Summary
Os ensaios in vitro para medir a replicação do vírus tem sido melhorada pelo desenvolvimento de vírus de RNA recombinantes que expressam luciferase ou outras enzimas capazes de bioluminescência. Aqui detalhamos uma triagem gasoduto de alto rendimento, que combina essas linhagens recombinantes de sarampo e vírus chikungunya para isolar os antivirais de amplo espectro de bibliotecas químicas.
Abstract
Vírus de RNA são responsáveis por importantes doenças humanas, tais como a gripe, bronquite, dengue, hepatite C ou sarampo. Eles também representam uma ameaça emergente devido ao aumento das trocas em todo o mundo e as populações humanas penetrantes ecossistemas mais e mais naturais. Um bom exemplo desse tipo de situação emergente é epidemias de vírus chikungunya de 2005-2006, no Oceano Índico. Avanços recentes em nossa compreensão de caminhos celulares que controlam a replicação viral sugerem que os compostos que visam funções da célula hospedeira, em vez de o próprio vírus, poderia inibir um grande painel de vírus RNA. Alguns compostos anti-virais de amplo espectro têm sido identificados com ensaios orientados-alvo do hospedeiro. No entanto, a medição da inibição da replicação do vírus em culturas de células utilizando a redução de efeitos citopáticos como uma leitura ainda representa uma estratégia de rastreio primordial. Esses rastreios funcionais foram significativamente melhoradas pelo desenvolvimento de vírus recombinantes que expressam as enzimas repórter cazes de bioluminescência, tais como a luciferase. No presente relatório, detalhamos um gasoduto high-throughput screening, que combina o sarampo recombinante e vírus chikungunya com ensaios de viabilidade celular, para identificar compostos com um perfil antiviral de amplo espectro.
Introduction
Vírus de RNA são responsáveis por uma grande variedade de infecções humanas, e têm um enorme impacto sobre as populações de todo o mundo, tanto em termos de saúde pública e de custo econômico. Vacinas eficazes têm sido desenvolvidos contra diversos vírus de ARN humano, e são amplamente utilizados como tratamentos profiláticos. No entanto, ainda existe uma falta crítica de medicamentos terapêuticos contra infecções por vírus RNA. Na verdade, as vacinas não estão disponíveis eficientes contra as principais patógenos humanos, tais como o vírus da dengue, vírus da hepatite C ou vírus respiratório sincicial humano (HRSV). Além disso, os vírus de RNA são responsáveis pela maioria das doenças emergentes, que aumentaram em freqüência por causa de trocas globais e impacto humano sobre sistemas ecológicos. Contra esta ameaça que representam os vírus de RNA, nosso arsenal terapêutico é extremamente limitado e relativamente ineficiente 1-3. As terapias atuais são, essencialmente, com base no tipo recombinante interferons I (IFN-α / β) para estimular a imunidade inata,ou a administração de ribavirina. Embora o modo de ação deste analógico ribonucleosido é controverso e, provavelmente, depende de vários mecanismos, a inibição da IMFDH celular (inosina monofosfato desidrogenase), que esgota intracelulares piscinas GTP, é claramente essencial 4. Ribavirina, em combinação com IFN-α peguilado, é o principal tratamento contra o vírus da hepatite C. No entanto, os tratamentos de IFN-α / β e ribavirina são de relativamente fraca eficácia in vivo contra a maioria dos vírus de ARN em que a sinalização eficiente romba IFN-α / β através da expressão da virulência 5 e frequentemente escapar ribavirina 3. Isso, somado ao fato de que a ribavirina está levantando questões importantes de toxicidade, embora tenha sido aprovado recentemente contra a doença hRSV grave com benefícios controversos 6. Mais recentemente, alguns tratamentos específicos do vírus têm sido comercializados, em particular contra o vírus influenza, com o desenvolvimento of inibidores da neuraminidase 3. No entanto, a grande diversidade e emergência permanente de vírus RNA impede o desenvolvimento de tratamentos específicos contra cada um deles em um futuro relativamente próximo. Ao todo, este sublinha a necessidade de estratégias eficientes para identificar e desenvolver moléculas antivirais potentes em um futuro próximo.
É trivial para dizer que um inibidor de largo espectro activo contra um grande painel de vírus de ARN resolveria este problema. Embora tal molécula ainda é o sonho de um virologista, a nossa melhor compreensão dos mecanismos de defesa celular e sistema imune inato sugerem que algumas possibilidades existem 7,8. Vários laboratórios acadêmicos e industriais estão agora a procurar moléculas que estimulam facetas específicas de mecanismos de defesa celular ou vias metabólicas para diminuir a replicação viral. Embora tais compostos provavelmente mostram efeitos colaterais significativos, tratamentos contra infecções virais agudas serão administrared por um tempo relativamente curto, tornando-as aceitáveis, apesar de alguma toxicidade potencial no longo prazo. Várias estratégias têm sido desenvolvidos para identificar estas moléculas antivirais de largo espectro. Alguns programas de pesquisa visam encontrar moléculas que têm como alvo as vias de defesa ou metabólicas específicas. Isso inclui, por exemplo, receptores de reconhecimento de patógenos, para esclarecer a expressão do gene antiviral 9 e ativam fatores antivirais como RNaseL 10, máquinas autofagia para promover a degradação do vírus 11, a síntese de nucleosídeos vias 12,13, ou cascatas apoptóticos para precipitar a morte de células infectadas por vírus 14. Outros grupos têm desenvolvido telas fenotípicos que não são baseadas em alvo 13,15-17. Nesse caso, as moléculas antivirais são simplesmente identificados pela sua capacidade para bloquear a replicação do vírus em um determinado sistema celular. A suposição é de que em geral um composto inibidor de 2-3 vírus RNA não relacionadas que têm um perfil apropriado para um amplo spectrum molécula antiviral. O modo de acção dos compostos seleccionados de golpes com uma tal abordagem empírica é determinado apenas em um segundo tempo e, eventualmente, pode levar à identificação de novos alvos celulares para antivirais. Curiosamente, uma análise retrospectiva de novas drogas aprovadas pelo os EUA Food and Drug Administration, entre 1999 e 2008 mostrou que, em geral, esses exames fenotípicas tendem a ter melhor do que as abordagens por objectivo realizar a descobrir primeiro-in-class drogas de pequenas moléculas 18 .
A replicação viral em ensaios baseados em células de alto rendimento geralmente é determinada a partir de efeitos citopáticos do vírus. As células são infectadas e cultivadas em 96 - ou placas de 384 poços na presença dos compostos testados. Depois de alguns dias, as camadas celulares são fixadas e coradas com corantes, tais como violeta de cristal. Finalmente, a absorvência é determinada com um leitor de placas e os compostos que inibem a replicação viral são identificados pela sua capacidade para preservar as camadas celulares from efeito citopático induzido pelo vírus. Alternativamente, os efeitos citopáticos mediados por vírus são avaliados utilizando ensaios de viabilidade de padrão, tais como a redução de MTS. Tais ensaios são altamente tratável e de baixo custo, mas sofrem de três grandes limitações. Primeiro, eles exigem uma combinação vírus-célula, onde a replicação viral é citopático em apenas alguns dias, mas nem sempre isso é possível, chamando, assim, para abordagens alternativas 19. Em segundo lugar, eles são mal quantitativa, uma vez que são baseados em uma medida indireta da replicação viral. Finalmente, os compostos tóxicos podem ser classificados como resultados positivos, e, portanto, deve ser eliminado, com um ecrã de contador que mede a viabilidade celular. Para ultrapassar algumas destas dificuldades, os vírus recombinantes, ou replicões foram projectadas por genética reversa para expressar proteínas repórter, tal como luciferase ou EGFP, a partir de uma unidade de transcrição adicional ou em grelha com genes de proteínas virais (alguns exemplos são 20-23). Quando estes vírus se replicar, pr repórteroteins são produzidos em conjunto com as proteínas virais próprios. Isto proporciona um ensaio muito quantitativa para medir a replicação viral e avaliar a actividade inibidora de moléculas candidatas. Isto é particularmente verdadeiro para os vírus recombinantes que exprimem a luciferase (ou outras enzimas capazes de bioluminescência) uma vez que este sistema repórter apresenta uma vasta gama dinâmica, com uma elevada sensibilidade e praticamente sem fundo. Além disso, não há uma fonte de luz de excitação, evitando assim a interferência com fluorescência composto 24.
Aqui, detalhes de um protocolo de alto rendimento para a tela bibliotecas químicas para inibidores de amplo espectro de vírus RNA. Os compostos são testados em células de seres humanos infectados com um vírus de sarampo recombinante (MV) que expressam a luciferase do pirilampo 25 (rMV2/Luc, Figura 1, a tela de primário). MV pertence Mononegavirales ordem, e é muitas vezes considerado como um membro protótipo de vírus RNA de cadeia negativaes. Como tal, MV genoma é utilizada como um modelo de polimerase viral para sintetizar moléculas de mRNA que codificam para as proteínas virais. Na estirpe recombinante denominado MV rMV2/Luc, a expressão da luciferase é expressa a partir de uma unidade de transcrição adicionais inseridos entre os genes P e M (Figura 2A). Em paralelo, os compostos são testados quanto à sua toxicidade em células humanas utilizando um reagente à base de luciferase comercial que avalia, por quantificação de ATP, o número de células metabolicamente activas na cultura (Figura 1, o ecrã primário). Bibliotecas químicas inteiras podem ser facilmente rastreados com estes dois ensaios, a fim de seleccionar os compostos que não são tóxicos e bloqueiam eficazmente a replicação MV. Em seguida, os hits são testados para a inibição de dose-resposta de replicação MV, a falta de toxicidade assim como quanto à sua capacidade para afectar o vírus Chikungunya (CHIKV) replicação (Figura 1, o ecrã secundário). CHIKV é um membro da família Togaviridae e seu genoma é apmolécula de RNA de fita simples ositive. Como tal, é completamente alheios ao sarampo e compostos que inibem tanto MV e CHIKV tem uma chance grande de inibir um grande painel de vírus RNA. Proteínas não estruturais são CHIKV directamente traduzido a partir do genoma viral, enquanto que as proteínas estruturais são codificadas através de transcrição e tradução de uma molécula de ARNm subgenómico. O nosso ensaio de replicação in vitro para CHIKV baseia-se uma estirpe recombinante denominado CHIKV / Ren, que expressa a enzima luciferase de Renilla como uma parte clivada da poliproteína não estrutural por meio de uma inserção do gene repórter entre NSP3 e NSP4 sequências de 26 (Figura 2B). A medida da atividade da luciferase Renilla permite o monitoramento da replicação viral na fase inicial do ciclo de vida CHIKV.
Este protocolo de alto rendimento foi usada para identificar rapidamente os compostos com um perfil adequado para os antivirais de largo espectro de uma biblioteca comercial de 10.000 Molecules enriquecido pela diversidade química. Os compostos foram essencialmente seguinte regra de cinco de Lipinski, com pesos moleculares variando 250-600 daltons, e registrar valores de D abaixo de 5. Maioria dessas moléculas eram novas entidades químicas não disponíveis em outras bibliotecas comerciais.
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Protocol
1. Preparação de placas de 96 poços com filha Compostos
- Mover placas mãe de 96 cavidades que contêm soluções-mãe 10 mM de compostos químicos em DMSO a partir de -20 ° C até à temperatura ambiente. Diluir 5x compostos em DMSO para se obter placas de intermediários de diluição de 96 poços a 2 mM. A diluição é obtida por pipetagem de 5 ul em 20 ul de DMSO e a mistura.
- Pipete 1 mL de diluição em placas de poços de branco seco, de cultura de tecidos de código de barras placas de 96 poços. Este primeiro conjunto de placas filhas (D1) vai ser utilizado para avaliar a toxicidade dos compostos a uma concentração final de 20 uM. Armazenar as placas filhas a -20 ° C até à sua utilização.
- Dilui-se novamente 1:10 compostos por pipetagem de 4 ul de diluição em placas de 36 ul de DMSO e mistura. Pipetar 1 mL em poços secos de branco, fundo plano, cultura de tecidos com código de barras de 96 poços placas. Este segundo conjunto de placas filhas (D2) vai ser utilizado para avaliar a inibição da MV replication pelos compostos a uma concentração final de 2 fiM. Armazenar as placas filhas a -20 ° C até à sua utilização.
2. Preparação de culturas de células para determinar a toxicidade do composto
- Cultivar células HEK-293T, a 37 ° C e 5% de CO 2 em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com estabilizado L-glutamina e suplementadas com 10% soro fetal bovino (FCS), estreptomicina (100 ug / ml) e penicilina (100 IU / ml). As células são passadas por tripsinização a cada 4-5 dias, e diluído 1:10 em um frasco fresco. As células devem estar em fase de registro para experimentos.
- No dia da experiência, recuperar células por tripsinização e efectuar a contagem celular. Células por centrifugação, e ressuspender-los em 3 x 10 5 células / ml em meio de cultura. Considere-se que 12,5 ml de suspensão de células são necessárias para cada placa de triagem.
- Transferência de células para uma calha, e dispensar 100 ml de suspensão de células em placas D1 contendo componente químico cravadounds. A suspensão de células no interior da calha é agitado periodicamente para evitar a sedimentação.
- Pico de controle de poços A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 e G12 com 1 ml de DMSO. Poços correspondentes serão utilizados como referência para as células vivas (sem toxicidade). Pico de controlo poços B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 e H12 com 1 ml de DMSO e 2,5 mL de uma solução a 0,5% de IGEPAL para matar as células. Poços correspondentes serão usadas como referência para as células mortas (alta toxicidade).
- Incubar as células durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
3. Preparação de culturas de células infectadas por rMV2/Luc
- Crescer e recuperar as células, tal como descrito em 2.1 e 2.2. Mais uma vez, as células ressuspender em 3 x 10 5 células / ml em meio de cultura. Considere-se que 12,5 ml de suspensão de células são necessárias para cada placa de triagem.
- Opcional: meio de cultura suplemento com uridina a 20 mg / ml.
Nota: Quando o rastreio de bibliotecas químicos para replicatio viraln inibidores, parece que os compostos de segmentação etapas precoces da via de biossíntese de pirimidina são frequentemente isolados 13,16,27,28. A adição de uridina para o meio de cultura é usada para filtrar estas moléculas antivirais. Com efeito, esta repõe eficientemente a replicação viral quando as enzimas a montante da via de biossíntese de pirimidina estão bloqueados. - Salve 01:10 de suspensão de células para poços de controlo com células não infectadas, e vá para a infecção com o volume restante.
- Descongelar o volume apropriado de solução de estoque rMV2/Luc. Soluções estoque de MT são geralmente em 10 -10 6 8 partículas infecciosas por ml. A cultura deve ser infectado com 0,1 partículas infecciosas de rMV2/Luc por células alvo, o que corresponde a 0,1 multiplicidade de infecção (MOI). Nota: rMV2/Luc é derivado de vacina MV (cepa Schwarz) e é manipulada de um ambiente de BSL2.
- Adicione o vírus a suspensão de células e misture delicadamente. Transferência de células infectadas para uma calha, e dispensar 100mL de suspensão de células infectadas em colunas de 2 a 11 de placas D2 contendo compostos químicos perfurantes. Suspensão celular dentro da calha é regularmente misturado delicadamente.
- Nas colunas 1 e 12, dispensar 100 ul de células não-infectadas, bem em um dois. As células infectadas são dispensados nos demais poços.
- Incubar as células durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
4. Medidas de luciferase de atividade e de Análise de Dados
- Retirar as placas do incubador D1, e determinar a viabilidade celular através da adição de 50 ul de reagente de viabilidade baseados em luciferase directamente aos poços de cultura. Misturar e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. Ler as placas com um luminómetro. O tempo de integração é de 100 ms por bem.
- Retirar as placas do incubador D2, e determinar a actividade de luciferase por adição de 50 ul de substrato de luciferase directamente aos poços de cultura. Incubar durante 6 minutos à temperatura ambiente, e ler as placas com um luminómetro, como descricama acima.
- Calcular um factor-Z'para cada placa D1 do ensaio de toxicidade para garantir a qualidade da tela 29. Z '= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), onde μ + e + σ correspondem aos meios de luminescência e desvios-padrão para as células HEK-293T com DMSO sozinho (sem toxicidade), e μ e σ-são meios de luminescência e desvios padrão para poços de cultura tratados com IGEPAL para matar as células. Z 'está prevista para ser superior a 0,5, ou a correspondente placa é descartado.
- Definir limite de toxicidade em μ + / 2. Descarte compostos com valores de luminescência abaixo deste ponto de corte (Figura 3A).
- Calcular um factor-Z'para cada placa D2 do ensaio anti-viral. Aqui, μ + e + σ correspondem aos meios de luminescência e desvios-padrão para as células infectadas cultivadas com DMSO sozinho, e μ e σ-são meios de luminescência e desvios-padrão para as células não-infectadas. Mais uma vez, placas com Z & #39; Os valores abaixo de 0,5 são descartados.
- Calcula-se a inibição da replicação do vírus da seguinte forma: percentagem de inibição = (μ + - a actividade da luciferase para o composto X) / (μ + - μ-) * 100. Definir limite de inibição em 75%, e selecionar os compostos que reduzam os valores de luminescência abaixo desse ponto de corte (Figura 3B) e não são tóxicos, segundo critérios descritos em 4.4.
5. Tela secundária para toxicidade e amplo espectro antiviral Atividade
- Fazer diluições em série 1:02 para cada batida composto em DMSO, a partir de 500 uM a 4 uM (8 diluições). Encha branco, placas de cultura de tecidos com código de barras, com 50 ul de meio de cultura. Adicionar 1 ml de cada diluição do composto em poços de cultura. Repita duas vezes para 3 placas de cultura com as diluições em série em duplicado para cada composto de acerto.
- Prepare a 37,5 ml de uma suspensão de células HEK-293T em 6 x 10 5 células / ml em meio de cultura, tal como descrito acima (em 2.1 e 20,2). Dispensar 2x 12,5 ml em tubos falcon e infectar as células com qualquer rMV2/Luc no MOI = 0,1 ou CHIKV recombinante expressando Renilla luciferase (CHIKV / Ren) em MOI = 0,2. Misture por inversão.
Nota: CHIKV / Ren é derivado de uma estirpe de tipo selvagem de CHIKV e, portanto, devem ser manipulados em um ambiente BSL3. As placas podem ser movidos a partir de BSL3 para BSL1 vez de substrato de Renilla foi adicionado aos poços de cultura (ver abaixo). - Dispense 50 ul de células não infectadas, rMV2/Luc-infected ou CHIKV / Ren-infectadas em placas de cultura contendo diluições em série de compostos de sucesso. Incubar 24 horas a 37 ° C.
- Adicionar 50 ul de substrato de luciferase do pirilampo para determinar a actividade da luciferase do pirilampo nas cavidades rMV2/Luc-infected. Adicionar 50 mL de substrato Renilla luciferase para determinar a atividade da luciferase Renilla em CHIKV / poços Ren-infectados. Finalmente, adicionar 50 ul de reagente de ensaio de viabilidade baseados em luciferase para células não infectadas para determinar a viabilidade celular.
- Dados de plotagem (Figura 4) e determinar as concentrações de compostos que inibem o bater MV e replicação CHIKV por 50%. Ignorar composto mostrando alguma toxicidade neste ensaio.
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Representative Results
Este gasoduto triagem depende em primeiro lugar na seleção de compostos que inibem a replicação do MV e não mostram qualquer toxicidade celular significativa (Figura 1, a tela principal). Aproveita-se os ensaios baseados em luciferase para determinar a toxicidade celular e a inibição da replicação viral. Todos os passos de pipetagem e de aquisição de dados pode ser realizada em um ambiente de alto rendimento com uma plataforma robótica.
A toxicidade celular dos compostos é avaliada através de um ensaio de viabilidade baseados em luciferase que avalia o número de células vivas em cultura com base na quantificação de ATP presente, que corresponde às células metabolicamente activas. Porque oxidação luciferina pela luciferase é ATP dependente, sinal de luminescência é diretamente proporcional à ATP celular fornecido por células vivas. Figura 3A está mostrando resultados para uma placa de triagem representante. Como esperado, os valores de actividade de luciferase muito distintas foram mensuráveled em poços de controlo que continham células vivas ou mortas as células mortas com IGEPAL. O limiar é empiricamente estabelecida em μ + / 2 para filtrar compostos que mostram alguma toxicidade celular e, no caso vertente, os compostos 21 desta placa foram descartados. Em paralelo, a actividade antiviral é medida usando rMV2/Luc, uma estirpe recombinante de MV expressando a luciferase (Figura 2). As células HEK-293T humanas são usadas porque são altamente sensíveis à infecção por MV. Como resultado, a actividade da luciferase em poços de cultura infectadas é muito elevada (de 200 300 x 10 3 unidades de actividade de luciferase nos poços de controlo). Isso proporciona uma grande gama dinâmica que facilita a seleção de inibidores de replicação de MT. Figura 3B está mostrando resultados representativos obtidos para uma placa de triagem. Quatro compostos inibiu a replicação viral em mais de 75% neste exemplo e foram selecionados.
Finalmente, os compostos que não são tóxicos e tevepositiva no ensaio de replicação virai são seleccionadas (Figura 3A e 3B). Sua metade concentração inibitória máxima (IC50) é determinada em ambos MV e CHIKV, que são dois vírus de RNA não relacionados (Figura 1, tela secundária). Atividade antiviral de compostos de golpes é determinado utilizando cepas de vírus recombinantes expressando ou vaga-lume (rMV2/Luc) ou Renilla (CHIKV / Ren) luciferase. Figura 4A e 4B mostram curvas representativas de inibição para MV e replicação CHIKV, respectivamente. Estas curvas são utilizadas para determinar valores de IC50 dos compostos de sucesso. Em paralelo, a ausência de toxicidade celular dos compostos seleccionados é confirmada em uma experiência de dose-resposta utilizando o ensaio de viabilidade baseados em luciferase descrito acima (Figura 4C). Tabela 1 mostra os valores de IC50 para a replicação e MV CHIKV em um conjunto de 13 não compostos tóxicos-identificadas a partir de uma biblioteca química de 10.000 moléculas. Estes compoUNDOS são novos, tanto em termos de estrutura química e actividade biológica. Algumas destas moléculas apresentam semelhanças estruturais, e pode ser recolhido em três famílias químicas distintas. Como referência, os valores de IC50 obtidos com brequinar também estão apresentados na Tabela 1. Brequinar é um inibidor de di-hidroorotato-desidrogenase, a quarta enzima da via de biossíntese de pirimidina, com uma potente actividade antiviral in vitro, 30,31. Ao olhar para os valores de IC50, a menos de uma ordem de grandeza separados esta molécula de referência a partir de acertos mais activos identificados por rastreio. Isto estabeleceu a forte actividade antiviral dos compostos seleccionados.
Figura 1. Resumo do gasoduto de triagem. Esquerda painel está mostrando o ptela rimary onde os compostos são selecionados para a falta de toxicidade e capacidade de bloquear a replicação MV. O painel direito mostra o ecrã secundário onde é confirmada a actividade antiviral dos compostos seleccionados, e a sua capacidade para bloquear a replicação CHIKV é determinada. Os compostos que bloqueiam de forma eficiente e MV CHIKV sem qualquer toxicidade significativa são considerados como potenciais inibidores de amplo espectro de vírus RNA. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Organização do genoma do vírus de ARN recombinantes portadores do gene da luciferase. (A) rMV2/Luc: MV-sentido negativo ARN genómico é apresentada com a sua extremidade 3 ', do lado esquerdo, com os seis genesindicado em letras maiúsculas e retratado como retângulos brancos. É inserido o unidades transcricionais codificação adicional para o gene repórter de entre os genes P e M e representado como um rectângulo vermelho (B) CHIKV / Ren:. CHIKV o sentido positivo do genoma de RNA é apresentada com a sua extremidade 5'-tampado, à esquerda, com a leitura aberta que codifica quatro proteínas não-estruturais (NSP1-4). Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. Resultados representativos para um de 96 poços triagem prato. (A) os valores de Luciferase obtidos com o ensaio de viabilidade baseados em luciferase. As colunas 1 e 12 correspondem a controlos alternativos com apenas DMSO ("+"; sem toxicidade) ou IGEPAL ("-"; alta toxi cidade). A cor azul está destacando compostos que são consideradas não tóxicas de acordo com as concentrações de ATP detectados em poços de cultura, enquanto poços brancos correspondem a compostos tóxicos (valores luciferase <12.203 x 10 3). (B) os valores obtidos com as células de luciferase rMV2/Luc-infected. As colunas 1 e 12 correspondem a controlos alternativos, ou seja, as células de HEK-293T não-infectadas ("-") ou células rMV2/Luc-infected tratadas com apenas DMSO ("+"). Para cada composto testado, a figura mostra, tanto o sinal de luminescência da luciferase e da percentagem de inibição em relação aos poços de controlo. Compostos que inibem sinal de luminescência por mais de 75% são realçados em amarelo ou verde, dependendo se eles foram considerados tóxicos ou não, conforme determinado em (A). Assim, cor verde está mostrando compostos de golpes que inibem a replicação MV e não afetam a viabilidade celular.t = "_blank"> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Actividade Figura 4. Dose-resposta antiviral e toxicidade de compostos C864, C648 e C062. (D) As células HEK-293T foram infectadas com estirpe de rMV2/Luc MV expressando a luciferase (MOI = 0,1), e incubaram-se com doses crescentes de C864, C648, C062 ou DMSO sozinho. Após 24 horas, a expressão da luciferase foi determinada. * Indica que a inibição da luciferase observada foi estatisticamente significativa com os três compostos (valores de p <0,05). (B) As células HEK-293T foram infectadas com CHIKV / Ren estirpe de CHIKV expressando a luciferase da Renilla (MOI = 0,2), e incubaram-se com o aumento doses de C864, C648, C062 ou DMSO sozinho. Após 24 horas, Renilla expressão de luciferase foi determinada. * Indica estatisticamenteinibições camente significativas com todos os três compostos (valores de p <0,05). células (C) HEK-293T foram incubados com doses crescentes de C864, C648, C062, ou DMSO por si só. Como um controlo para a toxicidade, as culturas de células foram suplementadas com 2,5 mL de uma solução 0,5% de IGEPAL. Após 24 horas, o número de células vivas foi determinada utilizando o ensaio de viabilidade com base em luciferase. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
| Família química | Composto | MV (IC50 uM) | CHIKV (IC50 uM) | CC50 (uM) |
| 1 | C864 | 0,6 | 0,6 | > 5 |
| 1 | C877 | 0,2 | 0,2 | > 5 |
| 1 | C957 | 1.2 | 1.2 | > 5 |
| 1 | C963 | 1.2 | 0,9 | > 5 |
| 1 | C967 | 1.7 | 1.6 | > 5 |
| 1 | C348 | 0,25 | 0,3 | > 5 |
| 1 | C265 | 0,25 | 0,3 | > 5 |
| 1 | C270 | 0,5 | 0,5 > 5 | |
| 1 | C350 | 0,4 | 0,5 | > 5 |
| 2 | C646 | 0,16 | 0,15 | > 5 |
| 2 | C814 | 1.9 | 1.1 | > 5 |
| 2 | C648 | 0,7 | 0,4 | > 5 |
| 3 | C062 | 1 | 1.2 | > 5 |
| Brequinar | 0,04 | 0,04 | > 5 |
Tabela 1. Actividade antiviral e citotoxicidade dos 13compostos seleccionados a partir da biblioteca química inicial. resultados são expressos como valores de IC50 para a inibição da replicação do MV ou CHIKV. CC50 foram encontrados> 5 M para todos os compostos em experiências de dose-resposta a partir do ecrã secundário. Mas o limiar do filtro de pontuação para citotoxicidade a partir da tela principal sugerem que CC50 são ainda> 20 mM.
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Discussion
O gasoduto triagem descrito aqui tem como objectivo seleccionar compostos com um perfil adequado como inibidores de amplo espectro de vírus RNA. Quando uma biblioteca de 10.000 compostos foi exibido com este protocolo e critérios de filtragem acima referidos foram aplicados, ou seja, a inibição da replicação MV superior a 75%, 40 compostos (0,4%) resultados positivos. Além disso, cerca de metade deles mostraram alguma toxicidade no ensaio de viabilidade com base em luciferase, e foram desconsiderados por este motivo. Finalmente, uma dúzia de visitas prontamente disponíveis em maior quantidade foram novamente testados. Este pequeno conjunto foi facilmente testados novamente para tanto a toxicidade celular e a inibição da replicação viral contra MV e CHIKV em experiências de dose-resposta (Figura 4). A actividade antiviral de todos os compostos seleccionados foi confirmada, e a taxa de sucesso total de identificação para esta conduta de rastreio era de 1,3 ‰. Esta pontuação é muito semelhante aos resultados obtidos por outros grupos com diferentes de alto rendimentotestes de rastreio baseados em replicação para antivirais 27,32, e cai na faixa esperada para baseada em células ensaios fenotípicos em geral (1-5 ‰ 33). No entanto, uma taxa de sucesso é altamente dependente tanto da biblioteca de compostos, que é peneirado e os limites do filtro de pontuação, que pode ser ajustado, dependendo do perfil de dados recolhidos. Aqui, os limiares seleccionados para a inibição da replicação do MV e toxicidade celular foram determinados empiricamente, e trade-off foi ajustado para se obter um número manejável de visitas que pode ser facilmente de novo teste no ecrã secundário contra CHIKV.
No ecrã primário, os compostos foram testados tanto para a sua capacidade de bloquear a replicação do MV e a ausência de toxicidade celular. A actividade antiviral foi determinada a uma concentração de 2 uM em células rMV2/Luc-infected enquanto que a toxicidade celular foi determinada a 20 uM. Essas configurações experimentais foram encontrados valiosos para selecionar diretamente para compostos com alto antiatividade viral em relação à toxicidade celular. Além disso, o ecrã primário foi realizada na presença de uridina. De fato, publicações recentes sugerem que os compostos que visam etapas iniciais de pirimidina via de biossíntese são freqüentemente isolados quando se olha para os inibidores de RNA vírus 13,16,27,28. Em particular, os grupos de pesquisa à procura de moléculas antivirais são encontrados inibidores de di-hidroorotato-desidrogenase, a enzima desta quarta via metabólica 31. Uridina em meio de cultura de forma eficiente trans-complementares para a inibição desta enzima, e assim restaura a replicação viral. Deste modo, compostos que impedem a replicação do MV através da inibição da via de biossíntese de pirimidina são directamente excluídos dos acessos antivirais. Finalmente, o factor-Z'foi encontrado para ser sistematicamente acima de 0,5, o que demonstra a elevada solidez e a qualidade do ensaio.
Em paralelo, a toxicidade celular foi determinada utilizando um alto throughpuensaio à base de luciferase t que determina o número de células metabolicamente activas na cultura com base na quantificação do ATP. Em cada placa de triagem, IGEPAL foi adicionado em poços de controlo de toxicidade. Esta não-desnaturante, detergente não-iónico tem a vantagem de matar eficazmente todos os tipos de células não-especificamente, sem afectar a actividade da enzima luciferase. Z'-fator foi sistematicamente acima de 0,5 mais de 125 placas, demonstrando assim a alta robustez e qualidade do ensaio. Uma limitação deste ensaio de toxicidade celular é o seu custo relativamente elevado. Como um ensaio alternativo para determinar a viabilidade celular, alguns grupos têm utilizado as linhas de células que expressam constitutivamente a luciferase de um transgene estável 34. Em tais ensaios, os compostos tóxicos são esperados para diminuir, ou mesmo suprimir a expressão de luciferase quando afectar a viabilidade celular. Desenvolvemos recentemente uma linha celular estável expressando a luciferase sobre IFN-β estimulação de 35, e esta linha celular foi utilizada para testar um training conjunto de 80 compostos de toxicidade celular. Surpreendentemente, o coeficiente de correlação (CC) entre este ensaio e o ensaio de viabilidade baseados em luciferase acima descrito foi relativamente baixa (CC = 0,67). Com efeito, diversos compostos prejudicada a expressão de luciferase a partir do transgene, enquanto que o metabolismo de ATP não foi afectada. Alguns compostos antivirais de amplo espectro são susceptíveis de afectar as funções celulares, tais como sinalização celular, a transcrição do gene ou a tradução da proteína, que também irá prejudicar a expressão do gene celular. Embora não exista um sistema de triagem perfeito para a viabilidade celular, que está em risco de que a filtragem compostos tóxicos com base na expressão do gene celular irá potencialmente levar a excluir moléculas antivirais bona fide.
A tela secundária visa estabelecer a atividade antiviral de compostos selecionados contra dois vírus RNA completamente alheios, ao determinar com precisão suas IC50s. Curiosamente, deve ser notado que a enzima luciferaseinibidores poderiam ser erradamente marcado como positivos no ensaio de rMV2/Luc mas tais falsos positivos será filtrado-por o ecrã secundário, quando testado para a inibição da CHIKV / Ren. Com efeito, e rMV2/Luc CHIKV / Ren expressar pirilampo e luciferase de Renilla, respectivamente, e estas duas enzimas são independentes e catalisar reacções químicas diferentes. Os compostos que inibem repórter luciferase de vaga-lume de rMV2/Luc na tela principal não vai mostrar qualquer atividade contra CHIKV / Ren e serão descartados, evitando assim a sua selecção errônea como antivirais. Inesperadamente, todos os 13 acessos primários bloqueando a replicação MV também inibiu CHIKV nesta tela secundária. Este não é sempre o caso, como alguns inibidores específicos do MV foram isolados durante o rastreio de outras bibliotecas (dados não mostrados). Além disso, os compostos seleccionados partilham semelhanças estruturais e podem ser agrupados em apenas três famílias químicas (Quadro 1). Os compostos dentro de uma família química provavelmente ter o mesmo modo de acti, e, portanto, pode ser considerado como análogos da mesma entidade química. Isso coloca em perspectiva o fato de que todos os 13 compostos selecionados inibiu as MV e replicação CHIKV. No entanto, estes resultados também poderia sugerir que os antivirais de amplo espectro são mais freqüentemente identificados do que os inibidores específicos do vírus. O racional por trás dessa hipótese é a de que, apesar das especificidades óbvias, todos os vírus de RNA contar com as mesmas funções celulares básicas para replicar, tais como máquinas ribossômica, citoesqueleto ou mitocôndrias como fonte de energia. Estes módulos funcionais são sistemas moleculares complexas, que proporcionam um relativamente grande painel de potenciais alvos para os antivirais de largo espectro. Em contraste, não é apenas um conjunto limitado de fatores virais ou celulares que representam metas adequadas para aumentar os inibidores específicos do vírus. No futuro, novos painéis de antivirais identificadas pela triagem fenotípica deve fornecer os dados necessários para confirmar ou invalidar esta hipótese.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Yves L. Janin por seus comentários e sugestões proveitosas. Gostaríamos de agradecer a HH Gad para CHIK / Ren e C. Combredet pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Pasteur, o Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), o Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), o Institut Carnot - Pasteur Maladies Infecciosas (STING Programa de POV e HM- L), a Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Programa de STING 2,0 a POV), eo "Conseil Régional d'Ile-de-France" (Chemical Projeto Biblioteca, bolsas n ° 06-222 I / R e I 09-1739 / R para HM-L.). O trabalho sobre CHIKV / Ren foi apoiada pelos ArbOAS projeto (concessão ANR 2010-INTB-1601-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-well polystyrene cell culture microplates, white | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity. |
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