En Anoksi-sult Modell for iskemi / Reperfusjon i Published: March 11, 2014 doi: 10.3791/51231

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Bruno B. Queliconi¹, Alicia J. Kowaltowski¹, Keith Nehrke²

¹Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, ²Department of Medicine, Nephrology Division, University of Rochester Medical Center, School of Medicine and Dentistry

Summary

En protokoll er beskrevet som bruker anoksi / sult i C. elegans å modellere iskemi / reperfusjon. Funksjonelle utfall inkluderer økt dødelighet, synlige misdannelser i GFP-merket nevronale prosesser, og nedskrevne atferdsmessige reaksjoner som krever nervecellefunksjon.

Abstract

Protokoller for anoksi / sult i de genetiske modellorganisme C. elegans simulere iskemi / reperfusjon. Worms separeres fra bakteriell mat og plassert under anoxia i 20 timer (simulert ischemi), og deretter flyttet til en normal atmosfære med mat (simulert reperfusjon). Denne eksperimentelle paradigme resulterer i økt død og neuronal skade, og teknikkene er presentert for å vurdere levedyktigheten til organisme, endringer i morfologien av berøring neuron prosesser, så vel som berøringsfølsomheten, som representerer de atferdsmessige utgangs av neuronal funksjon. Til slutt blir en fremgangsmåte for å konstruere hypoksiske inkubatorer ved hjelp av vanlig kjøkkenoppbevaringsbeholdere beskrevet. Tilsetningen av en massestrømningsstyreenhet tillater endringer som skal gjøres til gassblandingen i spesial inkubatorer, og et sirkulerende vannbad tillater både temperaturkontroll og gjør det lett å identifisere lekkasjer. Denne metoden gir et rimelig alternativ til kommersielttilgjengelige enheter.

Introduction

C. elegans er en nematode som har vært i omfattende bruk som en flercellet eukaryote modellorganisme siden introduksjonen av Brenner ^en. Det er en billig, enkel og allsidig modell, som tillater enkel koblinger mellom genetiske forandringer og fenotypiske endringer ^to.

Iskemi er kjennetegnet ved en mangel på næringsstoffer og oksygen til et vev, etterfulgt av reperfusjon, når en serie av reaktive oksygenforbindelser fremstilles ³ og mesteparten av skaden oppstår. I 2002 ble en modell av ischemi / reperfusjon (IR) i C. elegans ble utviklet ^fire involverer sende hele ormen til anoksi, næringsmangel og varmestress for ca 20 timer etterfulgt av 24 timer under normale forhold. Selv om denne modellen er teknisk sett en anoksi-sult (AS) tilstand, oppstår celledød gjennom mekanismer som er konservert hos pattedyr, inkludert skade indusert av oksidanter under reperfusjon <sup>. 5 Videre, i likhet med pattedyr IR, skade indusert av AS i C. elegans kan forebygges ved iskemisk prekondisjonering ^6,7 eller bedøvende prekondisjonering ^8,9.

Protokollene nedenfor demonstrerer hvordan å etterligne IR i C. elegans bruker AS-modellen, hvordan å score morfologiske og atferdsmessige forandringer som følge av AS, og hvordan man skal tilpasse protokollen på en måte som gjør at forsøket skal gjennomføres med en lavere initiell investering ved hjelp av en skreddersydd, lett-bygget kammer alternativ .

Protocol

En. C. elegans Vekst

1. Forbered 35 mm nematode vekstmedier (NGM) agar plater seeded med OP50 bakterier, som per standard dyrkingsmetoder ^en.
2. Synkron C. elegans ved å plassere seks av gravid voksne på en seeded NGM plate. Fjern de voksne etter ~ 100 egg har blitt lagt (~ 3 timer).
3. Inkuber platene for tre dager ved 20 ° C, noe som medførte at ormer vil ha utviklet til unge voksne stadiet og er optimale for dette eksperimentet. Alternative protokoller for å synkronisere C. elegans er beskrevet andre steder ^10.

2. Materialer for AS

1. M9 buffer (22 mM KH PO _{2 4} og 42 mM Na HPO _{2 4,} 86 mM NaCl, 1 mM MgSO ₄₎ bør være renset for oksygen ved ekvilibrering med N ₂ (argon kan også anvendes) i 30 min før forsøket og holdt omgitt av is.
2. Lag et lite hull (3 mmbred) i lokket på 1,5 ml mikrosentrifugerør i hvilken ormer vil bli plassert under AS. Hullet muliggjør gassutveksling uten å holde lokket åpent, da dette kan føre til overdreven media fordampning.

Tre. Anoksi / Sult

1. Gjennomføre alle forsøkene i hvert fall i triplikat.
2. Tilsett 1 ml av RT, oksygenert M9 buffer til hver 35 mm plate innehold unge voksne ormer dyrket som beskrevet ovenfor. Vær forsiktig for å unngå å fjerne bakterier fra platen (legg M9 til kantene hvor bakterier ikke ble seeded). Etter ~ 1 min ormer bør være svømming i M9.
3. Coat en 1 ml pipette spissen med BSA ved pipettering og utvise en steril 1% BSA løsning.
4. Helle forsiktig plate som inneholder ormer i M9 buffer, fjerne M9 fra samme sted der den ble lagt, og plasser suspensjon i oppkjørte mikrosentrifugerør. Let hvile i is inntil ormer har falt ned til bunnen av rørene (~ 1-2 Min).
5. Fjern den maksimale mengden av M9 mulig uten å forstyrre de ormer fra røret (forlater rundt 100 ul), tilsett 1 ml av den oksygen renset og avkjølt M9 og plassere røret over is inntil ormer faller til bunnen igjen. Gjenta det siste trinnet 3x. I siste vask, fjerner M9 til ~ 100 ul forblir i røret.
6. Plasser rørene med ormer i deoxygenated M9 inni en anoksisk / hypoksisk kammer (se instruksjonene nedenfor, avsnitt 3.6.1) eller, alternativt, til en tilpasset forseglet container (se instruksjoner nedenfor, punkt 3.6.2).
   1. Ved en kommersiell anoksisk / hypoksisk kammer skal brukes, lar noen gjennomspylt M9 inne i kammeret før trinn 3.5 og gjenta trinn 3.5 når ormer er inne i kammeret.
   2. Ved en tilpasset kammeret skal benyttes, er en detaljert beskrivelse av hvordan man skal lage en rimelig anordning presentert ved utgangen av denne protokollen, og har blitt beskrevet av en annen gruppe som tidligere ^11. Kort: Lag to hull i en 250 ml Tupperware-type container lokk og legge rørforbindelser til dem. Man vil bli brukt til å injisere gassblandingen mens den andre vil være gass utgang inn i et vannbad.
   3. Plasser ormer inn i kammeret og forsegle kammeret ved hjelp av lokket.
   4. Gass med en konstant _N2-strøm (100 ml / min).
   5. Plasser beholderen inne i et vannbad ved 26 ° C. Forsikre deg om at exit røret er godt nedsenket i vann slik at ingen luft tilbake og at det ikke er noen lekkasjer i systemet (åpenbart av bobler som oppstår fra selve kammeret).

Inkuber ormer ved 26 ° C i 20 timer.

4. Simulert Reperfusjon

1. Etter 20 timer under AS forhold, fjerne rørene fra inkubasjonstiden kammeret i romluften.
2. Pipette C. elegans med en BSA-belagt tips (som i trinn 3.3) på en OP50 seeded 35 mm NGM plate. Inkuber platene ved 20 ° C i 24 timer.Etter dette, vil ormer være klar til å bli scoret.

5. Identifisere Døde Versus levende ormer

1. Ved hjelp av en platina plukke, så vidt berører toppen av hodet av ormen. Levende ormer vil bevege seg bakover etter å ha blitt berørt. Hvis ormer er nonresponsive, score som død. Av og til vil en orm ikke bevege seg bakover, men kan oppvise en svak side-til-side-bevegelse av hodet. Selv om det teknisk døde, disse ormene er nesten sikker på å utløpe i løpet av timer, og bør dømmes som døde. Hvis man venter for lenge med å score ormer, kan intern klekking av avkom oppstå og disse "poser-av-ormer" kan sprekke, noe som gjør oppdage skrottene svært vanskelig.
2. Fjern både levende og døde ormer fra platen som de er regnet for å unngå dupliserte tellinger. De levende ormer kan flyttes til en separat plate for å utføre atferdstester. Mengden av levende ormer i forhold til den totale representeres som% overlevende ormer (figur 1A

6. Touch Response analysen

1. En detaljert beskrivelse av denne protokollen har blitt presentert i Hart, Anne C., red. Behavior (3 juli 2006), WormBook, red. The C. elegans Forskning Samfunn, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
   1. Å score for anslagsfølsomhet, identifisere ormer som beveger seg og forsiktig inntil siden av ormen hode (nær den midtre delen av svelget) med en øyenvippe pick (figur 3).
   2. Hvis ormen beveger seg bakover, score så forståelsesfull, hvis ikke, score så nonresponsive (Figur 1B). Gjenta dette trinnet 10-15x for hver orm med 10 sek intervaller. Probe minst 10 ormer i hver gruppe for å ha nøyaktige data. Den samme analysen kan brukes til å vurdere frem motorisk forandringer etter lett trykk til den bakre kroppsveggen. Pass på ikke å røre på hodet eller halen av ormen, siden dette stimulerer en distinkt oppførsel.
   3. Til slutt, ibedriftens genetiske kontrollstammer [N2 Bristol villtype for positiv, mec (mechanosensory) mutant for negativ - f.eks CB1338 mec-3 (e1338) IV] for å kalibrere den styrke som å ta på ormer. For harde for en stimulering vil lokke fram en atferdsrespons i mec mutanter, for lite vil ikke framprovosere en effekt i villtype N2 kontroller.

7. Neuronal Modifikasjoner

1. For å visualisere innlegget AS nevrale endringer, bruker en belastning som uttrykker GFP i berøringsende mec nevroner ^4,5. Disse nervecellene har lange prosesser som kjører langs kroppen veggen og er enkelt mål for morfologiske abnormaliteter. I tillegg kan morfologisk informasjon bli integrert med atferdsmessige målinger av neuronal funksjon, som beskrevet ovenfor. En stamme som kan brukes for dette formål er TU2583, som er tilgjengelige fra C. elegans Genetics Center og inneholder uIs25 integrert transgenet uttrykker GFP from den mec-18 promoter, eller alternativt TU2562, som inneholder en integrert mec-3 :: GFP fusjon.
2. Forbered en agarose pad.
   1. Smelt 2% agarose i vann, bringe til 1 x M9 med et 10x lager, og opprettholde oppløsningen ved 70 ° C.
   2. Plasser en dråpe (ca. 20 pl) av denne oppløsning på et objektglass (25 mm x 75 mm) som er blitt plassert mellom to andre sider, som hver har et enkelt stykke av båndet på sin underside.
   3. Plasser en endelig objektglass vinkelrett på den første på toppen av 2% agarose-løsning, og la den avkjøles til RT. Dette skal danne en pute som er tykkelsen av båndet.
   4. Fjern den øverste lysbilde og tilsett 10 mL av M9 som inneholder 0,1% Tetramisole, noe som vil bremse den ormer.
3. Flytte noen (~ 10) lever ormer på 2% agarose lysbilde. Plasser et dekkglass over dem og visualisere GFP bruke en fluorescens mikroskop under et 100X objektiv med riktig belysning.
4. Skadetnevroner viser en cytosoliske membran streng av perler mønster i prosessene, som består av multiple punctum (figur 2A), og / eller abnormaliteter hvor prosessene synes å være brutt (fig. 2B). Count Punctum og misdannelser i både nerveceller for hver orm, ved hjelp av en total på minst 10 ormer.

8. Lab-laget Hypoksisk Chamber

1. En Tupperware-stil, lukkbar, lufttett beholder kan ettermontere som en anoksisk kammer. Pass på å velge en beholder som er så liten som mulig. En liten beholder skaper et hypoksisk miljø raskere og lettere å passe inn i vannbadet (figur 4).
2. Lag to hull på lokket (kan gjøres med en skrutrekker eller ved oppvarming tang og tvang i lokket) og sett en plast eller metall-kontakt som passer slangen (figur 5A). Bruk lim som kan plasseres under vann, og også blir hard etter tørking, å unngå bevegelse avpluggen og dermed reduserer muligheten for lekkasje (figur 5B).
3. Beholderen som skal settes inn i vannbadet, slik at den er neddykket fullstendig (figur 4). Å fordype beholderen, bruk en flaske vekt eller en dykker vekt.
4. En av de rør-forbindelser vil bli brukt til å innføre en gassblanding og det andre røret vil virke som en trykkavlastning, derav det bør stå under vann, slik at beholderen er forseglet fra det ytre miljø (figur 4).
5. Luften Sammensetningen kan moduleres ved hjelp av spesiallaget gass, massestrøm kontrollere, eller en hvilken som helst anordning som blander de ønskede gasser. Gasstrømmen bør være kontrollert, så høy strømning kan skape overdreven fordampning. For eksempel, i en 250 ml beholder, vil på 100 ml / min av gass gir god plass for ormer og et egnet flussmiddel.
6. Lengden av røret bør holdes på et minimum, da de kan være gjennomtrengelig for gass, etllowing inngangen av O _2. Det er viktig å unngå bruk av silikon, Tygon rør, da disse materialer er gjennomtrengelig for gassutveksling. Vi foretrekker polypropylen eller nylon rør. Glass-eller metallrør opprett gassene også, men er også vanskeligere å arbeide med.

Representative Results

Utsette C. elegans til 20 timer av AS ved 26 ° C i en tilpasset lab-laget inkubasjon kammer som beskrevet (punkt 3.6.2) resulterte i betydelig dødelighet (figur 1A) ^5. Etterfølgende fluorescerende avbildning av Punctum og pauser i GFP merket nevronale prosesser av overlevende bekreftet tilstedeværelsen av morfologiske abnormaliteter (figur 2). De overlevende også reagert dårlig på lys kroppen veggen touch (Figur 1B). Denne modellen har blitt brukt av flere grupper for å studere hvordan genetisk predisposisjon, farmasøytisk intervensjon, og metabolske plastisitet påvirker AS avhengige utfall ^{4-6,8,9,12,13.}

Figur 1. C. elegans overlevelse og touch respons etterAS. A) Andel av ormer som utviser 24 timers post-AS overlevelse. N2 belastningen er den villtype genetisk bakgrunn, og KWN85 inneholder en integrert transgenet som etiketter mec nevroner med GFP. B) Response å røre stimuli av levende C. elegans (N2 Strain) etter AS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Berørings nevroner modifikasjoner etter AS. Touch nevron (PLML og PLMR) abnormaliteter som kroket prosesser og pauser (A) eller opphopning av GFP tilslag i prosessene (B) ble overvåket i gjenlevende bedøvet C. elegans ans etter AS.

Figur 3. Pels hakke. Et samlet øyevipper hakke. I det innfelte, en detalj av øyen limt til tannpirker av tre.

Figur 4. Lab-laget hypoksisk kammer inne i vannbad. En lukket beholder klar for å starte forsøket. Pilene viser inngangen gass og exit og flasken vekten brukes til å holde den fra flytende.

231fig5.jpg "/>
Figur 5. Detaljer av indre og ytre side av beholderlokket. A) Ytre side av beholderlokket, noe som indikerer at røret og dets kontakt er festet til den tidligere laget hull. B) Ytre side av beholderlokket, noe som indikerer at røret som er festet til den tidligere laget hull.

Discussion

AS har vært mye brukt i C. elegans å modellere IR skade. Noen sentrale punkter skal være uthevet for denne protokollen: C. elegans er resistente mot et bredt spekter av skader, begrunner behovet for 3 samtidige fornærmelser (varme, sult og anoksi) for å oppnå død ved hjelp av dette systemet. Anoksi alene ikke drepe ormene i dette vinduet for tiden ^14. Videre er temperaturøkningen en ekstra belastning, så er det viktig å overvåke nøye. Strengt tatt ikke sult ikke bidra vesentlig til graden av dødelighet observert ^7, per se, men det ser ut til å redusere variasjonen blant eksperimentelle replikater. Gitt at det kan være betydelig variasjon fra dag til dag, er det ekstremt viktig å sammenligne prøvene kjøres direkte i parallell, og å gjenta eksperimenter over flere dager. Generelt er resultatene målt for tre separate plater av 50-100 ormer / eksperimentell tilstand, og disse ern gjennomsnitt og anses som en enkelt eksperimentell replikere. Vanligvis mellom sju og ni gjentak ser ut til å være tilstrekkelig til å oppnå eller utelukke statistisk signifikans.

Utviklingsstadiet av ormer som brukes i forsøket må også være nøye overvåket som mottakelighet for ulike stadier til AS skader varierer betydelig ^15,16. Bruken av unge voksne er standard, og larvestadiet (L3 og L4) ormer ser ut til å være mer motstandsdyktig mot de skadelige effektene av AS (upubliserte data).

Denne protokollen presenterer to måter å utføre eksperimenter, en ved hjelp av en lab-laget apparat (med Tupperware-type beholdere og gass innspill ¹¹⁾ og andre ved hjelp av en kommersiell hypoksisk kammer ^4,6. Anoksi kan oppnås med andre midler som forbruker oksygen, som beskrevet andre steder ^13,17. Bruken av alternative teknikker for å skape et hypoksisk miljø kan forandre AS inkubasjonstid nødvendigeå skape den ønskede mengden av død. Målretting ~ 20% overlevelse er et ideelt utgangspunkt for å studere vernetiltak, mens 80% er like ideelt for intervensjoner som forverre de skadelige effektene av AS. En annen viktig påminnelse er tidspunktet da observatør score døde / levende ormer. Hvis tiden for analysen er utvidet utover 24 timer, kan dataene være misvisende siden døde ormer blir stadig vanskeligere å identifisere. Dette kan være på grunn av snekkeskrotter blir forholdsvis transparent over tid, men også til det faktum at befruktede embryo kan utvikle seg til avkom post-mortem innsiden av skrotter og avbryte dem som de oppstår.

Analysen av neuronal morfologi kan bli endret for å se på protein uttrykk mønstre ^18, atom fragmentering ⁴ og andre parametere ¹⁹ ved å erstatte en orm belastning som uttrykker den aktuelle genetisk kodet markør. En siste påminnelse er at visualisering avnevronale prosesser bør gjøres mindre enn 30 minutter etter å plassere ormer på lysbildet. Dyr holdt under anestesi på lysbilder for lengre perioder kan fremvise AS uavhengig skade. Justere mengden av dyr pr glide henhold til den tid som trenges for å spore og analysere dem.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2  strain	CGC		Wild type strain. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)	CGC	TU2583	integrated fluorescent transgene used to label touch neurons. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
CB1338 mec-3 (e1338)IV	CGC	CB1338	canonical mec-3 mutant that is touch insensitive. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
Microcentrifuge Tube	Eppendorf	0030 120.086
Nikon Eclipse TE2000-U Microscope	Nikon USA	TE2000-U
Low Temperature Incubator	Sheldon Manufacturing Inc.	Model 2005
Eyelash Pick			An eyelash pick can be prepared by attaching  an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3).
Hypoxic Chamber	Coy	8307030	Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.