Summary
的协议，描述了使用缺氧/饥饿在C线虫模型缺血/再灌注。功能结果包括死亡率上升，在GFP标记的神经元突起明显异常，需要神经功能受损的行为反应。
Abstract
在遗传模式生物线虫协议进行缺氧/饥饿模拟缺血/再灌注。蠕虫病毒是从细菌的食物分开，缺氧下放置20小时（模拟缺血），并随后转移到食品（模拟再灌注），一个正常的气氛。这个实验范式导致增加的死亡和神经元损伤，并且技术被提出来评估生物活力，改动触摸神经元过程的形态，以及触摸灵敏度，它表示神经元功能的行为输出。最后，对于使用公共厨房储存容器构造低氧孵化的方法进行说明。增加了一个质量流量控制单元的允许改变要作出在定制孵化器的气体混合物中，并循环水浴允许同时控制温度和可以很容易地识别泄漏。这种方法提供了一种低成本的替代方案以商业可用单位。
Introduction
线虫是，自推出以来，通过布伦纳1被广泛采用的多细胞真核模式生物线虫。它是一种廉价，简单，灵活的模型，它允许基因变异与表型之间的联系很容易改变2。
局部缺血的特征是缺乏的营养物质和氧供给到组织中，然后再灌注，当突发的活性氧产生3和大部分损伤的发生。 2002年，缺血/再灌注（IR）在C的模型线虫的开发4，涉及提交全虫缺氧，营养缺乏和热应激约20小时，然后在正常情况下24小时。尽管这种模式在技术上是一个缺氧饥饿（AS）的条件下，细胞死亡是通过那些保守的哺乳动物机制，包括再灌注诱导氧化剂损伤<SUP> 5。此外，类似于哺乳动物的红外光谱，损伤诱发的AS C中线虫可以通过缺血预处理6,7或麻醉药预处理8,9是可以避免的。
下面的协议演示了如何模仿IR在C线虫使用AS模型，如何得分，导致AS的形态和行为异常，以及如何适应协议的方式，允许使用一个定制的，易于构造腔替代较低的初始投资进行的实验。
Protocol
1，C.线虫生长
- 准备35毫米线虫生长培养基（NGM）接种OP50细菌的琼脂平板上，按标准种植方法1。
- 放置6妊娠成人到种子NGM板同步线虫 。取出后，大人〜100个卵已经奠定（〜3小时）。
- 孵育所述板3天在20℃时，在该点的蠕虫会发展到年轻成年阶段和最适合于该实验。另一种协议来同步C.线虫在其他地方10描述。
2。材料用于AS
- M9缓冲液（22 mM的KH 2 PO 4，42 mM的钠2 HPO 4，86 mM氯化钠，1mM的MgSO 4干燥），应通过与N 2平衡的氧气吹扫（氩气也可以被使用）在30分钟期间在实验前并保存在冰中。
- 做一个小孔（0.1毫米宽）在1.5ml的微量离心管的盖子，其中，蠕虫将被放置在AS中。孔允许气体交换不保持盖子打开，因为这可能会导致过多的介质蒸发。
3。缺氧/饥饿
- 进行所有的实验至少一式三份。
- 加入1 ml的RT，含氧M9的缓冲区含有上述长大年轻的成虫超过35毫米的钢板。要小心，以避免板去除细菌（M9添加到细菌不接种的边缘）。经过约1分钟的蠕虫，应在游泳的M9。
- 大衣1毫升枪头，与BSA吹打和驱逐无菌的1％BSA溶液。
- 小心倾含在M9缓冲蠕虫的板，从那里它被加在同一个地方取出M9，然后将悬浮液中制备的微量离心管中。让我们休息，直到冰蠕虫已经下降到管的底部（〜1-2分）。
- 除去M9的可能的最大数量不脱离管干扰虫（留下约100微升），加入1毫升的氧气吹扫和冰镇的M9和将管在冰上，直到蠕虫沉淀到底部一次。重复最后一步3倍。在最后一次洗涤，除去M9直到〜100微升保留在管中。
- 放置的蠕虫在脱氧的M9缺氧/缺氧室内部的管子（见下面的说明，第3.6.1节），或者，到定制的密封容器中（见下面的说明，第3.6.2节）。
- 如果商业缺氧/缺氧室是被使用，留下一些吹扫M9室内部开始步骤3.5之前，重复步骤3.5一旦蠕虫是在腔室内部。
- 如果自定义室被使用，如何创建一个低成本的设备的详细说明，提出了在本协议的结束，已被描述的另一组先前11。简单地说：
- 将蠕虫进入腔室并用盖子密封所述腔室。
- 气体以恒定的氮气流（100毫升/分钟）。
- 放置在容器内的水浴在26℃。确保出口管以及浸入水中所以没有空气的回报，而没有泄漏的系统（由从腔室本身所产生的泡沫表观的）。
4。模拟再灌注
- AS条件下20小时后，取出从孵化室管进入室内空气。
- C.移液器线虫用BSA包被的尖端（如在步骤3.3）安装到一个OP50接种35毫米NGM板。培养板在20℃下24小时。在此之后，蠕虫将准备进行评分。
5。确定死亡对战现场蠕虫
- 使用铂挑，轻轻触摸蠕虫的头顶。现场蠕虫会被感动后向后移动。如果蠕虫是无反应，比分为死。偶尔，蜗杆不会向后移动，但是可能表现出轻微的一侧到另一侧头部的运动。虽然技术上不是死了，这些蠕虫几乎可以肯定，在几小时内到期，应评价为死。如果等待时间过长的得分蠕虫，后代的内部孵化可以发生，这些“包包 - 的蠕虫”可破溃，使检测的尸体很困难。
- 从板块中删除这两个活的和死虫，因为它们是计算以避免重复计数。活蠕虫可以移动到一个单独的板块进行行为分析。相对于总活虫量表示为幸存的蠕虫％（ 图1A
6。触摸响应分析
- 此协议的详细描述已经呈现在哈特，安妮三，编辑。行为（2006年7月3日），WormBook，编辑。该三线虫研究社区，WormBook，doi/10.1895/wormbook.1.87.1，http://www.wormbook.org。
- 进球的触摸响应，识别正在轻轻用睫毛挑（ 图3）摸虫的头部侧（靠近咽喉的中间部分）的蠕虫。
- 如果蠕虫向后移动，拿到尽可能响应，如果没有，得分为无反应（ 图1B）。用10秒的时间间隔重复此步骤，10-15X的每个虫。探测至少10蠕虫每组中有准确的数据。相同的测定可用于评估向前下列轻触摸到后主体壁运动器官的变化。请务必不要触摸蠕虫的头部或尾部，因为这会刺激一个独特的行为。
- 最后，在企业基因对照菌株[N2布里斯托尔野生型为阳性，MEC（mechanosensory）突变为负数- 例如 CB1338 MEC-3（e1338）IV]校准与触摸蠕虫的力量。过于苛刻的刺激会引起一个行为反应在MEC突变，过少会不会引起在野生型N2控制的效果。
7。神经修改
- 以可视化的岗位作为神经修改，使用菌株表达绿色荧光蛋白在触摸响应MEC神经元4,5。这些神经元具有沿体壁运行，很容易拿下的形态异常漫长的过程。此外，本形态的信息可与神经元功能的行为的措施相结合，如上所述。可用于这个目的的一个菌株是TU2583，这是可从下线虫遗传学中心，包含uIs25集成来回的转基因表达绿色荧光蛋白米的MEC-18启动子，或者TU2562，其中包含一个集成的MEC-3 :: GFP融合。
- 准备琼脂糖垫。
- 熔化的2％琼脂糖中的水，使1倍M9用10倍的库存，并保持溶液在70℃下
- 把该溶液的载玻片上（25毫米×75毫米）一滴（约20微升）已放置其他两个幻灯片，其中每一个具有一个单件的磁带在其底侧之间。
- 将垂直于第一在2％琼脂糖溶液之上的最后搏命，并让它冷却室温。这应该形成一个垫，它是带的厚度。
- 卸下顶部的幻灯片，并添加10微升的M9含0.1％四咪唑，将固定的蠕虫。
- 将部分（〜10）生活蠕虫到2％琼脂糖幻灯片。将盖玻片超过他们，并使用下一个目标100X荧光显微镜用适当的照明GFP可视化。
- 破损神经元将呈现珍珠模式中的处理的胞质膜的字符串，由多个泪点（ 图2A）的，和/或异常，其中过程出现折断（ 图2B）。计数泪点和异常两种神经元对每个虫，总共使用了至少10蠕虫。
8。实验室自制缺氧商会
- 特百惠式的，密封的，密封的容器可以被改造为缺氧室。注意要选择一个容器，是尽可能小。一个小容器创建一个缺氧的环境更快，更容易适应在水浴中（ 图4）。
- 使两个孔上的盖子（可以用螺丝刀或镊子加热并强制进入盖完成），并插入一个适合的管（ 图5A）的塑料或金属连接器。使用胶水，可以放置在水中，也变得硬干燥后，避免了运动该连接器，从而减少泄漏的可能性（ 图5B）。
- 该容器应放入水浴使其完全浸没（ 图4）。浸泡容器中，用奶瓶重量或潜水的重量。
- 一项所述的管连接将被用于引入气体混合物，而另一管将作为一个压力释放，因此它应在水中留下，以便将容器从外部环境（ 图4）封闭。
- 空气组合物可以通过使用定制的气体质量流量控制器或混合了所需的气体的任何装置进行调制。气体流应加以控制，如高流动可以建立过度蒸发。例如，在一个250ml的容器中，气体为100ml /分将提供的蠕虫良好的空间和合适的助焊剂。
- 管子的长度应保持在最低限度，因为它们可以是可渗透的气体，一llowing的O 2的入口。避免使用有机硅是很重要的，聚乙烯离心管，因为这些材料是可渗透的气体交换。我们宁愿聚丙烯或尼龙管。玻璃或金属管保持气体很好，但也很难一起工作。
Representative Results
C.服从线虫到20小时于26℃下在自定义的实验室制造的孵化室中所描述的（第3.6.2节）带来显著的死亡率（ 图1A）5。泪点和断裂在幸存者的GFP标记的神经元突起的后续荧光成像证实形态异常的存在（ 图2）。幸存者也效果不佳，以轻体墙接触（ 图1B）。该模型已被用于多个小组，研究遗传易感性，药物干预和代谢可塑性如何影响AS相关结果4-6,8,9,12,13。
图1。C.线虫后生存和触摸响应AS A）蠕虫的百分比，表现出24小时后的AS生存。在N2菌株是野生型的遗传背景，并KWN85包含一个集成的转基因的标签MEC神经元GFP B）响应触摸活C的刺激线虫 （N2株）后的AS。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2。后触摸神经修改。触控神经元（PLML和PLMR）异常，如曲折的过程和休息（A）或绿色荧光蛋白聚集体的过程（B）的累积生存进行了监测麻醉C。 ELEG ANS后的AS。
图3。睫毛选秀权。一种组装式睫毛挑。在插图中，睫毛的细节粘在牙签的木材。
图4。实验室自制缺氧室水池内的一个封闭的容器准备开始实验。箭头表示气体的入口和出口，并用于保持漂浮在瓶的重量。
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图5。容器盖的内部和外部侧的详情。容器盖的A）外部侧，表示附加到先前作出孔B）的容器盖的外侧面，指示附加到先前作出的孔的管接头的管及其接头。
Discussion
如已经广泛应用于C.线虫对缺血再灌注损伤模型。一些关键点应该对该协议予以强调： 线虫耐损伤广泛，证明有必要对3伴随侮辱（热，饥饿和缺氧）使用这个系统来实现的死亡。缺氧本身并不能杀死虫子的时间14此窗口。此外，温度增加一个额外的应力，因此密切监测是很重要的。严格地说，饥饿不显著到死亡的程度有助于观察07 本身 ，但它似乎降低实验重复间的变异性。鉴于目前可以从一天到一天的显著变化，这是非常重要的，比较直接的平行样运行，并且在多天重复实验。一般情况下，结果被测量的三个独立的50-100虫板/实验条件，这些都是Ñ平均，视为一个单一的实验重复。一般地，间7和9重复出现足以达到或排除统计学意义。
在实验中使用的蠕虫的发育阶段也需要作为不同的阶段的敏感性的AS损伤显著15,16变化进行仔细的监测。使用年轻人是标准的，而幼虫阶段（L3和L4）蠕虫似乎对AS的（未发表数据）的破坏性影响更耐。
这个协议提供了两种方法来实现上述的实验中，1用实验室制造的装置（使用百惠型容器和气体输入11）和其他使用商业低氧室4,6。缺氧可以通过消耗氧气等手段来实现，如在别处13,17说明。使用替代技术来创造一个缺氧的环境可能会改变所需的AS孵化时间创建死亡的所需量。瞄准〜20％的生存是一个理想的起点，研究保护措施，而80％是同样理想的加剧AS的不利影响的干预措施。另一种重要的警告是时间点的观测分数死/活虫。如果分析时间延长超过24小时，数据可能会产生误导，因为死的蠕虫变得越来越难以辨认。这可能是由于虫尸变得相对透明随着时间的推移，也让一个事实，即受精的胚胎能够发育成子代验尸的尸体里面，扰乱他们，因为他们出现。
神经元形态的分析，可以进行修改，以看看蛋白表达模式18，核碎裂4和其他参数19代蠕虫菌株，表达适当的基因编码的标记。最后一个需要注意的是，该可视化把虫上滑盖后神经元突起应做不少于30分钟。动物保持麻醉状态下在幻灯片上更长的时间可以表现出的AS无关的损坏。根据跟踪和分析他们所需要的时间调整每张幻灯片的动物的数量。
Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
图1和图2以前出版的自由基生物学及医学 （Queliconi 等。5）进行，并有由爱思唯尔举行的版权。这项工作是由支持 FUNDAÇÃO德宪法保护的单Pesquisa做斯卡德圣保罗（FAPESP），在国家研究所CIENCIAÉTECNOLOGIA DE Processos氧化还原EM Biomedicina，该核苷酸德ApoioàPesquisa去Processos氧化还原EM Biomedicina，USPHS NS064945（KN），和USPHS GM087483（KN ）。烧烤是一个FAPESP奖学金支持的博士生。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N2 strain | CGC | Wild type strain. http://www.cbs.umn.edu/CGC/ |
|
| TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP) | CGC | TU2583 | integrated fluorescent transgene used to label touch neurons. http://www.cbs.umn.edu/CGC/ |
| CB1338 mec-3 (e1338)IV | CGC | CB1338 | canonical mec-3 mutant that is touch insensitive. http://www.cbs.umn.edu/CGC/ |
| Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U Microscope | Nikon USA | TE2000-U | |
| Low Temperature Incubator | Sheldon Manufacturing Inc. | Model 2005 | |
| Eyelash Pick | An eyelash pick can be prepared by attaching an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3). | ||
| Hypoxic Chamber | Coy | 8307030 | Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller. |
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