نموذج نقص الأكسجين المجاعة لنقص التروية / ضخه في Published: March 11, 2014 doi: 10.3791/51231

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Bruno B. Queliconi¹, Alicia J. Kowaltowski¹, Keith Nehrke²

¹Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, ²Department of Medicine, Nephrology Division, University of Rochester Medical Center, School of Medicine and Dentistry

Summary

يوصف بروتوكول يستخدم نقص الأكسجين / المجاعة في C. ايليجانس لنموذج نقص التروية / ضخه. وتشمل النتائج الفنية زيادة معدل الوفيات، تشوهات واضحة في العمليات العصبية GFP المسمى، وضعف الاستجابات السلوكية التي تتطلب وظيفة الخلايا العصبية.

Abstract

بروتوكولات لنقص الأكسجين / المجاعة في الجينية النموذج الحي C. ايليجانس محاكاة نقص التروية / ضخه. يتم فصل الديدان من المواد الغذائية البكتيرية وضعت تحت نقص الأكسجين لمدة 20 ساعة (نقص التروية محاكاة)، وبعد ذلك انتقلت إلى أجواء طبيعية مع الغذاء (ضخه محاكاة). يتم عرض هذه النتائج النموذج التجريبي في زيادة الوفيات والأضرار العصبية، وتقنيات لتقييم الجدوى الحي، تعديلات على التشكل من العمليات العصبية التي تعمل باللمس، فضلا عن حساسية اللمس، والذي يمثل الناتج السلوكية وظيفة الخلايا العصبية. أخيرا، وصفت طريقة لبناء حاضنات ميتة باستخدام حاويات تخزين المطبخ المشترك. إضافة وحدة التحكم في التدفق الجماعي يسمح للتعديلات المطلوب ادخالها على خليط الغاز في حاضنات مخصصة، وحمام مائي تعميم يسمح لكلا التحكم في درجة الحرارة ويجعل من السهل التعرف على تسرب. وهذه الطريقة توفر بديلا منخفض التكلفة لأسس تجاريةالوحدات المتاحة.

Introduction

C. ايليجانس هو الخيطية التي اعتمد على نطاق واسع متعددة الخلايا حقيقية النواة النموذج الحي منذ بدء العمل به من قبل برينر ^1. بل هو، نموذج بسيط، وتنوعا رخيصة، والذي يسمح روابط سهلة بين تغيرات جينية والمظهري يتغير ^2.

يتميز نقص التروية بسبب نقص المواد الغذائية والأوكسجين إلى الأنسجة، تليها ضخه، وعندما يتم إنتاج وابلا من أنواع الاكسجين التفاعلية ⁽³⁾ ومعظم الضرر يحدث. في عام 2002، وهذا نموذج من نقص التروية / ضخه (IR) في C. وقد وضعت ايليجانس ⁴ تنطوي على تقديم دودة كاملة لنقص الأكسجين، والحرمان من المواد الغذائية والإجهاد الحراري لحوالي 20 ساعة تليها 24 ساعة في ظل ظروف طبيعية. على الرغم من أن هذا النموذج من الناحية التقنية لنقص الأكسجين المجاعة (AS) حالة، يحدث موت الخلايا من خلال الآليات التي يتم حفظها في الثدييات، بما في ذلك الضرر الناجم عن الأكسدة خلال ضخه <سوب> 5. وعلاوة على ذلك، على غرار الثدييات الأشعة تحت الحمراء، والضرر الناجم عن AS في C. ايليجانس يمكن منعها من خلال شروط مسبقة الدماغية ^6،7 أو ^8،9 مخدر شروط مسبقة.

شرح بروتوكولات أدناه كيفية تقليد IR في C. ايليجانس باستخدام نموذج AS، وكيفية تسجيل الشذوذات الشكلية والسلوكية التي تنتج عن AS، وكيفية التكيف مع البروتوكول بطريقة تسمح التجربة التي ستجرى مع الاستثمار الأولي أقل باستخدام حسب الطلب، شيدت بسهولة بديلة الغرفة .

Protocol

1. C. ايليجانس النمو

1. إعداد 35 ملم وسائط النمو الخيطية (NGM) لوحات أجار المصنف مع البكتيريا OP50، وفقا لأساليب زراعة القياسية ^1.
2. مزامنة C. ايليجانس عن طريق وضع 6 البالغين حامل على لوحة NGM المصنفة. إزالة الكبار بعد أن وضعت 100 بيضة ~ (~ ساعة 3).
3. احتضان لوحات لمدة 3 أيام في 20 درجة مئوية، وعند هذه النقطة تكون قد وضعت الديدان إلى مرحلة الشباب والكبار هي الأمثل لهذه التجربة. بروتوكولات بديلة لمزامنة C. موصوفة ايليجانس مكان آخر ^10.

2. المواد اللازمة لAS

1. العازلة M9 (22 ملي KH ₂ PO _4، 42 ملي نا ₂ هبو _4، 86 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم MgSO ₄₎ ينبغي تطهير من الأوكسجين من قبل توازنه مع N ₂ (الأرجون يمكن أن تستخدم أيضا) خلال 30 دقيقة قبل التجربة وأبقى محاطة الجليد.
2. جعل ثقب صغير (3 ملمواسعة) في غطاء من 1.5 مل أنابيب microcentrifuge التي سيتم وضعها الديدان خلال AS. ثقب يسمح لتبادل الغاز دون الحفاظ على الغطاء مفتوحا، وهذا يمكن أن يؤدي إلى التبخر وسائل الإعلام المفرطة.

3. نقص الأكسجين / المجاعة

1. إجراء جميع التجارب على الأقل في ثلاث نسخ.
2. إضافة 1 مل من RT، العازلة M9 المؤكسج إلى كل لوحة تحتوي على 35 مم الديدان الشباب البالغين نمت كما هو موضح أعلاه. توخي الحذر لتجنب إزالة البكتيريا من لوحة (M9 إضافة إلى حواف حيث لم المصنفة البكتيريا). بعد ~ 1 دقيقة الديدان ينبغي أن السباحة في M9.
3. معطف غيض ماصة 1 مل مع BSA من قبل pipetting وطرد العقيمة 1٪ حل جيش صرب البوسنة.
4. انحدر بعناية لوحة تحتوي على الديدان في M9 العازلة، وإزالة M9 من نفس المكان الذي تم إضافته، ووضع معلق في أنابيب microcentrifuge المعدة. اسمحوا الباقي في الجليد حتى انخفضت الديدان إلى أسفل أنابيب (~ 1-2 دقيقة).
5. إزالة أكبر قدر ممكن من M9 ممكن من دون إزعاج الديدان من الأنبوب (ترك حوالي 100 ميكرولتر)، إضافة 1 مل من M9 ومثلج-تطهير الأوكسجين ووضع أنبوب على الجليد حتى الديدان تستقر في قاع مرة أخرى. تكرار الخطوة الأخيرة 3X. في غسل الماضي، وإزالة M9 حتى يبقى ~ 100 ميكرولتر في الأنبوب.
6. وضع أنابيب مع الديدان في M9 غير المؤكسج داخل غرفة نقص الأكسجين / ميتة (انظر تعليمات أدناه، القسم 3.6.1) أو، بدلا من ذلك، في وعاء مخصص مختومة (انظر تعليمات أدناه، القسم 3.6.2).
   1. إذا كان نقص الأكسجين / ميتة الغرفة التجارية لاستخدامه، وترك بعض تطهير M9 داخل الغرفة قبل البدء الخطوة 3.5 و 3.5 كرر الخطوة مرة واحدة الديدان الموجودة داخل الغرفة.
   2. إذا غرفة مخصصة لاستخدامه، وتقدم وصفا مفصلا لكيفية إنشاء جهاز منخفضة التكلفة في نهاية هذا البروتوكول ولقد وصفت من قبل مجموعة أخرى سابقا ^11. باختصار: جعل اثنين من الثقوب في غطاء 250 مل تثبرور من نوع الحاويات وإضافة وصلات أنبوب لهم. وسوف تستخدم واحدة لحقن خليط الغاز في حين أن الآخر سوف يكون خروج الغاز في حمام مائي.
   3. وضع الديدان في غرفة وختم الغرفة باستخدام غطاء.
   4. الغاز مع ثابت N ₂ تدفق (100 مل / دقيقة).
   5. وضع الحاويات داخل حمام الماء عند 26 درجة مئوية. تأكد من أن أنبوب الخروج مغمورة جيدا في الماء حتى لا يعود الهواء وأن هناك أي تسرب في نظام (واضح من قبل فقاعات الناشئة من الغرفة نفسها).

احتضان الديدان في 26 درجة مئوية لمدة 20 ساعة.

4. إعادة إشباع الخلايا محاكاة

1. بعد 20 ساعة تحت ظروف AS، وإزالة أنابيب من غرفة الحضانة في هواء الغرفة.
2. ماصة C. ايليجانس مع طرف BSA المغلفة (كما في الخطوة 3.3) على أحد OP50 المصنفة 35 ملم NGM وحة. احتضان لوحات عند 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.بعد هذا، فإن الديدان تكون جاهزة للسجل.

5. تحديد الميت مقابل لايف الديدان

1. باستخدام معول البلاتين، مسة خفيفة الجزء العلوي من رأس الدودة. سوف الديدان الحية تتحرك إلى الوراء بعد أن لمسها. إذا كانت الديدان هي مستجيبة، يسجل في عداد الموتى. في بعض الأحيان، ودودة لا تتحرك إلى الوراء، ولكن قد يحمل حركة طفيفة الرأس جنبا إلى جنب. وإن لم يكن ميتا من الناحية الفنية، وهذه الديدان من شبه المؤكد أن تنتهي في غضون ساعات، وينبغي وسجل في عداد الموتى. إذا كان أحد ينتظر وقتا طويلا ليسجل الديدان، ويمكن أن يحدث الفقس الداخلية للذرية ويمكن لهذه "أكياس من بين الديدان" تمزق، مما يجعل الكشف عن جثث صعبة للغاية.
2. إزالة كل الديدان الحية والميتة من لوحة كما أنها تحسب لتجنب اتهامات مكررة. يمكن نقل الديدان الحية إلى لوحة منفصلة لأداء المقايسات السلوكية. ويمثل المبلغ من الديدان تعيش نسبة إلى مجموع باسم٪ من الديدان على قيد الحياة (الشكل 1A

6. تلمس الفحص الاستجابة

1. وقد قدم وصفا مفصلا لهذا البروتوكول في هارت، آن C.، أد. السلوك (3 يوليو 2006)، WormBook، أد. وC. ايليجانس البحوث المجتمعية، WormBook، doi/10.1895/wormbook.1.87.1، http://www.wormbook.org.
   1. للتسجيل للاستجابة اللمس، وتحديد الديدان التي تتحرك بخفة وتلمس الجانب من الرأس والدودة (بالقرب من الجزء الأوسط من البلعوم) مع اختيار رمش (الشكل 3).
   2. إذا تحرك الدودة إلى الخلف، والنتيجة كما تستجيب، إن لم يكن، والنتيجة كما مستجيبة (الشكل 1B). كرر هذه الخطوة 10-15X لكل دودة مع 10 فترات ثانية. بحث لا يقل عن 10 الديدان في كل مجموعة لديها بيانات دقيقة. نفس الفحص يمكن استخدامها لتقييم التغيرات إلى الأمام الحركي التالية مسة خفيفة لجدار الجسم الخلفي. تأكد من عدم لمس الرأس أو الذيل من دودة، لأن هذا يحفز سلوك متميزة.
   3. أخيرا، فيسلالات السيطرة الوراثية الشركات [N2 بريستول البرية من نوع لإيجابية، MEC (ميكانيكية حسية) متحولة لالسلبية - على سبيل المثال CB1338 MEC-3 (e1338) رابعا] لمعايرة القوة التي للمس الديدان. قاسية جدا لتحفيز واستثارة استجابة السلوكية في المسوخ MEC، والقليل جدا لا تثير لها تأثير في الضوابط N2 wildtype.

7. العصبية التعديلات

1. لتصور آخر AS التعديلات العصبية، واستخدام الضغط الذي يعبر عن GFP في الخلايا العصبية MEC-الاستجابة التي تعمل باللمس ^4،5. هذه الخلايا العصبية لديها عمليات طويلة التي تعمل على طول جدار الجسم ويسجل الهدف بسهولة لتشوهات شكلية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون متكاملة مع المعلومات المورفولوجي التدابير السلوكية وظيفة الخلايا العصبية، كما هو موضح أعلاه. سلالة واحدة والتي يمكن استخدامها لهذا الغرض هو TU2583، والذي يتوفر من C. مركز علم الوراثة ايليجانس ويحتوي على uIs25 متكاملة التحوير معربا عن GFP جيئة وذهابام المروج MEC-18، أو بدلا من ذلك TU2562، والذي يحتوي على متكاملة MEC-3 :: GFP الانصهار.
2. إعداد لوحة الاغاروز.
   1. تذوب 2٪ الاغاروز في المياه، وجلب ل1x أخرى M9 مع مخزون 10X، والحفاظ على الحل عند 70 درجة مئوية.
   2. وضع قطرة (~ 20 ميكرولتر) من هذا الحل على شريحة زجاجية (25 ملم × 75 ملم) التي تم وضعها بين اثنين من الشرائح الأخرى، كل واحدة منها لديها قطعة واحدة من الشريط الى جانبهم السفلي.
   3. وضع شريحة زجاجية النهائي عمودي على الأول على رأس الحل الاغاروز 2٪، واتركها تبرد في RT. هذا ينبغي أن تشكل وسادة هذا هو سمك الشريط.
   4. إزالة الشريحة العليا وإضافة 10 ميكرولتر من M9 تحتوي على 0.1٪ تتراميزول، والتي سوف شل الديدان.
3. نقل بعض (~ 10) الديدان تعيش على 2٪ الاغاروز الشريحة. وضع ساترة عليها وتصور GFP باستخدام المجهر مضان تحت الهدف 100X مع الإضاءة المناسبة.
4. التالفةسوف تظهر الخلايا العصبية سلسلة عصاري خلوي غشاء نمط اللؤلؤ في العمليات، وتتألف من تنقط متعددة (الشكل 2A)، و / أو شذوذ حيث يبدو أن كسر (الشكل 2B) العمليات. عد تنقط وتشوهات في كل من الخلايا العصبية لكل دودة، وذلك باستخدام ما مجموعه 10 على الأقل الديدان.

8. صنع مختبر غرفة ميتة

1. A-نمط تثبرور، قابل للغلق، عاء محكم يمكن التحديثية باعتبارها غرفة نقص الأكسجين. الحرص على تحديد الحاويات التي هي صغيرة قدر الإمكان. وعاء صغير يخلق بيئة ميتة أسرع وأسهل لتناسب في حمام الماء (الشكل 4).
2. جعل اثنين من الثقوب على غطاء (يمكن القيام به مع مفك البراغي أو عن طريق تسخين ملقط واضطر في غطاء) وإدراج موصل البلاستيك أو المعدن الذي يناسب الأنابيب (الشكل 5A). استخدام الغراء التي يمكن وضعها تحت الماء، وأيضا يحصل الثابت بعد التجفيف، وتجنب حركةموصل، وبالتالي الحد من إمكانية تسرب (الشكل 5B).
3. يجب وضع الحاوية في حمام مائي بحيث يتم مغمورة تماما (الشكل 4). أن تزج الحاوية، استخدم زجاجة الوزن أو الوزن الغوص.
4. وسوف تستخدم واحدة من وصلات أنبوب لإدخال خليط الغاز وسوف أنبوب الأخرى بمثابة تخفيف الضغط، وبالتالي فإنه ينبغي أن يترك تحت الماء بحيث يتم ختم الحاويات الخروج من البيئة الخارجية (الشكل 4).
5. تكوين الهواء يمكن التضمين باستخدام الغاز العرف، وحدات تحكم تدفق الشامل أو أي جهاز الذي يمزج الغازات المطلوب. يجب السيطرة على تدفق الغاز، وتدفق عالية يمكن أن تخلق التبخر المفرط. على سبيل المثال، في وعاء مل 250، و100 مل / دقيقة من الغاز توفير مساحة جيدة للديدان وتدفق مناسبة.
6. يجب أن تبقى طول الأنبوب إلى الحد الأدنى، كما أنها يمكن أن تكون قابلة للاختراق إلى الغاز، والنماذج التالية مدخل O _2. من المهم تجنب استخدام السيليكون، Tygon أنابيب لأن هذه المواد هي منفذة لتبادل الغازات. نحن نفضل البولي بروبلين أو النايلون الأنابيب. الزجاج أو أنابيب معدنية حفاظ على الغازات بشكل جيد، ولكن أيضا من الصعب التعامل معها.

Representative Results

إخضاع C. ايليجانس إلى 20 ساعة من AS في 26 درجة مئوية في صنع مختبر غرفة الحضانة المخصصة كما أدى صفها (القسم 3.6.2) في وفيات كبيرة (الشكل 1A) ^5. التصوير الفلورسنت اللاحقة تنقط وفواصل في GFP المسمى العمليات العصبية من الناجين أكدت وجود شذوذ المورفولوجية (الشكل 2). كما وردت الناجين سيئة لمسة خفيفة جدار الجسم (الشكل 1B). وقد استخدم هذا النموذج من قبل مجموعات متعددة لدراسة كيفية الاستعداد الوراثي، والتدخل الصيدلانية، واللدونة التمثيل الغذائي يؤثر على نتائج AS تعتمد ^{4-6،8،9،12،13.}

الشكل 1. C. ايليجانس البقاء واستجابة لمسة بعدAS. A) نسبة الديدان التي تظهر 24 ساعة بعد AS البقاء على قيد الحياة. سلالة N2 هي الخلفية الوراثية النوع البري، وKWN85 يحتوي على التحوير المتكاملة التي تصف الخلايا العصبية MEC مع GFP. ب) الاستجابة للمس من المحفزات C. يعيشون ايليجانس (N2 سلالة) بعد AS. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. تم رصد الخلايا العصبية بعد لمس التعديلات AS. الخلايا العصبية التي تعمل باللمس (PLML وPLMR) تشوهات مثل عمليات مضنية وفواصل (A) أو تراكم الركام GFP في عمليات (B) في قيد الحياة تخدير C. eleg الجواب بعد AS.

الرقم 3. اختيار رمش. معول رمش تجميعها. في أقحم، والتفاصيل من رمش لصقها على الخشب مسواك.

الشكل 4. غرفة ميتة داخل حمام مائي من صنع المختبر. حاوية مغلقة على استعداد لبدء التجربة. تبين الأسهم مدخل الغاز والخروج ووزن زجاجة تستخدم لمنعها من العائمة.

231fig5.jpg "/>
الرقم 5. تفاصيل الجانب الداخلي والخارجي للغطاء الحاوية. أ) الجانب الخارجي للغطاء حاوية، مما يدل على أنبوب موصل والتي تعلق على التي سبق حفرة. ب) الجانب الخارجي للغطاء حاوية، مما يدل على موصل أنبوب تعلق على ثقب التي سبق.

Discussion

AS قد استخدمت على نطاق واسع في C. ايليجانس لنموذج إصابة الأشعة تحت الحمراء. وينبغي إبراز بعض النقاط الرئيسية لهذا البروتوكول: C. ايليجانس هي مقاومة للمجموعة واسعة من الإصابات، التي تبرر الحاجة لمدة 3 الشتائم يصاحب ذلك (الحرارة والجوع ونقص الأكسجين) لتحقيق الموت باستخدام هذا النظام. نقص الأكسجين وحده لا يقتل الديدان في هذا الإطار من الوقت ^14. علاوة على ذلك، ارتفاع درجة الحرارة هو الإجهاد إضافية، لذلك من المهم أن ترصد عن كثب. بالمعنى الدقيق للكلمة، لا يسهم المجاعة إلى حد كبير في درجة وفيات وحظ ^7، في حد ذاتها، ولكن يبدو للحد من التباين بين مكررات التجريبية. بالنظر إلى أن يمكن أن يكون هناك تباين كبير من يوم إلى يوم، من المهم للغاية لمقارنة عينات تشغيلها مباشرة في موازاة ذلك، وتكرار التجارب على مدى عدة أيام. بشكل عام، يتم قياس النتائج لمدة ثلاث لوحات منفصلة من 50-100 الديدان / حالة تجريبية وهذه هين المتوسط ​​ويعتبر تكرار التجريبية واحد. عموما، تظهر ما بين سبعة وتسعة مكررات أن تكون كافية لتحقيق أو استبعاد دلالة إحصائية.

تحتاج المرحلة التنموية من الديدان التي استخدمت في التجربة أيضا أن يتم رصدها بعناية كما قابلية مراحل مختلفة لAS الضرر يختلف اختلافا كبيرا ^15،16. استخدام الشباب هو المعيار، وتظهر مرحلة اليرقات (L3 L4 و) الديدان لتكون أكثر قدرة على مقاومة الآثار الضارة للAS (بيانات غير منشورة).

ويعرض هذا البروتوكول طريقتان لإجراء التجارب، واحد باستخدام جهاز من صنع مختبر (باستخدام تثبرور من نوع الحاويات وإدخال الغاز ¹¹⁾ وغيرها باستخدام غرفة ميتة التجارية ^4،6. لا يمكن أن يتحقق بوسائل أخرى نقص الأكسجين التي تستهلك الأوكسجين، كما هو موضح في أماكن أخرى ^13،17. استخدام تقنيات بديلة لخلق بيئة ميتة قد تغيير الوقت AS الحضانة اللازمةلإنشاء المبلغ المطلوب من الموت. استهداف بقاء ~ 20٪ هو نقطة انطلاق مثالية لدراسة تدخلات وقائية، في حين أن 80٪ مثالية بالمثل لالتدخلات التي تؤدي إلى تفاقم الآثار الضارة للAS. تحذير هام آخر هو الوقت الذي عشرات القتلى مراقب الديدان / على قيد الحياة. إذا تم تمديد الوقت لتحليل ما وراء مدار 24 ساعة، قد تكون البيانات مضللة منذ الديدان الميتة يصبح من الصعب على نحو متزايد لتحديد. قد يكون هذا بسبب جثث دودة تصبح شفافة نسبيا مع مرور الوقت، ولكن أيضا إلى حقيقة أن الأجنة المخصبة يمكن أن تتطور إلى ذرية بعد الوفاة داخل أطر وتعطيل لهم لأنها تظهر.

يمكن تعديل تحليل مورفولوجيا الخلايا العصبية للنظر في أنماط التعبير البروتين ^18، تجزئة النووية ⁽⁴⁾ وغيرها من المعالم ¹⁹ عن طريق استبدال سلالة دودة التي تعبر عن المناسبة علامة المشفرة وراثيا. واحد التحذير النهائي هو أن التصور للالعمليات العصبية ينبغي القيام به أقل من 30 دقيقة بعد وضع الديدان على الشريحة. أبقى حيوانات تحت التخدير على الشرائح لفترات أطول يمكن أن يحمل الضرر AS-مستقلة. ضبط كمية من الحيوانات لكل شريحة وفقا للوقت اللازم لتتبع وتحليلها.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2  strain	CGC		Wild type strain. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)	CGC	TU2583	integrated fluorescent transgene used to label touch neurons. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
CB1338 mec-3 (e1338)IV	CGC	CB1338	canonical mec-3 mutant that is touch insensitive. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
Microcentrifuge Tube	Eppendorf	0030 120.086
Nikon Eclipse TE2000-U Microscope	Nikon USA	TE2000-U
Low Temperature Incubator	Sheldon Manufacturing Inc.	Model 2005
Eyelash Pick			An eyelash pick can be prepared by attaching  an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3).
Hypoxic Chamber	Coy	8307030	Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.