Summary
Um protocolo é descrito que utiliza anoxia / inanição em C. elegans para modelo de isquemia / reperfusão. Os resultados funcionais incluem um aumento da mortalidade, anormalidades visíveis em processos neuronais marcado com GFP, e respostas comportamentais comprometidas que requerem a função neuronal.
Abstract
Protocolos para anoxia / fome no organismo modelo genético C. elegans simular isquemia / reperfusão. Vermes são separados a partir de alimentos de bactérias e colocadas sob anóxia durante 20 horas (isquemia simulada), e subsequentemente transferida para uma atmosfera normal com comida (reperfusão simulado). Este paradigma experimental resultados em aumento da morte e os danos neuronais, e técnicas são apresentados para avaliar a viabilidade do organismo, as alterações na morfologia dos processos de toque de neurónios, bem como a sensibilidade ao toque, o que representa a produção de comportamento da função neuronal. Por fim, um método para a construção de incubadoras hipóxicas utilizando recipientes de armazenamento de cozinha comum é descrito. A adição de uma unidade de controlo de fluxo de massa permite alterações a introduzir a mistura de gás em incubadoras personalizados, e um banho de água circulante permite tanto o controlo de temperatura e torna-o fácil de identificar vazamentos. Este método fornece uma alternativa de baixo custo para comercialmenteunidades disponíveis.
Introduction
C. elegans é um nematóide que tem sido amplamente adotado como um organismo modelo eucariota multicelular desde a sua introdução por Brenner 1. É um modelo simples, barato e versátil, que permite ligações fáceis entre alterações genéticas e fenotípicas muda 2.
A isquemia é caracterizada por uma falta de disponibilidade de nutrientes e de oxigénio a um tecido, seguida de reperfusão, quando uma explosão de espécies de oxigénio reactivo é produzida 3 e mais do que ocorre o dano. Em 2002, um modelo de isquemia / reperfusão (IR) em C. elegans foi desenvolvido 4 envolvendo a apresentação de todo o worm a anoxia, privação de nutrientes e estresse por calor por cerca de 20 horas seguido por 24 horas em condições normais. Embora este modelo é tecnicamente um anóxia-fome (AS) condição, a morte das células ocorre através de mecanismos que são conservadas em mamíferos, incluindo os danos induzidos por oxidantes durante a reperfusão <sup> 5. Além disso, semelhante à dos mamíferos IR, dano induzido por AS em C. elegans pode ser prevenida por pré-condicionamento isquémico 6,7 ou pré-condicionamento anestésico 8,9.
Os protocolos abaixo demonstram como imitar IR em C. elegans utilizando o modelo AS, como marcar anormalidades morfológicas e comportamentais que resultam de AS, e como adaptar o protocolo de uma maneira que permite que o experimento a ser realizado com um menor investimento inicial usando uma alternativa câmara facilmente construído custom-made .
Protocol
1. C. Crescimento elegans
- Prepare 35 milímetros Nematode Crescimento Mídia (NGM) placas de ágar semeado com OP50 bactérias, como por métodos de cultivo padrão 1.
- Sincronizar C. elegans, colocando 6 adultos grávidas em uma placa NGM semeado. Retire os adultos após ~ 100 ovos foram estabelecidas (~ hr 3).
- Incubar as placas durante 3 dias a 20 ° C, altura em que os vermes desenvolveram a fase adulta jovem e são ideais para este experimento. Protocolos alternativos para sincronizar C. elegans são descritos em outro lugar 10.
2. Materiais para AS
- Tampão M9 (22 mM de KH 2 PO 4, 42 mM de Na 2 HPO 4, 86 mM de NaCl, 1 mM de MgSO4) deve ser purgado de oxigénio foram equilibradas com N 2 (árgon pode também ser usado), durante 30 minutos antes da experiência e mantido rodeado de gelo.
- Faça um pequeno furo (3 mmde largura) na tampa de 1,5 ml em tubos de microcentrífuga que os vermes serão colocados durante AS. O buraco permite a troca gasosa sem manter a tampa aberta, pois isso pode levar à evaporação excessiva da mídia.
3. Anóxia / Fome
- Realizar todas as experiências pelo menos em triplicado.
- Adicionar 1 ml de tampão M9 RT, oxigenado para cada placa de 35 milímetros contendo vermes adultos jovens cultivadas como descrito acima. Tenha cuidado para evitar a remoção de bactérias da placa (adicionar M9 para as bordas onde as bactérias não foram semeadas). Após cerca de 1 min os vermes deve estar nadando no M9.
- Brasão uma ponta de pipeta de 1 ml com BSA por pipetagem e expulsando um estéril solução BSA 1%.
- Incline cuidadosamente a placa contendo os vermes em tampão M9, retire a M9 do mesmo lugar onde foi adicionado, e colocar a suspensão nos microtubos preparados. Deixar em repouso em gelo até que os vermes têm caído para a parte inferior dos tubos (~ 1-2 Minutos).
- Retire a quantidade máxima de M9 possível, sem perturbar os vermes do tubo (deixando cerca de 100 mL), adicionar 1 ml da M9 e gelado purgado em oxigênio e colocar o tubo sobre o gelo até que os vermes se depositam no fundo de novo. Repita o último passo de 3x. Na última lavagem, remover o M9 até ~ 100 ul permanece no tubo.
- Coloque os tubos com os vermes em desoxigenado M9 dentro de uma câmara anóxica / hipóxica (veja as instruções abaixo, Seção 3.6.1) ou, alternativamente, em um recipiente personalizado selado (veja as instruções abaixo, Seção 3.6.2).
- Se um anóxico / hipóxico câmara comercial é para ser usado, deixe alguns M9 purgado dentro da câmara antes de iniciar o passo 3.5 e repita o passo 3.5, uma vez que os vermes estão dentro da câmara.
- Se uma câmara personalizado está a ser utilizado, uma descrição detalhada de como criar um aparelho de baixo custo é apresentado no final de este protocolo e foi descrito por outro grupo anteriormente 11. Resumidamente:
- Colocar os vermes para a câmara e da câmara de vedação com a tampa.
- Gás com um constante fluxo de N2 (100 ml / min).
- Colocar o recipiente dentro de um banho de água a 26 ° C. Certifique-se de que o tubo de saída é bem imerso em água de modo nenhum retorno de ar e que não há fugas no sistema (aparente por bolhas decorrentes da câmara em si).
4. A reperfusão Simulado
- Depois de 20 horas, sob condições, retire os tubos da câmara de incubação em ar ambiente.
- Pipeta C. elegans com uma ponta BSA-revestido (como no passo 3.3) para um OP50 semeado 35 milímetros placa NGM. Incubar as placas a 20 ° C durante 24 hr.Depois disso, os vermes estará pronto para ser marcado.
5. Identificar Morto Versus vivo Worms
- Usando uma picareta platina, tocar levemente a parte superior da cabeça do verme. Vermes vivos irá se mover para trás depois de ser tocado. Se os vermes estão sem resposta, marcar como morto. Ocasionalmente, um verme não irá se mover para trás, mas podem apresentar um leve movimento de cabeça de lado a lado. Apesar de não ser tecnicamente morto, esses vermes são quase certo para expirar em questão de horas, e deve ser marcado como morto. Se alguém espera muito tempo para marcar os vermes, choque interno de progênie pode ocorrer e esses "sacos-de-vermes" podem se romper, fazendo detectar as carcaças muito difícil.
- Remova ambos os vermes vivos e mortos da placa como eles são contados para evitar contagens duplicadas. Os vermes vivos pode ser transferida para uma placa separada para realizar ensaios comportamentais. A quantidade de vermes que vivem em relação ao total é representada como a% de vermes sobreviventes (Figura 1A
6. Toque Ensaio de Resposta
- Uma descrição detalhada deste protocolo tem sido apresentada em Hart, Anne C., ed. Comportamento (3 de Julho de 2006) WormBook, ed. O C. elegans investigação comunitária, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
- Para marcar a resposta ao toque, identificar vermes que estão se movendo e tocar levemente a lateral da cabeça do verme (perto da parte central da faringe) com um picador de cílios (Figura 3).
- Se o worm se move para trás, a pontuação tão sensível, se não, marcar sem resposta (Figura 1B). Repita este passo 10-15x para cada verme com intervalos de 10 segundos. Sonda pelo menos 10 vermes em cada grupo para ter dados precisos. O mesmo ensaio pode ser usado para avaliar a frente alterações locomotory seguinte toque de luz para a parede do corpo posterior. Cuidado para não tocar na cabeça ou cauda do verme, pois isso estimula um comportamento distinto.
- Finalmente, emestirpes de controlo genético corporativos [N2 Bristol tipo selvagem para, mec (mecanosensorial) mutante positiva para negativa - por exemplo CB1338 mec-3 (e1338) IV] para calibrar a força com que tocar os vermes. Muito dura de estimulação vai provocar uma resposta comportamental em mutantes mec, muito pouco não vai provocar um efeito em controles de tipo selvagem N2.
7. Neuronal Modificações
- Para visualizar pós AS modificações neuronais, use uma estirpe que expressa GFP no MEC neurônios respondendo toque 4,5. Esses neurônios têm processos longos que correm ao longo da parede do corpo e são facilmente marcados por alterações morfológicas. Além disso, a informação morfológico pode ser integrado com medidas comportamentais da função neuronal, como descrito acima. Uma estirpe, que pode ser usada para esta finalidade é TU2583, que está disponível a partir da C. elegans Genetics Center e contém o transgene integrado uIs25 expressando GFP frosou o mec-18 promotor, ou, alternativamente, TU2562, que contém um mec-3 :: GFP fusão integrado.
- Prepare uma almofada de agarose.
- Derreter 2% de agarose em água, para trazer 1x M9 com um estoque de 10x, e manter a solução a 70 ° C.
- Colocar uma gota (~ 20 ul) desta solução numa lâmina de vidro (25 mm x 75 mm) que foi colocada entre duas outras lâminas, cada um dos quais com um único pedaço de fita adesiva sobre o seu lado inferior.
- Coloque uma lâmina de vidro final, perpendicular ao primeiro na parte superior da solução de agarose a 2%, e deixá-la arrefecer à temperatura ambiente. Isto deve formar uma almofada que é a espessura da fita.
- Retire o topo de slides e adicione 10 ml de M9 contendo 0,1% de tetramisol, que imobilizam os vermes.
- Mova alguns (~ 10) viver vermes na agarose slides 2%. Coloque uma lamela sobre eles e visualizar GFP utilizando um microscópio de fluorescência sob um objetivo 100X com a iluminação adequada.
- Estragadoneurónios irá mostrar uma cadeia citosólica membrana de padrão de pérolas nos processos, composta de punctum múltipla (Figura 2A), e / ou anomalias em que os processos parecem ser quebrada (Figura 2B). Contagem de punctum e anomalias em ambos os neurónios de cada verme, usando um total de pelo menos 10 vermes.
8. Fez-Lab Hipóxica Câmara
- A Tupperware estilo, recipiente lacrado, hermético pode ser retrofit como uma câmara anóxica. Tome o cuidado de selecionar um recipiente que é tão pequeno quanto possível. Um pequeno recipiente cria um ambiente hipóxico mais rápido e é mais fácil de se encaixar no banho de água (Figura 4).
- Fazer dois furos na tampa (pode ser feito com uma chave de parafusos ou por aquecimento de uma pinça e forçando para a tampa) e inserir um conector de plástico ou de metal que se encaixa no tubo (Figura 5A). Use cola que pode ser colocado debaixo de água, e também fica difícil após a secagem, evitando o movimento deo conector e, portanto, reduzindo a possibilidade de fugas (Figura 5B).
- O recipiente deve ser colocado no banho de água de modo que é completamente submersa (Figura 4). Para mergulhar o recipiente, use um peso garrafa ou um peso de mergulho.
- Um dos tubos de conexão vai ser usada para introduzir uma mistura de gás e o outro tubo irá actuar como um limitador de pressão, pelo que deve ser deixado sob a água de modo que o recipiente é selado a partir do ambiente externo (Figura 4).
- A composição do ar pode ser modulada por meio de gás feito à medida, controladores de fluxo de massa ou qualquer aparelho que mistura os gases desejados. O fluxo de gás deve ser controlado, como de alto fluxo pode criar uma evaporação excessiva. Por exemplo, em um recipiente de 250 ml, 100 ml / min de gás irá proporcionar boa espaço para os vermes e um fluxo adequado.
- O comprimento da tubagem deve ser mantida a um mínimo, dado que pode ser permeável a gás, umallowing a entrada de O 2. É importante evitar o uso de silicone, tubos Tygon vez que estes materiais são permeáveis a troca de gás. Preferimos tubos de polipropileno ou nylon. Vidro ou tubos de metal manter os gases de bem, mas também são mais difíceis de se trabalhar.
Representative Results
Sujeitar C. elegans e 20 horas de AS a 26 ° C numa câmara de incubação feitos em laboratório, como descrito (secção 3.6.2) resultaram em mortalidade significativa (Figura 1A) 5. Imagem fluorescente subsequente de punctum e quebras nas GFP rotulados processos neuronais de sobreviventes confirmaram a presença de anormalidades morfológicas (Figura 2). Os sobreviventes também responderam mal ao toque parede do corpo de luz (Figura 1B). Este modelo tem sido utilizado por vários grupos para estudar como a predisposição genética, a intervenção farmacêutica e plasticidade metabólica afeta os resultados como dependente 4-6,8,9,12,13.
Figura 1. C. elegans sobrevivência e toque resposta apósAS. A) Percentagem de vermes que exibem 24 horas de pós-AS sobrevivência. A cepa N2 é a herança genética do tipo selvagem, e KWN85 contém um transgene integrado que rotula neurônios mec com GFP. B) Resposta ao toque estímulos de viver C. elegans (N2 Strain) após AS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Toque modificações neuronais após AS. Neurônio Toque (PLML e PLMR) anomalias, tais como processos tortuosos e pausas (a) ou a acumulação de agregados GFP nos processos (B) foram monitorados em sobreviver anestesiados C. eleg ans após AS.
Figura 3. Escolha pestana. Uma pestana escolha montado. Na inserção, um detalhe do cílio colado à madeira palito.
Figura 4. Câmara hipóxica no interior do banho de água fez-Lab. Um recipiente fechado pronto para iniciar a experiência. As setas indicam a entrada e saída de gás eo peso garrafa usada para mantê-lo flutuando.
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Figura 5. Detalhes do lado interno e externo da tampa do recipiente. A) do lado externo da tampa do recipiente, indicando o tubo e o seu conector ligado ao anteriormente feito furo. B) do lado externo da tampa do recipiente, indicando que a ligação de tubo ligado ao furo previamente feito.
Discussion
Como tem sido amplamente utilizado em C. elegans para modelar lesão IR. Alguns pontos-chave devem ser destacadas para este protocolo: C. elegans são resistentes a uma grande variedade de lesões, o que justifica a necessidade de 3 insultos concomitantes (calor, fome e anoxia) para alcançar a morte usando este sistema. Não só anoxia não matar os vermes nesta janela de tempo 14. Além disso, o aumento da temperatura é um estresse adicional, por isso é importante acompanhar de perto. Estritamente falando, a fome, não contribui de forma significativa para o grau de mortalidade observada 7, por si só, mas parece reduzir a variabilidade entre experiências em replicado. Dado que não pode haver variabilidade significativa do dia-a-dia, é extremamente importante para comparar amostras executado diretamente em paralelo, e para repetir experiências ao longo de vários dias. Em geral, os resultados são medidos por três placas separadas de 50-100 vermes / condição experimental e estes são osn média e considerado como uma única réplica experimental. Geralmente, entre sete e nove repetições parecem ser suficientes para alcançar ou excluir significância estatística.
O estágio de desenvolvimento dos vermes utilizados no experimento também precisa ser cuidadosamente monitorados quanto a suscetibilidade de diferentes estágios de AS dano varia significativamente 15,16. O uso de adultos jovens é padrão, e a fase larval (L3 e L4) vermes parecem ser mais resistentes aos efeitos danosos do AS (dados não publicados).
Este protocolo apresenta duas maneiras de realizar os experimentos, um utilizando um aparelho feito em laboratório (usando recipientes Tupperware do tipo e entrada de gás 11) e outro utilizando uma câmara hipóxica comercial 4,6. A anóxia pode ser alcançado por outros meios que consomem o oxigênio, conforme já descrito 13,17. O uso de técnicas alternativas para criar um ambiente hipóxico pode mudar o tempo de incubação necessário ASpara criar a quantidade desejada de morte. Segmentação ~ 20% de sobrevivência é um ponto de partida ideal para estudar as intervenções de proteção, enquanto 80% é igualmente ideal para intervenções que agravam os efeitos prejudiciais de AS. Outra ressalva importante é a hora em que a pontuação observador vermes mortos / vivos. Se o tempo para análise é estendida para além de 24 horas, os dados podem ser enganador pois vermes mortos tornam-se cada vez mais difícil de identificar. Isto pode ser devido a carcaças de vermes de se tornar relativamente transparente ao longo do tempo, mas também para o facto de que os embriões fertilizados pode desenvolver em progenitura post-mortem no interior das carcaças e perturbar eles à medida que surgem.
A análise da morfologia neuronal pode ser modificado para analisar os padrões de expressão de proteína de 18, a fragmentação nuclear e 4 outros parâmetros 19 por substituição de uma estirpe de vírus que exprime o marcador geneticamente codificado adequado. Uma advertência final é que a visualização daprocessos neuronais deve ser feito a menos de 30 min depois de colocar os vermes no slide. Os animais mantidos sob anestesia em lâminas por períodos mais longos podem apresentar danos AS-independente. Ajuste a quantidade de animais por slides de acordo com o tempo necessário para rastrear e analisá-los.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Figuras 1 e 2 foram previamente publicados em Livre Radical Biology & Medicine (Queliconi et al. 5) e têm direitos de autor detidos por Elsevier. Este trabalho foi apoiado pelo Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), o Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Processos Redox los Biomedicina, o Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox los Biomedicina, USPHS NS064945 (KN) e USPHS GM087483 (KN ). Churrasco é um estudante de doutorado apoiado por uma bolsa FAPESP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N2 strain | CGC | Wild type strain. http://www.cbs.umn.edu/CGC/ |
|
| TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP) | CGC | TU2583 | integrated fluorescent transgene used to label touch neurons. http://www.cbs.umn.edu/CGC/ |
| CB1338 mec-3 (e1338)IV | CGC | CB1338 | canonical mec-3 mutant that is touch insensitive. http://www.cbs.umn.edu/CGC/ |
| Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U Microscope | Nikon USA | TE2000-U | |
| Low Temperature Incubator | Sheldon Manufacturing Inc. | Model 2005 | |
| Eyelash Pick | An eyelash pick can be prepared by attaching an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3). | ||
| Hypoxic Chamber | Coy | 8307030 | Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller. |
References
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