Summary
Virüs çoğaltma ölçmek için in vitro deneylerinde önemli ölçüde lusiferaz veya biyolüminesans edebilen diğer enzimleri ifade eden rekombinant RNA virüslerinin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir. Burada ayrıntılı kızamık ve kimyasal kütüphanelerden geniş spektrumlu antiviral izole etmek Chikungunya virüsler, rekombinant suşlar birleştiren bir yüksek verimli tarama hattını.
Abstract
RNA virüsleri gibi grip, bronşit, dang, Hepatit C ya da kızamık gibi önemli insan hastalıkları sorumludur. Ayrıca, çünkü daha doğal ekosistemlerin nüfuz artan dünya çapında değişim ve insan nüfusu yükselen bir tehdit oluşturuyor. Böyle yükselen bir duruma iyi bir örnek Hint Okyanusu'nda 2005-2006 arasında chikungunya virüsü salgın olduğunu. Viral replikasyonu kontrol hücresel yolların anlayışımızda son gelişmeler konakçı hücre fonksiyonlarını hedefleme bileşikleri, daha doğrusu virüsün kendisinden daha, RNA virüsleri büyük bir panel inhibe olabileceğini düşündürmektedir. Bazı geniş spektrumlu antiviral bileşikler, ana hedef odaklı deneyleri ile tespit edilmiştir. Ancak, hücre kültürlerinde viral replikasyonun inhibisyonunu ölçen bir gösterge olarak sitopatik etkileri azaltma kullanarak yine çok önemli bir tarama stratejisi temsil eder. Bu gibi fonksiyonel ekranlar çok raportör ifade eden rekombinant virüslerin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir ca enzimlerilüsiferaz gibi bio-ışıldamanın palpe edilebilir. Bu raporda, ayrıntılı bir geniş spektrumlu anti-viral profili olan bileşikleri tespit etmek, yeniden birleştirici kızamık ve hücre canlılığı deneyleri ile Chikungunya virüs birleştiren bir yüksek verimli tarama boru hattı.
Introduction
RNA virüsleri, insan enfeksiyonlarına çok çeşitli sorumludur, hem halk sağlığı ve ekonomik maliyet açısından dünya nüfusu üzerinde büyük bir etkisi var. Etkin aşıların pek çok insan RNA virüslerine karşı geliştirilmiş ve yaygın olarak profilaktik tedavi olarak kullanılır. Ancak, RNA virüs enfeksiyonlarına karşı tedavi edici ilaçların önemli bir eksikliği var. Gerçekten de, verimli bir aşı, dang virüsü, Hepatit C virüsü ya da insan solunum sinsisyal virüsü (hRSV) gibi büyük, insan patojenlerine karşı mevcut değildir. Ayrıca, RNA virüsleri, çünkü küresel değişim ve ekolojik sistemler üzerindeki insan etkisi sıklığı arttı ortaya çıkan hastalıkların bir çoğunluğu sorumludur. RNA virüsleri temsil Bu tehdide karşı, bizim terapötik arsenal son derece sınırlı ve 1-3 nispeten verimsizdir. Mevcut tedaviler esas itibariyle, doğuştan bağışıklığı uyarmak için rekombinant tip I interferonlar (IFN-α / β) dayanmaktadırya da ribavirin yönetimi. Bu ribonükleosit analog etkime şekli tartışmalıdır ve muhtemelen çeşitli mekanizmalar kullanır, ancak, hücre içi GTP havuzları tüketen hücresel İMPDH (inosin monofosfat dehidrogenaz) inhibisyonu, 4 açıkça gereklidir. Ribavirin, pegile edilmiş IFN-α ile birlikte, Hepatit C virüsüne karşı ana tedavidir. De etkin bir şekilde küt IFN-α / β 5 hastalık oluşturma faktörleri sentezlenmesi yoluyla sinyal ve genellikle ribavirin 3 kaçış Ancak, IFN-α / β ve ribavirin tedavileri en RNA virüslerine karşı in vivo koşullarında nispeten zayıf bir etkiye sahiptir. Son zamanlarda tartışmalı yararları 6, ağır hRSV hastalığa karşı kabul edildi, ancak bu, önemli bir tedavi ribavirin toksisite sorunlar yaratmaktadır gerçeğine ilave edildi. Daha yakın zamanda, bir virüs özel tedaviler geliştirme o ile influenza virüsüne karşı, özellikle de pazarlanmıştırf nöraminidaz inhibitörleri 3. Ancak, büyük çeşitlilik ve RNA virüslerinin sürekli ortaya çıkması nispeten yakın bir gelecekte bunların her birine karşı özel tedavilerin gelişimini engellemektedir. Toplamda, bu yakın gelecekte güçlü antiviral molekülleri tanımlamak ve geliştirmek için etkili stratejiler için gereğini vurguluyor.
Bu RNA virüslerinin büyük bir paneline karşı aktif, geniş spektrumlu inhibitörü, bu sorunu çözmek olacağını söylemek saçmadır. Böyle bir molekül hala Virolog rüyası olmasına rağmen, hücresel savunma mekanizmaları ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi bizim daha iyi anlaşılması bazı olasılıklar 7,8 var olduğunu göstermektedir. Çeşitli akademik ve endüstriyel laboratuarlar şimdi hücresel savunma mekanizmaları veya viral replikasyon künt metabolik yolların belirli yönlerini uyaran moleküller arıyorlar. Bu tür bileşikler, muhtemelen önemli yan etkiler gösterir, ancak akut viral enfeksiyonlara karşı işlemleri yapmak olacakuzun vadede bazı potansiyel toksisitesi rağmen onları kabul edilebilir hale, nispeten kısa bir süre için ed. Çeşitli stratejiler gibi geniş spektrumlu bir anti-viral molekülleri tanımlamak için geliştirilmiştir. Bazı araştırma programları belirli savunma veya metabolik yolları hedef molekülleri bulmayı hedefliyoruz. Bunlar arasında, örneğin, anti-viral gen ekspresyonu 9 ortaya çıkarmak ve bu RNaseL 10, virüs bozulma 11 desteklemek için autophagy makineleri gibi antiviral faktörleri aktif hale getirmek için bir patojen tanıma reseptörleri, nükleosid sentezi, virüs ile enfekte olmuş hücrelerin ölümünü çökeltmek için 12,13 veya apoptotik kaskadlar yolaklar 14. Diğer gruplar 13,15-17 hedef bazlı olmayan fenotipik ekranlar geliştirdik. Bu durumda, anti-viral moleküller sadece belirli bir hücresel sistemde viral replikasyonu bloke etme kapasitesi ile tanımlanır. Genel varsayım 2-3 olmayan RNA virüslerini inhibe eden bir bileşiği, bir geniş-sp için uygun bir profile sahip olduğunu ifade ettiantiviral molekülü ectrum. Bu tür bir yaklaşım ile seçilen ampirik hit bileşiklerin etki modu yalnızca ikinci kez tespit edilir ve sonunda, antiviraller için yeni hücre hedeflerin tanımlanmasına yol açabilir. İlginçtir, 1999 ve 2008 yılları arasında ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanan yeni ilaçların bir retrospektif analizi genel olarak, bu tür fenotipik gösterimleri birinci sınıfında küçük moleküllü ilaçlar 18 keşfetmek için hedef odaklı yaklaşımlar daha iyi performans eğiliminde olduğunu göstermiştir .
, Yüksek yayılmalı hücre bazlı deneylerde Viral replikasyonu çoğunlukla virüs sitopatik etkiler belirlenir. Hücreler, enfekte edilmiş ve 96 içinde kültürlenir - ya da test edilen bileşiklerin mevcudiyetinde 384 oyuklu plakalar. Birkaç gün sonra, hücre katmanları sabittir ve bu kristal mor gibi boyalarla boyanmıştır. Son olarak, absorbans, bir plaka okuyucu ve viral replikasyonu inhibe edici bileşikleri, ileri hücre katmanları korumak için kapasiteleri ile tanımlanır belirlenirm virüs kaynaklı sitopatik etkiler. Seçenek olarak ise, viral kaynaklı sitopatik etkileri, MTS azaltılması gibi standart canlılığı tahliller kullanılarak değerlendirilir. Bu tür deneyler son derece uysal ve maliyet-etkili, ancak üç büyük sınırlamalar muzdarip. İlk olarak, böylece 19, alternatif yaklaşımlar çağrısında, viral replikasyonu sadece birkaç gün sitopatik, ancak bu her zaman mümkün değildir, bir virüs-hücre kombinasyonunu gerektirir. İkincisi, onlar viral replikasyon dolaylı ölçümüne dayalı olduğundan kötü nicel vardır. Son olarak, toksik bileşikler, pozitif sonuç olarak atılır ve bu nedenle hücre canlılığını ölçen bir sayaç ekranı olan giderilmelidir. Bu engel bazılarının üstesinden gelmek için, yeniden birleştirici virüs veya replikonlar ek transkripsiyon biriminden ya da viral protein gen (birkaç örnek 20-23 olan) ile aynı çerçevede, bu tür EGFP veya lusiferaz gibi haberci proteinleri ifade etmek için ters genetik mühendislik edilmiştir. Bu virüsleri çoğalmak, muhabir proteins viral proteinler kendileri ile birlikte üretilmektedir. Bu viral replikasyonu ölçmek ve Aday moleküllerin inhibitör aktivitesini değerlendirmek için, çok nicel analizi sağlar. Bu, raportör sistem, yüksek hassasiyet ve hemen hemen hiç arka plan ile bir geniş dinamik aralık sergiler Başlangıcı lusiferaz (ya da bio-ışıldamanın sahip başka enzimler) ifade eden rekombinant virüs için geçerlidir. Bundan başka, herhangi bir uyarı ışığı kaynağı, bileşik floresan 24 ile girişimi önleyen vardır.
Burada ayrıntılı bir yüksek verimli bir protokol RNA virüslerinin geniş spektrumlu inhibitörleri için kimyasal kütüphanelerinin taranması için. Bileşikler, ateş böceği luciferase 25 (rMV2/Luc, Şekil 1, bir primer eleme) eksprese eden bir rekombinant kızamık virüsü (MV) ile enfekte edilmiş insan hücreleri üzerindeki ilk test edilmiştir. PD Mononegaviraller sınıfı, ve genellikle, negatif dallı RNA virüsü bir prototip üyesi olarak kabul edilires. Bu nedenle, MV genom viral proteinler için kodlayan mRNA moleküllerinin sentezlenmesi için viral polimeraz ile bir şablon olarak kullanılır. RMV2/Luc olarak adlandırılan, rekombinant MV suşu olarak, lüsiferaz ifadesi P ve M gen (Şekil 2A) arasında herhangi bir ek transkripsiyon biriminden ifade edilir. Buna paralel olarak, bileşikler, ATP miktarının ölçülmesi ile, değerlendiren bir ticari lusiferaz bazlı bir reaktif kullanılarak, insan hücreleri üzerindeki toksisite için test edilir, kültür içinde metabolik olarak aktif hücrelerin sayısı (Şekil 1, birinci ekranı). Bütün kimyasal kütüphaneler kolayca toksik olmayan ve etkili bir şekilde bloke eden bileşikler PD çoğaltma seçmek için bu iki deneyleri ile taranabilir. Daha sonra, bulgular, Chikungunya virüsü (CHIKV) çoğaltma (Şekil 1, ikinci ekranı) bozduğu kapasiteleri için doz-yanıt PD replikasyonun inhibisyonu, toksisite eksikliği yanı sıra için yeniden test edilir. CHIKV Togaviridae ailesinin bir üyesidir ve genom apOsitive tek iplikli RNA molekülü. Bu nedenle, kızamık ve OG ve CHIKV hem RNA virüslerinin büyük bir paneli engellemek için büyük bir şansı önleyici bileşiklerin tamamen ilgisiz olduğunu. Yapısal proteinler, transkripsiyon ve bir alt genomik mRNA molekülü tarafından kodlanan çeviri oysa CHIKV yapısal olmayan proteinleri, doğrudan viral genomundan çevrilir. CHIKV yönelik in vitro deney çoğaltma NSP3 ve NSP4 dizileri 26 (Şekil 2B) arasındaki raportör geninin bir sokma yoluyla yapısal olmayan poliproteinin bir parçası olarak yarılmış Renilla lusiferaz enzimi ifade CHIKV / Ren adı verilen bir rekombinant soyu dayanmaktadır. Renilla lusiferaz etkinliğinin ölçüsü CHIKV yaşam döngüsünün erken aşamasında viral replikasyonun izlenmesine olanak sağlar.
Bu yüksek hızlı verimlilik protokol 10000 Molec ticari bir kütüphanede geniş spektrumlu antiviraller için uygun bir profili olan bileşiklerin belirlenmesi için kullanılmıştırModüller kimyasal çeşitliliği için zenginleştirilmiş. Bileşikler, esas olarak 250 ila 600 daltona kadar değişen molekül ağırlıkları olan, beş Lipinski kuralı ardından, 5 'in altında ve D değerleri log edilmiştir., Bu moleküllerin pek çoğu, diğer ticari kütüphanelerde mevcut olmayan yeni bir kimyasal maddeler edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bileşikler ile 96 oyuklu kızı Plakaların 1. Hazırlanması
- Oda sıcaklığına kadar -20 ° C DMSO kimyasal bileşiklerin 10 mM stok çözeltileri ihtiva eden 96 oyuklu plakalar ana hareket ettirin. Seyreltik bileşikler, 2 mM'de orta 96 oyuklu plakalar seyreltme elde etmek üzere DMSO içinde 5 kat. Seyreltme DMSO içinde 20 ul içine 5 ul pipetleme ve karıştırılarak elde edilir.
- Pipet beyaz, bar kodlu doku kültürü, 96 oyuklu plakaların kuru kuyu içine seyreltme plakalarından 1 ul. Kız plakalar (D1) bu ilk set 20 uM nihai konsantrasyonda bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılacaktır. -20 ° C'de kullanıma kadar saklayın kızı plakalar.
- DMSO ve karıştırma 36 ul halinde seyreltme plakalarından 4 ul pipetleme ile yeniden bileşikleri 1:10 seyreltin. Beyaz, düz dipli, bar kodlu doku kültürü 96-kuyu tabak kuru kuyu içine Pipet 1 ul. Kız plakalar (D2) bu ikinci grubu PD replicatio inhibisyonunu değerlendirmek için kullanılacaktır2 uM nihai konsantrasyonda bileşiklerle n. -20 ° C'de kullanıma kadar saklayın kızı plakalar.
2.. Hücre Kültürlerinin Hazırlanması Bileşik toksisitesini belirlemek için
- 37 ° C'de HEK-293T hücrelerin büyümesine ve% 5 CO2 Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde stabilize L-glutamin ve% 10 fetal buzağı serumu (FCS), streptomisin (100 ug / ml) ve penisilin (100 ile IU / ml). Hücreler, her 4-5 gün tripsinizasyon ile geçişli ve yeni bir şişe içine 1:10 seyreltilir. Hücreler, deney için log fazında olmalıdır.
- Deney gününde, hücreler tripsinizasyon ile geri ve hücre sayımı gerçekleştirin. Pelet santrifüj ile hücreler ve kültür ortamı içinde 3 x 10 5 hücre / ml 'de tekrar süspansiyon bunları. Hücre süspansiyonu 12.5 ml, her tarama plakası için gerekli olduğunu göz önünde bulundurun.
- Transfer oluğuna hücreleri ve kirpi kimyasal alçı ihtiva eden D1 plakalar içinde hücre süspansiyonu 100 ul dağıtmakunds. Oluk içinde hücre süspansiyonu düzenli tortulaşmayı önlemek için karıştırılır.
- 1 ul DMSO ile kontrol kuyuları A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 ve G12 başak. Karşılık gelen kuyu canlı hücreler için bir referans (toksisite) olarak kullanılacaktır. Kontrol kuyuları B1 başak, D1, F1, H1, 1 ul DMSO ve hücreleri öldürmek için bir 0.5% IGEPAL çözeltisi 2.5 ul B12, D12, F12 ve H12. Karşılık gelen kuyu ölü hücreleri için bir referans (yüksek toksisite) olarak kullanılacaktır.
- 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edin ve hücreleri,% 5 CO2.
RMV2/Luc tarafından enfekte Hücre Kültürleri 3. Hazırlanması
- Büyüme ve 2.1 ve 2.2 'de açıklandığı gibi hücreleri kurtarmak. Yine, kültür ortamı içinde 3 x 10 5 hücre / ml 'de tekrar süspansiyon hücreleri. Hücre süspansiyonu 12.5 ml, her tarama plakası için gerekli olduğunu göz önünde bulundurun.
- İsteğe bağlı: 20 ug / ml 'de ek üridin ile kültür ortamı.
Not: viral replicatio için kimyasal kütüphanelerinin taranması zamann inhibitörleri, bu pirimidin biyosentez yolunun erken aşamaları hedefleme bileşikleri sık sık 13,16,27,28 izole gibi görünüyor. Kültür ortamına üridinin ilavesi gibi antiviral molekülleri filtrelemek için kullanılır. Gerçekten de, bu etkin bir pirimidin biyosentez yolunun üst enzimler engellenir viral replikasyonu yükler. - Enfekte edilmemiş hücreler ile kontrol kuyuları için hücre süspansiyonu 01:10 to ve kalan hacmi ile enfeksiyon geçin.
- RMV2/Luc stok çözeltinin uygun hacmi çözülme. MV stok solüsyonları ml başına 10 6 -10 8 enfeksiyöz partiküller genellikle. Kültür enfeksiyon (MOI) 0.1 çokluğu karşılık gelen hedef hücre başına rMV2/Luc 0.1 bulaşıcı parçacıklar, ile enfekte olması gerekir. Not: rMV2/Luc PD aşısı (Schwarz suşu) elde edilir ve bir BSL2 ortamda değiştirilebilir.
- Hücre süspansiyonu virüs ekleyin ve hafifçe karıştırın. Bir çukur enfekte hücreleri aktarın ve 100 dağıtmaksütun 2 çivili kimyasal bileşikleri ihtiva eden D2 plakaları 11 olarak enfekte edilmiş hücre süspansiyonu ul. Oluk içinde hücre süspansiyonu düzenli yavaşça karıştırılır.
- Sütun 1 ve 12'de, 100 non-enfeksiyonlu hücrelerin ul iyi olarak iki tane dağıtmak. Enfekte hücreler, diğerleri kuyularda dağıtılır.
- 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edin ve hücreleri,% 5 CO2.
4. Lüsiferaz Aktivite Önlemleri ve Veri Analizi
- Inkübatörden D1 plakaları çıkarın ve doğrudan kültür çukurlarına lusiferaz tabanlı canlılığı maddesi 50 ul eklenmesi ile hücre canlılığı belirler. Karıştırınız ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edilir. Bir lüminometre ile plakaları okuyun. Entegrasyon zamanı kuyunun başına 100 milisaniye olarak belirlenmiştir.
- Inkübatörden D2 plakaları çıkarın ve doğrudan kültür çukurlarına lusiferaz alt-tabaka, 50 ul ekleyerek lusiferaz aktivitesinin belirlenmesi. Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca inkübe edin ve anlatıldığı şekilde bir lüminometre ile plakaları okuYukarıdaki yatak.
- Ekranın 29 kalitesini garanti etmek için toksisite deneyi her bir D1 bir plaka için Z'-faktörü hesaplanır. Μ + ve σ + yalnız DMSO ile HEK-293T hücreleri için parlaklık ve standart sapmalar (toksisite) vasıtasıyla tekabül - (μ-, Z '= 1-3 * (σ + + σ-) / μ +) ve μ-ve ışık yayılımı ve hücrelerini öldürmek için Igepal işlemden kültür çukurlarına için standart sapma anlamına gelir σ-bulunmaktadır. Z ', 0.5' in yukarısında olması beklenen, veya karşılık gelen plaka atılır.
- Μ + / 2 toksisite eşiğini ayarlayın. Bu cut-off (Şekil 3A) altında ışıldama değerleri ile bileşikler atın.
- Antiviral tahlil D2 her bir plaka için Z'-faktörü hesaplanır. Burada, μ + ve σ + yalnız DMSO ile enfekte kültürlenmiş hücreler için parlaklık ve standart sapmaların araçlarına karşılık gelir ve μ-ve enfekte olmayan hücreler için parlaklık ve standart sapmaları araçları σ-bulunmaktadır. Yine, Z & # ile plakaları39; 0,5 altındaki değerler de göz ardı edilir.
- - / (Μ + - μ-) x 100 = (bileşik X lusiferaz aktivitesi μ +) inhibisyon yüzdesi: aşağıdaki gibi viral replikasyonun inhibisyonunu hesaplayın. % 75 inhibisyon eşik ayarlayın, hem de bu cut-off (Şekil 3B) altında ışıldama değerlerini azaltmak ve 4.4 açıklanan kriterlere göre toksik olmayan bileşikler seçin.
Toksisite ve Geniş spektrumlu Antiviral Aktivite 5. İkincil Ekran
- Her biri için 1:2 dizi sulandırmalar 500 uM 4 uM (8 seyreltme) başlanarak DMSO içerisinde bileşik isabet olun. Kültür ortamında 50 ul ile beyaz, bar kodlu doku kültürü plakaları doldurun. Kültür kuyularda Her bileşik seyreltmesinin 1 ul ekle. Her hit bileşik için çift seri seyreltileri ile 3 kültür plakaları iki kez tekrarlayın.
- (Yukarıda tarif edildiği gibi kültür ortamı içerisinde 6 x 10 5 hücre / ml 'de bir HEK-293T hücre süspansiyonu hazırlamak 37.5 ml 2.1 ve 2.2). Falcon tüplerde 2x 12.5 ml dağıtın ve MOI'da rMV2/Luc ile ya hücreleri enfekte = 0.1 ya da MOl'de Renilla lusiferaz (CHIKV / Ren) ifade eden biraraya getiren CHIKV = 0.2. Ters çevirerek karıştırın.
Not: CHIKV / Ren CHIKV bir vahşi tip suşu elde edilir ve bu nedenle bir BSL3 ortamda temas edilmelidir. Renilla alt-tabaka kültür çukurlarına eklenmiştir sonra levhalar (aşağıya bakınız) BSL1 için BSL3 taşınmış olabilir. - Hit bileşiklerinin seri seyreltmeleri içeren kültür plakaları içinde, enfekte olmamış rMV2/Luc-infected veya CHIKV / Ren-enfekte edilmiş hücreler, 50 ul koyun. 37 ° C'de 24 saat inkübe
- RMV2/Luc-infected kuyularda ateş böceği lusiferaz aktivitesinin belirlenmesi için, ateş böceği lusiferaz alt-tabaka 50 ul ekle. CHIKV / Ren-enfekte kuyuda Renilla lusiferaz aktivitesinin belirlenmesi için Renilla lusiferaz alt-tabaka 50 ul ekle. Son olarak, hücre yaşayabilirliği belirlemek için, enfekte olmamış hücrelere lusiferaz tabanlı canlılığı tahlil maddesi 50 ul ekle.
- Arsa veri (FiGüre 4) ve% 50 MV ve CHIKV çoğalmasını inhibe vurmak bileşik konsantrasyonları belirler. Bu deneyde bir toksisite gösteren bileşiği göz ardı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu tarama hattı PD çoğalmasını önleyen bileşiklerin seçimi ilk dayanır ve önemli bir hücresel toksisite (Şekil 1, birinci ekranı) göstermezler. Bu, hücre toksisitesi ve viral replikasyonun inhibisyonunu belirlemek üzere lusiferaz bazlı deneylerde yararlanır. Tüm adımlar, pipetleme ve veri toplama bir robot platform ile, bir yüksek verimli bir ortamda gerçekleştirilebilir.
Bileşiklerin hücresel toksisite, metabolik olarak aktif hücrelerin karşılık mevcut ATP, ve nicelenmesine dayanan kültür içinde canlı hücre sayısını hesaplayan bir lusiferaz tabanlı canlılığı deneyi kullanılarak değerlendirilir. Lusiferaz tarafından lusiferin oksidasyon ATP bağımlı olduğu için, ışıma sinyali. Şekil 3 A, bir temsilcisi ve tarama plakası için sonuçları gösteren canlı hücreler tarafından sağlanan hücresel ATP ile doğrudan orantılıdır. Beklendiği gibi, çok belirgin bir lusiferaz aktivitesi değerleri kuv idiIgepal ile öldürüldü canlı hücreler ya da ölü hücreleri ya da içerdiği, kontrol oyuklarında ed. Eşik ampirik bazı hücresel toksisite gösteren bileşikleri süzmek için μ + / 2 ayarlanır ve mevcut durumda, bu plaka 21 bileşikleri atıldı. Buna paralel olarak, antiviral aktivitesi rMV2/Luc, PD lusiferaz sentezleyen bir rekombinant suşu (Şekil 2) kullanılarak ölçülmüştür. Onlar MV enfeksiyona karşı oldukça duyarlı olduğundan, insan HEK-293T hücreleri kullanılır. Bunun bir sonucu olarak, enfekte olmuş bir kültür kuyularda lusiferaz aktivitesi (kontrol kuyuları 200-300 x 10 3 lusiferaz aktivitesi tane) oldukça yüksektir. Bu. Şekil 3B bir tarama plaka elde temsilcisi sonuçları gösteriyor MV çoğaltma inhibitörlerinin seçimini kolaylaştıran geniş bir dinamik aralığı sağlar. Dört bileşikler bu örnekte daha fazla% 75 oranında viral replikasyonu önledi ve seçildi.
Son olarak, toksik değildir ve bileşikleri attıviral replikasyon deneyinde pozitif (Şekil 3A ve 3B) seçilir. Onların yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu (IC50) iki ilişkisiz RNA virüsleri (Şekil 1, ikincil ekran) olan MV ve CHIKV, hem de belirlenir. Hit bileşiklerin antiviral aktivitesi (rMV2/Luc) veya Renilla (CHIKV / Ren) ateşböceği lusiferaz sentezleyen ya da rekombinant virüs suşu kullanılarak tespit edilir. Şekil 4A ve 4B, sırasıyla MV ve CHIKV çoğaltma için temsili inhibisyon eğrileri gösterir. Bu eğriler, hit bileşiklerin IC50 değerlerine belirlemek için kullanılır. Buna paralel olarak, seçilen bileşiklerin hücresel toksisite eksikliği, yukarıda tarif edilen lusiferaz bazlı canlılığı deneyi (Şekil 4C) kullanılarak bir doz-yanıt deneyde teyit edilir. Tablo 1 13 olmayan bir dizi PD ve CHIKV çoğaltma için IC50 değerleri gösteren 10,000 bir molekül kimyasal kütüphanesinden tespit toksik bileşikler yer alır. Bu bileşimunds Her iki kimyasal yapısı ve biyolojik aktivitesi bakımından yenidir. Bu moleküllerin bazıları yapısal benzerliğe sahiptir ve üç ayrı kimyasal aileleri halinde toplanabilir. Bir referans olarak, brequinar elde edilen IC50 değerleri de. Brequinar 30,31 in vitro güçlü bir anti-viral etkinliği olan dihidroorotat dehidrojenaz inhibitörü, pirimidin biyosentez yolunun dördüncü enzim olduğu Tablo 1 'de gösterilmiştir. IC50 değerleri bakarken, büyüklük az bir sipariş taraması ile tanımlanan en aktif hits bu referans molekülü ayrılır. Bu seçili bileşiklerin güçlü antiviral aktivite kurulmuştur.
Tarama hattı Şekil 1.. Özeti. Sol panel p gösteriyorbileşiklerin toksisite ve PD çoğaltma engellemek için kapasite eksikliği için seçilir rimary ekranı. Sağ panel seçilen bileşiklerin antiviral aktivitesi onaylanır ikinci ekranı gösteren ve CHIKV replikasyonunu bloke etme kapasitesi belirlenir. Verimli bir önemli toksisite olmadan MV ve CHIKV engellemek Bileşikler RNA virüslerinin olası geniş spektrumlu inhibitörleri olarak kabul edilmektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2,. Lusiferaz genini taşıyan rekombinant RNA virüslerinin genomik organizasyonu. (A) rMV2/Luc: MV, negatif sens RNA genomu altı genlerle, soldaki 3 'ucu ile gösterilirharflerle gösterilen ve beyaz dikdörtgenler olarak tasvir. Raportör geni için ek transkripsiyon birimleri kodlayan genler P ve M arasına yerleştirilir ve san bir dikdörtgen olarak gösterilmiştir (B) CHIKV / Ren:. CHIKV pozitif sens RNA genomunun sol 5'-kapaklı ucu ile gösterilir, Dört yapısal olmayan proteinleri kodlayan açık okuma çerçevesi ile (nsP1-4). resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Bir 96 oyuklu plaka taranması için Örnek sonuçlanır. (A), lusiferaz bazlı canlılığı deneyi ile elde edilen Lusiferaz değerleri. Sütunlar 1 ve 12 tek başına DMSO ile alternatif kontrollere karşılık gelen ("+", hiçbir etki) ya da IGEPAL ("-", yüksek toksisitesi şehir). Beyaz bir kuyu toksik bileşiklerine (lusiferaz değerleri <12203 x 10 3). (B) rMV2/Luc-infected hücreleri ile elde Lusiferaz değerleri uygun ise mavi renk, kültür çukurlarına tespit ATP konsantrasyonlara göre toksik görmediği bileşikleri vurgulayarak. ("-") Ya da tek başına DMSO ile muamele edilmiş hücreler rMV2/Luc-infected ("+") Sütunlar 1 ve 12 alternatif kontrol örneğin, enfekte olmayan HEK-293T hücrelerine karşılık gelir. Test edilen her bir bileşik için, şekil lüsiferaz ışıldama sinyali ve kontrol yuvalarına nisbetle inhibisyon yüzdesini hem de gösteriyor. Fazla% 75 oranında parlaklık sinyalini inhibe bileşikler (A) belirlendiği gibi, toksik ya da kabul olsaydı sarı veya yeşil olarak vurgulanır. Bu nedenle, yeşil renk PD çoğalmasını inhibe eden ve hücre canlılığı etkilemez isabet bileşikleri gösteriyor.t = "_blank"> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Bileşikler, C864, C648 ve C062 Şekil 4,. Doz-yanıt antiviral etkinlik ve toksisite. (A) HEK-293T hücreleri, lusiferaz sentezleyen MV rMV2/Luc suşu ile (MOI = 0.1) enfekte olmuş, ve tek başına C864, C648, C062 veya DMSO artan dozları ile inkübe edildi. 24 saat sonra lusiferaz ekspresyonu tespit edilmiştir. * Lusiferaz gözlenen inhibisyon tüm üç bileşiğin (p değerleri <0.05) ile istatistiksel olarak anlamlı olduğunu göstermektedir. (B) HEK-293T hücreleri Renilla lusiferaz (MOI = 0.2) ifade CHIKV of CHIKV / Ren suşu ile enfekte edildi ve artan kuluçkalanmıştır Tek başına C864, C648, C062 ve DMSO'nun doz. 24 saat sonra Renilla lusiferaz ifadesi belirlenmiştir. * Istatistiksel gösterirÜç bileşikler (p değerleri <0.05) olarak anlamlı inhibisyon. (C)-HEK 293T hücreleri, tek başına C864, C648, C062 veya DMSO artan dozları ile inkübe edildi. Toksisite için bir kontrol olarak, hücre kültürlerinin bir 0.5% IGEPAL çözeltisi 2.5 ul ile takviye edilmiştir. 24 saat sonra canlı hücre sayısı, lusiferaz tabanlı canlılığı deneyi kullanılarak belirlendi. büyük resim görüntülemek için .
| Kimyasal Aile | Bileşik | MV (IC50 uM) | CHIKV (IC50 uM) | CC50 (uM) |
| 1 | C864 | 0.6 | 0.6 | > 5 |
| 1 | C877 | 0.2 | 0.2 | > 5 |
| 1 | C957 | 1.2 | 1.2 | > 5 |
| 1 | C963 | 1.2 | 0.9 | > 5 |
| 1 | C967 | 1.7 | 1.6 | > 5 |
| 1 | C348 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C265 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C270 | 0.5 | 0.5 > 5 | |
| 1 | C350 | 0.4 | 0.5 | > 5 |
| 2 | C646 | 0.16 | 0.15 | > 5 |
| 2 | C814 | 1.9 | 1.1 | > 5 |
| 2 | C648 | 0.7 | 0.4 | > 5 |
| 3 | C062 | 1 | 1.2 | > 5 |
| Brequinar | 0.04 | 0.04 | > 5 |
13 Tablo 1.. Antiviral aktivitesi ve sitotoksisiteorijinal kimyasal kütüphanesinden seçilen bileşiklerdir. Sonuçlar MV ya da engellenmesi CHIKV çoğaltma için IC50 değerleri olarak ifade edilmiştir. CC50 değerleri ikinci ekrandan doz-yanıt deneylerde tüm bileşikler için> 5 um bulunmuştur. Ancak birincil ekranından sitotoksik skorlama filtre eşik CC50 değerlerinin bile> 20 uM olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan tarama hattı RNA virüslerinin geniş spektrumlu inhibitörleri olarak uygun bir profili olan bileşiklerin seçilmesi amaçlamaktadır. 10000 bileşiklerinin bir kütüphane bu protokol ve belirtilen kriterleri filtreleme uygulanmıştır ile tarandı zaman,% 75, 40 bileşikleri (% 0.4) daha üstün PD replikasyonunun inhibisyonu, yani pozitif attı. Bunun yanı sıra, bunların yaklaşık yarısı lusiferaz tabanlı canlılığı deneyde bir toksisite göstermiştir ve bu nedenle göz ardı edilmiştir. Son olarak, büyük bir miktarda hazır itibaren bir düzine yeniden test edilmiştir. Bu küçük ayarlamak kolay hem de hücresel zehirlilik ve doz-yanıt deneylerde MV ve CHIKV karşı viral replikasyonun inhibisyonu (Şekil 4) için yeniden test edildi. Seçilen tüm bileşiklerin antiviral aktivitesi doğruladı ve bu tarama hattı için genel tanım isabet oranı 1,3 ‰ oldu. Bu puan farklı yüksek verim ile, diğer gruplar tarafından elde edilen sonuçlar çok benzerantiviraller 27,32 ve (1-5 ‰ 33), genel olarak hücre bazlı fenotipik deneyleri için beklenen aralığı içinde yer için çoğaltma bazlı tarama deneyleri. Ancak, isabet oranı toplanan verilerin profiline bağlı olarak ayarlanabilir, hangi elenir bileşik kütüphane ve puanlama filtre eşik hem de son derece bağlıdır. Burada, PD replikasyonu ve hücre toksisitesinin önlenmesi için seçilen eşik değerler deneysel olarak tespit edilmiştir, ve ticari kapalı kolayca CHIKV karşı ikinci bir ekran yeniden test edilebilir itibaren bir uysal sayısını elde etmek için ayarlanmıştır.
Birincil ekranında bileşikler PD replikasyonu ve hücre toksisitesinin eksikliği engellemek için her ikisi de kapasitesi için test edildi. Hücresel toksisite, 20 uM ile belirlendi ise Antiviral aktivite rMV2/Luc-infected hücreleri üzerinde 2 uM bir yoğunlukta belirlendi. Bu deneysel ayarlar doğrudan yüksek anti-olan bileşikler için seçmek için değerli bulunmuşturhücresel toksisiteye viral aktivitesi göreli. Buna ek olarak, ana ekran üridinin mevcudiyetinde gerçekleştirildi. Gerçekten de, yeni yayınlar RNA virüsleri 13,16,27,28 inhibitörleri ararken pirimidin biyosentez yolunun erken aşamaları hedefleme bileşikleri sık sık izole edilmiş olduğunu göstermektedir. Özellikle, antiviral moleküller için ideal araştırma grupları, dihidroorotat dehidrojenaz inhibitörleri, bu metabolik sentez yoluna 31, dördüncü enzim bulduk. Böylece, bu enzimin engellenmesi için kültür ortamı, etkili bir şekilde trans-tamamlayıcı uridin ve viral replikasyonu yükler. Bu sayede, pirimidin biyosentez yolunun engellenmesi yoluyla PD çoğaltma önlemek bileşikler, direkt olarak antiviral itibaren dahil edilir. Son olarak, Z'-faktör böylece tahlilin yüksek sağlamlık ve kalitesini göstermede, sistematik olarak 0.5 üzerinde olduğu bulundu.
Buna paralel olarak, hücresel toksisite yüksek throughpu kullanılarak belirlendiATP nicelenmesine dayanan kültür içinde metabolik olarak aktif hücrelerin sayısını belirler t lusiferaz dayalı tahlil. Her bir tarama plakası olarak, IGEPAL toksisite için kontrol oyuklarına ilave edildi. Bu, denatüre edici olmayan, non-iyonik bir deterjan lusiferaz enzim etkinliğini etkilemeden, spesifik olmayan bir şekilde etkin bir şekilde tüm hücre tipleri öldürme avantajına sahiptir. Z'-faktör böylece tahlilin yüksek sağlamlık ve kalitesini göstermede, sistematik olarak 0.5 125 üzerinde plakaları üzerinde oldu. Bu hücresel toksisite deneyinin bir sınırlama, nispeten yüksek maliyetidir. Hücre canlılığı belirlemek için alternatif bir deneyde olduğu gibi, bazı gruplar yapısal olarak stabil bir transgenin 34 lusiferazı ifade eden hücre hatları kullanılmıştır. Bu tür deneylerde, toksik bileşikler, hücre canlılığını etkileyen zaman, lusiferaz ekspresyonunu azaltmak ya da bastırmak için beklenir. Yakın zamanda IFN-β uyarılması 35 üzerine lusiferazı ifade eden dengeli bir hücre çizgisinin geliştirilmiş ve bu hücre çizgisi bir tr test etmek için kullanıldıhücresel toksisite için 80 bileşiklerin Aining kümesi. Şaşırtıcı bir şekilde, bu deneyde, yukarıda tarif lusiferaz tabanlı canlılığı deneyi arasındaki korelasyon katsayısı (CC) göreceli olarak düşük olduğu (CC = 0.67). ATP metabolizmanın etkilenmemiş iken Gerçekten de, çeşitli bileşikler, transgenin lusiferaz ekspresyonunu bozulmuş. Bazı geniş spektrumlu antiviral bileşikler, aynı zamanda, hücresel gen ekspresyonu düşeceğinden hücreler arası iletimde, gen transkripsiyonu ya da protein çevirisi gibi hücre fonksiyonlarını etkiler olasıdır. Hücresel canlılığı için hiçbir mükemmel bir tarama sistemi mevcut olmasına rağmen, hücresel gen ifadesine dayalı toksik bileşikler filtreleme potansiyel niyetli antiviral moleküller hariç götürecek risk altındadır.
İkinci tam ekran bunların IC50 değerlerine belirlenirken, iki tamamen ilgisiz RNA virüslerine karşı seçilen bileşiklerin antiviral aktivitesi tespit etmeyi amaçlamaktadır. İlginç bir şekilde, bu fark gerektiğini lusiferaz enzimiinhibitörleri yanlış rMV2/Luc deneyinde pozitif olarak atılır olabilir ama bu tür yanlış-pozitif filtre-out olacak ikinci bir ekran tarafından CHIKV / Ren inhibisyonu için test. Nitekim, rMV2/Luc ve CHIKV / Ren sırasıyla, ateşböceği ve Renilla lusiferaz ifade ve bu iki enzim ilgisiz ve farklı kimyasal reaksiyonları katalize. Birincil ekranında rMV2/Luc gelen ateşböceği lusiferaz muhabiri önleyen bileşikler CHIKV / Ren karşı herhangi bir aktivite göstermez ve böylece antiviral olarak hatalı seçim önlenmesi, atılır. Beklenmedik, PD çoğalmasını engelleyen 13 ilköğretim vurur da bu ikincil ekranda CHIKV önledi. Bu, her zaman diğer kitaplıkları (veriler gösterilmemiştir) elenirken, kaç MV-spesifik inhibitörler olarak izole edildi durum böyle değildir. Ayrıca, seçilmiş bileşikler, yapısal benzerlik ve sadece üç kimyasal türleri (Tablo 1) toplanabilir. Bir kimyasal aile içinde bileşikler muhtemelen acti aynı modu varüzerine ve bu nedenle, aynı kimyasal oluşum analogları olarak kabul edilebilir. Bu perspektif içine tüm 13 Seçilen bileşikler MV ve CHIKV çoğaltma hem de inhibe olduğu gerçeğini koyar. Bununla birlikte, bu sonuçlar, aynı zamanda, geniş spektrumlu antiviral daha sık virüs özel inhibitörleri göre tespit edilmiş olabilir göstermektedir. Bu hipotez arkasındaki mantık, belirgin özelliklerine rağmen, her RNA virüsleri örneğin ribozomal makine, hücre iskeletinin veya enerji kaynağı olarak mitokondri gibi çoğaltmak için aynı temel hücre fonksiyonlarının düzenlenmesiyle, dayanmasına olmasıdır. Bu fonksiyonel modüller, geniş spektrumlu antiviraller için potansiyel hedefler nispeten büyük bir panel sağlamaktır kompleks moleküler sistemleri bulunmaktadır. Bunun aksine, virüs spesifik inhibitörleri yükseltmek için uygun hedefleri temsil viral veya hücresel faktörleri sınırlı sayıda sadece vardır. Gelecekte, fenotipik tarama ile tanımlanır antivirallerin yeni panelleri bu hipotezi onaylamak ya da geçersiz kılmak için gerekli verileri sağlamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz onun verimli görüş ve önerileriniz için Dr Yves L. Janin teşekkür ederim. Biz onu teknik destek için CHIK / Ren ve C. Combredet HH Gad teşekkür etmek istiyorum. Pasteur İlletler Infectieuses (POV'un için Program Sting ve HM-- Bu çalışma Institut Pasteur, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale (INSERM), Institut Carnot tarafından desteklenen L), Agence Nationale la Recherche POV'un için (ANR-RPIB, Program STING 2.0) ve "Conseil Régional d'Ile-de-France" (Kimyasal Kütüphane Projesi dökmek, hibe n I 06-222 / R ° ve ben HM-L 09-1739 / R.). CHIKV / Ren üzerindeki çalışmalar proje ArbOAS tarafından desteklenmiştir (ANR hibe 2010-INTB-1601-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-well polystyrene cell culture microplates, white | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity. |
References
- De Clercq, E. Antiviral drugs in current clinical use. J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).
- Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals. Curr Opin Virol. , (2013).
- Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses. Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).
- Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase. J Virol. 79, 1943-1947 (2005).
- Wang, B. X., Fish, E. N. The yin and yang of viruses and interferons. Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).
- Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus. Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).
- Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. Systems biology and the host response to viral infection. Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).
- Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics. Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).
- Connolly, D. J., O'Neill, L. A. New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics. Curr Opin Pharmacol. , (2012).
- Thakur, C. S., et al. Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).
- Shoji-Kawata, S., et al. Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide. Nature. 494, 201-206 (2013).
- Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).
- Bonavia, A., et al. Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV). Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).
- Rider, T. H., et al.
- Krumm, S. A., et al. Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases. PLoS One. , (2011).
- Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).
- Harvey, R., et al. GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity. Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).
- Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE. J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).
- Panchal, R. G., et al. Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens. J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).
- Pohjala, L., et al. Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays. PLoS One. 6, (2011).
- Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem Biol. 17, 646-657 (2010).
- Komarova, A. V., et al. Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses. Mol Cell Proteomics. , (2011).
- Henrik Gad, H., et al. The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry. Virology. 434, 27-37 (2012).
- Wang, Q. Y., et al. Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis. J Virol. 85, 6548-6556 (2011).
- Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Qing, M., et al. Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture. Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).
- Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses. J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).
- Yoon, J. J., et al. High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors. J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).
- Maréchal, E., Roy, S., Lafanechère, L. Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , Springer. (2011).
- Gentzsch, J., et al. Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity. Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).
- Caignard, G., et al. The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells. PLoS One. 8, (2013).
