有的列尖刺化学化合物D2板的2〜11。料槽内的细胞悬液定期轻轻混合。
- 在列1和12，取100μl的非感染细胞的阱上2。感染的细胞中被分配在其他井。
- 孵育细胞24小时，在37℃和5％CO 2。
4，荧光素酶活性措施和数据分析
- 从培养箱中取出D1板，并确定细胞活力通过加入50μl荧光素酶为基础的生存能力试剂直接向培养孔。混合后，于室温下10分钟。读板用发光。积分时间设定为每孔100毫秒。
- 从培养箱中取出D2板，并确定荧光素酶活性通过加入50μl萤光素酶底物的直接向培养孔。孵育6分钟，在室温下，读板用的光度计如所记述上面的床。
- 计算Z'-因子的毒性测定的各板D1，以保证屏幕29的质量。 Z'= 1-3 *（σ+σ-）/（μ+ - μ-），其中μ+和σ+对应的发光和标准偏差的HEK-293T细胞单独用DMSO（无毒性）的手段，和μ和σ-的发光和标准差与IGEPAL处理，以杀死细胞培养孔中的手段。 Z'预期为0.5以上，或相应的板将被丢弃。
- 在μ+ / 2设定毒性阈值。丢弃化合物与下面这个截（ 图3A）的发光值。
- 计算Z'因子，抗病毒试验的每个D2板。这里，μ+和σ+对应的发光和标准偏差被感染的细胞与单独的DMSO培养的手段，和μ-和σ-是发光和标准偏差为未感染的细胞的手段。再次，板与Z＆＃39;低于0.5的值被丢弃。
- 计算病毒复制的抑制作用如下：抑制=（μ+ - 对化合物X荧光素酶活性）的百分比/（μ+ - μ-）* 100。设置门槛的抑制在75％，并选择化合物既减少发光值低于这个截止（ 图3B），且没有毒性，按照4.4描述的标准。
5，辅助屏幕的毒性和广谱抗病毒活性
- 使1点02连续稀释为每个在DMSO击中化合物，从500微米至4微米（8稀释）开始。填充白色，条形码的组织培养板用50微升培养基。加入1μl每种化合物稀释液中培养孔中。重复两次，有3个培养板具有重复连续稀释每一击化合物。
- 准备37.5毫升一个HEK-293T细胞悬浮液在6×10 5个细胞/培养基如上所述毫升（以2.1和2.2）。免除2个12.5毫升在猎鹰管和感染细胞与任何rMV2/Luc以MOI = 0.1或重组CHIKV在MOI表达海肾萤光素酶（CHIKV /仁）= 0.2。颠倒混匀。
注意：CHIKV /仁从CHIKV的野生型菌株产生的，因此应该在一个BSL3环境进行操作。板可以从BSL3被移动到BSL1一次Renilla荧光底物已被添加到培养孔（见下文）。 - 免除50微升未受感染，rMV2/Luc-infected，或CHIKV /仁感染的细胞中含有的命中化合物的连续稀释培养板中。培养24小时，在37°C
- 加入50微升萤火虫荧光素酶底物，以确定rMV2/Luc-infected井萤火虫荧光素酶的活性。加入50微升海肾萤光素酶底物来确定CHIKV /仁感染井海肾萤光素酶的活性。最后，加入50微升荧光素酶为基础的可行性分析试剂，以未感染的细胞，以确定细胞活力。
- 情节数据（ 网络连接GURE 4），并确定抑制MV和CHIKV复制了50％的命中化合物浓度。忽略表示在该试验中某些毒性化合物。
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Representative Results
这种筛选流水线首先依赖于抑制MV复制化合物的选择和不显示任何显著的细胞毒性（ 图1，主屏幕）。它利用荧光素酶为基础的检测，以确定细胞毒性和病毒复制的抑制。所有吸移步骤和数据采集可以在高通量环境来执行与机器人平台。
化合物的细胞毒性是使用计算结果的基础上，ATP的存在，它对应于代谢活性细胞的定量在培养的活细胞的数目的荧光素酶为基础的生存试验评估。因为萤光素氧化萤光素酶是ATP依赖性的，发光信号是直接正比于由活细胞。 图3A是示出用于1代表筛板结果提供细胞ATP。正如预期的那样，很明显的荧光素酶活性值分别为测量电编在对照孔中含有与IGEPAL杀死或活细胞或死细胞。阈值是根据经验设定在μ+ / 2过滤出的化合物显示出一些细胞毒性和在当前情况下，从该板21的化合物被丢弃。并联，抗病毒活性使用rMV2/Luc，MV表达荧光素酶的重组菌株（ 图2）进行测定。人类的HEK-293T细胞中的使用，因为它们对MV感染高度敏感。其结果是，在受感染的培养孔中的荧光素酶的活性是非常高的（在对照孔200〜300×10 3荧光素酶活性单位）。这提供了方便的MV复制抑制剂的选择。 图3B是示出用于1筛板获得代表性结果大的动态范围。四种化合物在这个例子中抑制病毒复制，由75％以上和被选定。
最后，没有毒性和化合物打进在病毒复制测定阳性选择（ 图3A和3B）。其半数最大抑制浓度（IC50）在两个MV和CHIKV，这是两个不相关的RNA病毒（ 图1，次级画面）被确定。命中化合物的抗病毒活性是用重组病毒株表达或萤火虫（rMV2/Luc）或海肾（CHIKV /仁）荧光素酶测定。 图4A和4B示出代表性的抑制曲线MV和CHIKV复制，分别。这些曲线被用来确定命中化合物的IC50。并联，缺乏选择的化合物的细胞毒性使用上述的荧光素酶为基础的生存试验（ 图4C）被证实在剂量反应实验。 表1中示出的一组13个非对MV和CHIKV复制的IC 50值毒性从10000分子的化学文库中鉴定的化合物。这些康波unds是新颖的两个在化学结构和生物活性方面。一些这些分子的共同的结构相似性，并且可以被聚集成三个不同的化学家族。作为参考，用布喹那获得IC 50值也示于表1中 。布喹那是二氢乳清脱氢酶的抑制剂，嘧啶生物合成途径中的第四酶， 在体外 30,31一种强效的抗病毒活性。看时的IC 50值，幅度小于一个数量级从确定了筛选最活跃的命中分离此参照分子。这个既定选择的化合物的强抗病毒活性。
图1总结了筛查管道。左侧面板中显示的Primary屏幕，在这里被选定为无毒性和能力来阻止MV复制的化合物。右面板被示出，其中选定的化合物的抗病毒活性被确认次级屏幕，并且其阻断CHIKV复制能力是确定的。化合物，有效地阻止MV和CHIKV没有任何显著毒性被认为是RNA病毒潜在的广谱抑制剂。 点击这里查看大图 。
图2：携带荧光素酶基因的重组RNA病毒的基因组组织。 （A）rMV2/Luc：MV的负链RNA基因组被显示在左侧而其3'端，用6个基因用大写字母表示，并描绘成白色矩形。为报告基因的额外转录单元编码插入P和M基因之间以及描绘为黄色矩形（B）CHIKV /仁：在CHIKV正链RNA基因组被显示，其5'-端封端在左边，与编码四个非结构蛋白的开放阅读框（NSP1-4）。 点击这里查看大图 。
图3为1的96孔筛选板的代表性结果。 （A）与荧光素酶为基础的生存力测定法中获得萤光素酶值。列1和12对应于备用控制用DMSO单独（“+”，没有毒性）或IGEPAL（“ - ”;高TOXI市）。蓝颜色高亮显示将根据在培养孔中检测到的ATP浓度被认为没有毒性的化合物，而白井对应于有毒化合物（荧光素酶值<12203×10 3）（B）与rMV2/Luc-infected细胞中获得萤光素酶值。列1和12对应于备用控制， 即非感染HEK-293T细胞（“ - ”），或者单独用DMSO处理rMV2/Luc-infected细胞（“+”）。对于每个被测试化合物，图中示出两种荧光素酶的发光信号和抑制相对于对照孔的百分比。化合物超过75％抑制发光信号为黄色或绿色的依靠，如果他们被认为是有毒的或不作为（A）确定被高亮显示。 因此，绿色是显示命中的化合物抑制MV复制，不影响细胞活力。T =“_blank”>点击这里查看大图。
图4。剂量-反应的抗病毒活性的化合物，C864，C648和C062和毒性。 （A）的 HEK-293T细胞感染MV的rMV2/Luc菌株表达荧光素酶（MOI = 0.1），并温育用递增剂量的C864，C648，C062或DMSO单独的。 24小时后，荧光素酶表达决心。 *表示观察到的萤光素酶的抑制是与所有三种化合物（p-值<0.05）统计学显著（B）的HEK-293T细胞感染CHIKV的CHIKV /仁菌株表达的Renilla荧光素酶（MOI = 0.2），并孵育随剂量C864，C648，C062或DMSO单独的。 24小时后，海肾萤光素酶的表达来确定。 *表示统计学与所有三种化合物（p-值<0.05）和Cally显著禁忌（C）的HEK-293T细胞用递增剂量的C864，C648，C062或DMSO单独的。至于毒性对照，细胞培养物补充2.5微升0.5％IGEPAL溶液。 24小时后，用荧光素酶为基础的可行性分析测定活细胞的数量。 点击这里查看大图 。
| 化工系列 | 复合 | MV（IC 50微米） | CHIKV（IC 50微米） | CC50（μM） |
| 1 | C864 | 0.6 | 0.6 | > 5 |
| 1 | C877 | 0.2 | 0.2 | > 5 |
| 1 | C957 | 1.2 | 1.2 | > 5 |
| 1 | C963 | 1.2 | 0.9 | > 5 |
| 1 | C967 | 1.7 | 1.6 | > 5 |
| 1 | C348 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C265 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C270 | 0.5 | 0.5 > 5 | |
| 1 | C350 | 0.4 | 0.5 | > 5 |
| 2 | C646 | 0.16 | 0.15 | > 5 |
| 2 | C814 | 1.9 | 1.1 | > 5 |
| 2 | C648 | 0.7 | 0.4 | > 5 |
| 3 | C062 | 1 | 1.2 | > 5 |
| 布喹那 | 0.04 | 0.04 | > 5 |
在13的表1中。抗病毒活性和细胞毒性从原来的化学库中选择的化合物。结果表示为IC 50值的MV的抑制或CHIKV复制。 CC50值均> 5微米的所有化合物从二级屏剂量反应实验。但对于从主屏幕细胞毒性得分滤波阈值表明CC50值甚至> 20微米。
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Discussion
这里描述的筛选管线的目的是选择的化合物与合适的配置文件作为RNA病毒的广谱抑制剂。当10000的化合物库中筛选与此 协议，上述过滤条件被应用， 即抑制MV复制优于75％，40个化合物（0.4％）的得分阳性。此外，约一半的人表现出一定的毒性在荧光素酶为基础的可行性分析，并无视这个原因。最后，一应俱全的命中打在用量较大再次接受测试。这个小套很容易被重新测试两个细胞毒性和病毒复制的抑制对MV和CHIKV在剂量反应实验（ 图4）为。所有选择的化合物的抗病毒活性被证实，并且整体鉴定的命中率对本筛选管道为1.3‰。这个得分是非常类似于由其他基团具有不同的高通量所获得的结果基于复制的筛选试验，为抗病毒药物27,32，和落在预期范围在一般基于细胞的表型分析（1-5‰33）。然而，命中率是高度依赖都被筛选化合物库和得分的阈值过滤器上，它可以根据采集的数据的更新进行调整。这里，所选择的阈值的MV复制和细胞毒性的抑制作用进行了实验来确定，并权衡设定为取得，可以很容易地重新测试中对CHIKV二次筛选命中的一个易处理的数量。
在主屏幕中，化合物进行到块的MV复制和缺乏细胞毒性的两个的能力。抗病毒活性在2μM上rMV2/Luc-infected细胞的浓度而确定的细胞毒性在20μM的确定。这些实验的设置中发现有价值的直接选择具有高抗化合物活动相对细胞毒性病毒。另外，在尿苷的存在下，进行主画面。事实上，最近的出版物表明，针对早期步骤嘧啶生物合成途径的化合物正在寻找RNA病毒13,16,27,28抑制剂时常见的孤立。特别是，研究小组在寻找抗病毒分子发现二氢乳清酸脱氢酶抑制剂，这种代谢途径31第四酶。尿苷的培养基中有效地反式互补对这种酶的抑制，从而还原病毒复制。以这种方式，防止复制的MV通过抑制嘧啶生物合成途径的化合物被直接排除在抗病毒命中。最后，Z'因子被发现是系统地在0.5以上，从而表现出高的耐用性的测定和质量。
同时，细胞毒性，使用高总吞吐量来确定吨荧光素酶为基础的检测，其基于ATP的定量在培养代谢活性细胞的数量。在每个屏蔽板，IGEPAL加入对照孔的毒性。此非变性，非离子型去污剂具有杀灭效率所有细胞类型的非特异性而不影响萤光素酶活性的优点。 Z'的因素是系统在0.5以上超过125板，从而表现出了高鲁棒性的测定和质量。这种细胞毒性试验的一个限制是它的成本相对较高。作为一种替代方法检测，以确定细胞活力，一些团体已经使用的细胞系组成的一个稳定的转基因34表达荧光素酶。在这样的分析中，有毒的化合物预计影响细胞活力时，减少甚至抑制荧光素酶的表达。最近，我们开发了在IFN-β刺激35表达荧光素酶的稳定细胞系，并且该细胞系被用来测试一个TR癌宁组80化合物的细胞毒性。令人惊讶的是，该测定和上述荧光素酶为基础的存活测定之间的相关系数（CC）是相对低的（CC = 0.67）。事实上，几种化合物受损的转基因荧光素酶的表达，而ATP的代谢并没有受到影响。一些广谱抗病毒化合物有可能影响细胞功能，如细胞信号转导，基因转录或翻译的蛋白质，这也将影响细胞基因表达的影响。虽然对细胞活力没有完美的筛选系统，它是在风险筛选基于细胞基因表达的有毒化合物将可能导致排除真正的抗病毒分子。
辅助屏幕旨在建立针对两个完全不相关的RNA病毒所选化合物的抗病毒活性，同时确定其精确的IC50。有趣的是，应当注意到，荧光素酶抑制剂可能被误记为阳性的rMV2/Luc检测，但是当对CHIKV /仁的抑制试验这种误报会被过滤出的二次筛选。事实上，rMV2/Luc和CHIKV /仁表达萤火虫和海肾萤光素酶，分别与这两种酶都没有关系，催化不同的化学反应。抑制从rMV2/Luc萤火虫荧光素酶报告中的主要化合物，屏幕将不显示对CHIKV /任任何活动，都将被丢弃，从而防止其错误选择的抗病毒药物。没想到，所有的小学13命中阻止复制的MV也是在这个中学的屏幕抑制CHIKV。这并不总是尽可能少的MV-特异性抑制剂的筛选其他的库（数据未显示）时分离的情况。此外，选择的化合物共享的结构相似性，并且可以被分成只有三个化学家族（ 表1）。内的化学化合物家族可能有激活的模式相同上，并且因此可以被认为是相同的化学实体的类似物。这使得进入的角度来看一个事实，即所有13个选定的化合物既抑制MV和CHIKV复制。然而，这些结果也可能表明，广谱抗病毒药物都更频繁地比确定病毒特异性抑制剂。理性这个假设后面是，尽管明显的特异性，所有RNA病毒依赖于相同的基本的细胞功能来复制，如核糖体机械，细胞骨架或线粒体作为能量的来源。这些功能模块是复杂的分子体系，其提供的广谱抗病毒药物的潜在目标相对大的面板。与此相反，只存在一个组表示适当的目标，以提高病毒特异性抑制剂病毒或细胞因子的限制。在未来，确定表型筛选抗病毒药物的新面板应提供必要的数据，以确认或废止这一假说。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我们感谢伊夫·亚宁博士的卓有成效的意见和建议。我们要感谢HH迦得对植/仁和C Combredet她的技术支持。巴斯德弊端Infectieuses（计划福星到POV和HM- - 这项工作是由巴斯德研究所，中心法国国家科学研究（CNRS），研究所国家德拉桑特逸德拉RECHERCHEMédicale（INSERM），研究所卡诺支持L）时，国民新电倒拉RECHERCHE（ANR-RPIB，计划STING 2.0至POV），和“行政法院区域D'法兰西岛大区法国”（化学库项目，赠款N°我06-222 / R和I 09-1739 / R以HM-L）。对CHIKV /任这项工作是由项目ArbOAS支持（ANR授予2010-INTB-1601-02）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-well polystyrene cell culture microplates, white | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity. |
References
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