En Anoxia-sult Model for iskæmi / reperfusion i Published: March 11, 2014 doi: 10.3791/51231

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Bruno B. Queliconi¹, Alicia J. Kowaltowski¹, Keith Nehrke²

¹Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, ²Department of Medicine, Nephrology Division, University of Rochester Medical Center, School of Medicine and Dentistry

Summary

En protokol er beskrevet som anvender anoksi / sult i C. elegans at modellere iskæmi / reperfusion. Funktionelle resultater omfatter øget dødelighed, synlige abnormiteter i GFP-mærkede neuronale processer og værdiforringede adfærdsmæssige reaktioner, der kræver neuronal funktion.

Abstract

Protokoller for iltmangel / sult i den genetiske model organisme C. elegans simulere iskæmi / reperfusion. Orme er adskilt fra bakteriel fødevarer og anbragt under iltmangel i 20 timer (simuleret iskæmi) og efterfølgende flyttet til en normal atmosfære med mad (simuleret reperfusion). Denne eksperimentelle paradigme resulterer i forøget død og neuronal beskadigelse og teknikker er præsenteret for at vurdere organisme levedygtighed ændringer morfologi touch neuron processer samt berøringsfølsomhed, som repræsenterer den adfærdsmæssige produktion af neuronal funktion. Endelig er en metode til at konstruere hypoxisk væksthuse bruge fælles køkken opbevaringsbeholdere beskrevet. Tilføjelsen af ​​en massestrøm styreenhed giver mulighed for ændringer, der skal foretages gasblandingen i de brugerdefinerede inkubatorer, og et cirkulerende vandbad giver mulighed for både temperaturkontrol og gør det nemt at identificere lækager. Denne metode giver en prisbilligt alternativ til kommercielttilgængelige enheder.

Introduction

C. elegans er en rundorm, der er blevet bredt vedtaget som en flercellet eukaryot model organisme siden indførelsen af Brenner ^1.. Det er en billig, enkel og alsidig model, der giver let forbindelser mellem genetiske ændringer og fænotypiske ændringer ^2.

Iskæmi er kendetegnet ved en mangel på næringsstoffer og ilt til et væv, efterfulgt af reperfusion, når en byge af reaktive oxygenspecies er produceret ³ og det meste af skaden opstår. I 2002 blev en model af iskæmi / reperfusion (IR) i C. elegans blev udviklet ⁴ involverer indsendelse af hele ormen for iltmangel, næringsstof afsavn og varmestress i ca 20 timer efterfulgt af 24 timer under normale forhold. Selv om denne model er teknisk en anoxia-sult (AS) tilstand, der opstår celledød gennem mekanismer, der er bevaret i pattedyr, herunder skader fremkaldt af oxidanter under reperfusion <sup> 5.. Endvidere ligner pattedyr IR, beskadigelse induceret af AS i C. elegans kan forhindres ved iskæmisk prækonditionering ^6,7 eller bedøvende prækonditionering ^8,9.

Protokollerne nedenfor viser, hvordan at efterligne IR i C. elegans vha. AS-modellen, hvordan at score morfologiske og adfærdsmæssige abnormiteter, der skyldes AS, og hvordan man kan tilpasse protokollen på en måde, der gør det muligt for forsøget skal udføres med en lavere initial investering ved hjælp af et skræddersyet, let-bygget alternativ kammer .

Protocol

1.. C. elegans Vækst

1. Forbered 35 mm nematodevækst Media (NGM) agarplader podet med OP50 bakterier, som pr standard dyrkningsmetoder ^1.
2. Synkronisere C. elegans ved at placere 6 drægtige voksne på en podet NGM plade. Fjern voksne efter ~ 100 æg er lagt (~ 3 timer).
3. Pladerne inkuberes i 3 dage ved 20 ° C, på hvilket tidspunkt orme vil have udviklet til unge voksne stadium og er optimale for dette eksperiment. Alternative protokoller at synkronisere C. elegans er beskrevet andetsteds ^10.

2. Materialer til AS

1. M9-puffer (22 mM KH _{2PO 4,} 42 mM Na ₂ HPO _4, 86 mM NaCI, 1 mM _MgSO4) bør renset for oxygen ved ækvilibrering med _N2 (argon kan også anvendes) i 30 minutter forud for forsøget og holdes omgivet af is.
2. Lav et lille hul (3 mmbred) i låget på 1,5 ml mikrocentrifugerør, hvor orme vil blive placeret i løbet af AS. Hullet giver mulighed for gasudveksling uden at holde låget åbent, da dette kan føre til overdreven medier fordampning.

3. Anoxia / Sult

1. Foretage alle forsøg i mindst tre eksemplarer.
2. Tilsæt 1 ml RT, iltet M9 buffer til hver 35 mm plade indeholdende unge voksne orme dyrket som beskrevet ovenfor. Vær omhyggelig med at undgå at fjerne bakterier fra pladen (tilføj M9 til kanterne, hvor bakterier ikke var seeded). Efter ~ 1 min orme skal svømme i M9.
3. Coat en 1 ml pipettespids med BSA ved pipettering og udstøde en steril 1% BSA-opløsning.
4. Hælder forsigtigt pladen indeholder orme i M9 buffer fjerne M9 fra det samme sted, hvor det blev tilføjet, og placer suspension i den forberedte mikrocentrifugerør. Lad hvile i is indtil ormene er faldet til bunden af ​​rørene (~ 1-2 Min.)
5. Fjern det maksimale beløb for M9 muligt uden at forstyrre orme fra røret (forlader omkring 100 ul) tilsættes 1 ml af den ilt-udrenset og iset M9 og placer røret over is indtil ormene afregne til bunden igen. Gentag det sidste trin 3x. I den sidste vask fjernes M9 indtil ~ 100 ul forbliver i røret.
6. Anbring glassene med orme i deoxygenated M9 inde et anoxisk / hypoxiske kammer (se vejledning nedenfor, punkt 3.6.1) eller alternativt i en brugerdefineret forseglet beholder (se vejledningen nedenfor, afsnit 3.6.2).
   1. Hvis en kommerciel anoxisk / hypoxiske kammer skal anvendes, nogen skyllet M9 inden i kammeret før start trin 3.5, og gentag trin 3.5, når ormene er inde i kammeret.
   2. Hvis en brugerdefineret kammer skal bruges, er en detaljeret beskrivelse af, hvordan du opretter et apparat billig fremlagt i slutningen af denne protokol, og er blevet beskrevet af en anden gruppe tidligere ^11. Kort fortalt: Lav to huller i en 250 ml Tupperware-typen container låg og tilføje rørkoblingerne til dem. Man vil blive anvendt til at injicere gas blandingen, mens den anden vil være gasudgangen i et vandbad.
   3. Placer orme ind i kammeret og forsegle kammeret ved hjælp af låget.
   4. Gas med en konstant _N2 flux (100 ml / min.)
   5. Beholderen anbringes i et vandbad ved 26 ° C. Sørg for, at exit røret er godt nedsænket i vand, så ingen luft tilbage, og at der ikke er utætheder i systemet (tilsyneladende af bobler som følge af selve kammeret).

Inkuber orme ved 26 ° C i 20 timer.

4.. Simuleret Reperfusion

1. Efter 20 timer under som betingelser, fjernes rørene fra rugekammeret i rumluften.
2. Pipette C. elegans med en BSA-overtrukket spids (som i trin 3.3) på en OP50 podet 35 mm NGM plade. Pladerne inkuberes ved 20 ° C i 24 timer.Efter dette, vil ormene være klar til at blive scoret.

5.. Identifikation Dead Versus levende orme

1. Ved hjælp af en platin pick, rører toppen af ​​hovedet af ormen. Levende orme vil bevæge sig baglæns efter at være blevet rørt. Hvis orme er nonresponsive, score som død. Lejlighedsvis vil en orm ikke bevæge sig baglæns, men kan udvise en svag side til side hoved bevægelse. Selvom det ikke er teknisk død, disse orme er næsten sikker på at udløbe inden for timer, og bør noteres som døde. Hvis man venter for længe med at score orme, kan intern udklækning af afkom forekomme, og disse "poser-of-orme" kan briste, hvilket gør påvisning slagtekroppene meget vanskeligt.
2. Fjern begge levende og døde orme fra pladen, da de tælles for at undgå dubletter tæller. De levende orme kan flyttes til en separat plade til at udføre adfærdsmæssige assays. Mængden af levende orme i forhold til den samlede repræsenteres som% af overlevende orme (figur 1A

6.. Anslagsfølsomhed Assay

1. En detaljeret beskrivelse af denne protokol er blevet præsenteret i Hart, Anne C., red. Behavior (3 juli 2006), WormBook, red. C. elegans Research Fællesskab WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
   1. At score til touch svar, identificerer orme, der bevæger og rører siden af ormen hoved (nær den midterste del af svælget) med en øjenvippe pick (Figur 3).
   2. Hvis ormen bevæger sig baglæns, score så lydhør, hvis ikke, score så nonresponsive (figur 1B). Gentag dette trin 10-15x for hver orm med 10 sec intervaller. Probe mindst 10 orme i hver gruppe til at have præcise data. Den samme analyse kan anvendes til at vurdere frem bevægelsesmæssigt ændringer efter lys touch til den bageste krop væg. Vær sikker på ikke at røre ved hovedet eller halen af ​​ormen, da dette stimulerer en særlig adfærd.
   3. Endeligvirksomhedernes genetisk kontrolstammer [N2 Bristol vildtype for positiv, mec (mechanosensory) mutant for negative - fx CB1338 mec-3 (e1338) IV] for at kalibrere den kraft, hvormed at røre orme. For barsk for en stimulering vil fremkalde en adfærdsmæssig reaktion i mec mutanter, for lidt, vil ikke fremkalde en effekt i vildtypeplanter N2 kontroller.

7.. Neuronale Ændringer

1. At visualisere indlæg AS neuronale ændringer, skal du bruge en stamme, der udtrykker GFP i touch-reagerer mec neuroner ^4,5. Disse neuroner har lange processer, der kører langs kroppen væg og er let scoret for morfologiske abnormiteter. Desuden kan morfologisk information integreres med adfærdsmæssige foranstaltninger af neuronal funktion, som beskrevet ovenfor. En stamme, der kan anvendes til dette formål er TU2583, som kan fås fra C. elegans Genetics Center og indeholder uIs25 integrerede transgen udtrykker GFP from MEC-18-promotoren, eller alternativt TU2562, som indeholder en integreret mec-3 :: GFP-fusion.
2. Forbered en agarose pad.
   1. Smelt 2% agarose i vand, bringe til 1x M9 med en 10x bestand og vedligeholde løsningen ved 70 ° C.
   2. Anbring en dråbe (~ 20 ul) af denne opløsning på et objektglas (25 mm x 75 mm), som er placeret mellem to andre dias, som hver har en enkelt stykke tape på deres nederste side.
   3. Placer en endelig objektglas vinkelret på den første oven på 2% agarose-opløsning og lad den afkøle ved stuetemperatur. Dette skulle danne en pude, der er tykkelsen af ​​båndet.
   4. Fjern det øverste dias og tilføje 10 ul M9 indeholdende 0,1% tetramisol, som vil immobilisere orme.
3. Flyt nogle (~ 10) live orme på 2% agarose dias. Placer et dækglas over dem og visualisere GFP ved hjælp af en fluorescens mikroskop under en 100X mål med passende belysning.
4. Beskadigetneuroner vil vise en streng cytosolisk membran af perler mønster i de processer, der består af flere punctum (figur 2A), og / eller abnormiteter, hvor processerne synes at være brudt (figur 2B). Tæl punctum og abnormiteter i både neuroner for hver orm anvendelse af i alt mindst 10 orme.

8.. Lab-made Hypoxic Afdeling

1. En Tupperware-stil, der kan forsegles, lufttæt beholder kan eftermontere som et anoxisk kammer. Vær omhyggelig med at vælge en beholder, der er så lille som muligt. En lille beholder skaber et hypoxisk miljø hurtigere og er nemmere at passe ind i vandbad (figur 4).
2. Lav to huller på låget (kan gøres med en skruetrækker eller ved opvarmning pincet og tvinger i låget), og indsætte et plast eller metal som passer i røret (figur 5A). Brug lim, der kan placeres under vand, og også får hårdt efter tørring, undgå bevægelse afstikket og dermed reducere muligheden for lækage (figur 5B).
3. Beholderen anbringes i et vandbad, således at den er neddykket fuldstændigt (figur 4). At fordybe beholderen, skal du bruge en flaske vægt eller en dykning vægt.
4. En af rørforbindelserne vil blive anvendt til at indføre en gasblanding og det andet rør vil fungere som en overtryksventil, og den bør derfor efterlades under vandet, så at beholderen er forseglet fra det ydre miljø (fig. 4).
5. Luften sammensætning kan moduleres ved hjælp af skræddersyede gas, massestrøm controllere eller ethvert apparat, der blander de ønskede gasser. Gasstrømmen bør kontrolleres, så højt flow kan skabe overdreven fordampning. For eksempel i en 250 ml beholder, vil 100 ml / min af gas giver god plads til orme og en egnet flux.
6. Længden af ​​slangen skal holdes på et minimum, da de kan være permeabelt for gas, enllowing indgangen O _2. Det er vigtigt at undgå at bruge silikone Tygon rør, da disse materialer er gennemtrængelig for gasudveksling. Vi foretrækker polypropylen eller nylon rør. Glas eller metalrør opretholde gasser godt, men er også sværere at arbejde med.

Representative Results

Udsættelse C. elegans til 20 hr AS ved 26 ° C i en brugerdefineret lab-made rugekammeret som beskrevet (afsnit 3.6.2) resulterede i betydelig dødelighed (figur 1A) ^5.. Efterfølgende fluorescerende billeddannelse af punctum og bryder i GFP mærket neuronale processer overlevende bekræftede tilstedeværelsen af morfologiske abnormiteter (figur 2). De overlevende reagerede også dårligt lys krop væg touch (figur 1B). Denne model er blevet brugt af flere grupper til at studere, hvordan genetisk disposition, farmaceutisk intervention og metaboliske plasticitet påvirker så afhængige resultater ^{4-6,8,9,12,13.}

Figur 1. C. elegans overlevelse og anslagsfølsomhed efterAS. A) Procentdel af orme, der udviser 24 timers post-AS overlevelse. N2 stammen er vildtype genetiske baggrund, og KWN85 indeholder en integreret transgen, som mærker MEC-neuroner med GFP. B) Respons at røre stimuli af levende C. elegans (N2 Strain) efter AS. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Touch neuron modifikationer efter AS. Touch neuron (PLML og PLMR) abnormiteter såsom snørklede processer og pauser (A) eller ophobning af GFP-aggregater i processerne (B) blev overvåget i overlevende bedøvet C. ele ans efter AS.

Figur 3. Øjenvipper pick. Et samlet øjenvipper pick. I det indsatte, en detalje af øjenvipper limet til tandstikker træ.

Figur 4.. Lab-made hypoxisk kammer inde i vandbad. En lukket beholder klar til at starte eksperimentet. Pile angiver gas indgang og udgang og flasken vægt anvendes til at holde det fra flydende.

231fig5.jpg "/>
Figur 5. Detaljer af indre og ydre side af beholderlåget. A) Ekstern side af beholderlåget angivelse røret og stikket er knyttet til den tidligere gjort hullet. B) ekstern side af beholderlåget, angiver rørforbindelsesled knyttet til tidligere fremstillet hul.

Discussion

AS har været meget anvendt i C. elegans til model IR skade. Nogle af de vigtigste punkter bør fremhæves for denne protokol: C. elegans er resistente over for en bred vifte af skader, der begrunder behovet for 3 samtidige fornærmelser (varme, sult og anoxi) for at opnå døden ved hjælp af dette system. Anoxia alene ikke dræbe orme i dette vindue af tid ^14. Desuden temperaturstigning er en ekstra stress, så det er vigtigt at føre nøje tilsyn. Strengt taget, er sult ikke bidrage væsentligt til den grad af dødelighed observeret ^7, per se, men det ser ud til at reducere variabilitet blandt eksperimentelle gentagelser. I betragtning af at der kan være betydelige variationer fra dag-til-dag, er det ekstremt vigtigt at sammenligne prøver køres direkte parallelt, og at gentage eksperimenter over flere dage. Generelt er resultaterne målt for tre særskilte plader 50-100 orme / eksperimentel betingelse og det er dissen gennemsnit og betragtes som en enkelt eksperimentel kopiere. Generelt mellem syv og ni gentagelser synes at være tilstrækkelig til at opnå eller udelukke statistisk signifikans.

Udviklingsstadium orme, der anvendes i forsøget skal også overvåges nøje, da modtagelighed forskellige stadier til AS skader varierer betydeligt ^15,16. Anvendelsen af ​​unge voksne er standard, og larvestadiet (L3 og L4) orme synes at være mere resistente over for de skadelige virkninger af AS (upublicerede data).

Denne protokol præsenterer to måder at udføre forsøgene, den ene med en lab-fremstillet apparat (ved hjælp af Tupperware-type containere og gas input ¹¹⁾ og andre ved hjælp af en kommerciel hypoxisk kammer ^4,6. Anoxia kan opnås med andre midler, der forbruger ilten, som beskrevet andetsteds ^13,17. Brugen af ​​alternative teknikker til at skabe et hypoxisk miljø kan ændre AS inkubationstiden nødvendigfor at skabe den ønskede mængde af død. Målretning ~ 20% overlevelse er et ideelt udgangspunkt for at studere beskyttende indgreb, mens 80% er ligeledes ideel til interventioner, som forværrer de skadelige virkninger af AS. Et andet vigtigt forbehold er det tidspunkt, hvor observatøren scorer døde / levende orme. Hvis tid til analyse forlænges ud over 24 timer, kan dataene være misvisende, da døde orme bliver stadig vanskeligere at identificere. Dette kan skyldes orm kroppe blive relativt transparente over tid, men også det faktum, at befrugtede embryoner kan udvikle sig til afkom post mortem indersiden af ​​slagtekroppe og forstyrre dem som de opstår.

Analysen af neuronal morfologi kan modificeres til at se på protein ekspressionsmønstre ^18, nuklear fragmentering ⁴ og andre parametre ¹⁹ ved at substituere en orm stamme, der udtrykker den passende genetisk kodet markør. En sidste advarsel er, at visualiseringen afneuronale processer skal foregå mindre end 30 minutter efter at placere orme på diaset. Dyr, der holdes under anæstesi på dias i længere perioder kan udvise AS-uafhængig skader. Juster mængden af ​​dyr pr slide i henhold til den nødvendige tid til at spore og analysere dem.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2  strain	CGC		Wild type strain. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)	CGC	TU2583	integrated fluorescent transgene used to label touch neurons. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
CB1338 mec-3 (e1338)IV	CGC	CB1338	canonical mec-3 mutant that is touch insensitive. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
Microcentrifuge Tube	Eppendorf	0030 120.086
Nikon Eclipse TE2000-U Microscope	Nikon USA	TE2000-U
Low Temperature Incubator	Sheldon Manufacturing Inc.	Model 2005
Eyelash Pick			An eyelash pick can be prepared by attaching  an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3).
Hypoxic Chamber	Coy	8307030	Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.