En Anoxia-svält modell för ischemi / reperfusion i Published: March 11, 2014 doi: 10.3791/51231

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Bruno B. Queliconi¹, Alicia J. Kowaltowski¹, Keith Nehrke²

¹Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, ²Department of Medicine, Nephrology Division, University of Rochester Medical Center, School of Medicine and Dentistry

Summary

Ett protokoll beskrivs som använder syrebrist / svält i C. elegans att modellera ischemi / reperfusion. Funktionella resultat är ökad dödlighet, synliga avvikelser i GFP-märkta neuronala processer, och nedsatt beteendemässiga reaktioner som kräver neuronal funktion.

Abstract

Protokoll för syrebrist / svält i genetisk modell organism C. elegans simulera ischemi / reperfusion. Maskar är separerade från bakteriell mat och placeras under syrebrist i 20 timmar (simulerad ischemi), och därefter flyttat till en normal atmosfär med mat (simulerad reperfusion). Denna experimentella paradigm leder till ökad död-och nervskador, och tekniker presenteras för att bedöma organismen livskraft, förändringar av morfologi av beröring neuron processer, samt anslagskänslighet, som representerar beteende produktionen av neuronal funktion. Slutligen är en metod för att konstruera hypoxiska inkubatorer i behållare, kök gemensamt lagrings beskrivas. Tillsatsen av en flödesreglermassenhet tillåter ändringar som skall göras i gasblandningen i de anpassade inkubatorer och ett cirkulerande vattenbad möjliggör både temperaturkontroll och gör det enkelt att identifiera läckor. Denna metod ger ett billigt alternativ till kommersiellatillgängliga enheter.

Introduction

C. elegans är en nematod som har fått stor spridning som en flercellig eukaryot modellorganism sedan introduktionen av Brenner ^1. Det är en billig, enkel och mångsidig modell, som möjliggör enkla kopplingar mellan genetiska förändringar och fenotypiska förändringar ^2.

Ischemi kännetecknas av en brist på näringsämnen och syretillförseln till en vävnad, följt av reperfusion, när en skur av reaktiva syrespecies produceras ³ och de flesta av de skador som uppstår. År 2002, en modell av ischemi / reperfusion (IR) i C. elegans utvecklades ⁴ som innebär att lämna in hela masken till syrebrist, näringsämnen deprivation och värmestress för cirka 20 timmar följt av 24 timmar under normala förhållanden. Även denna modell är tekniskt en syrebrist-svält (AS) tillstånd, uppstår celldöd genom mekanismer som är bevarade i däggdjur, inklusive skador orsakade av oxidanter under reperfusion <sup> 5. Vidare liknar däggdjurs IR, skada inducerad av AS i C. elegans kan förhindras genom ischemisk prekonditionering ^6,7 eller bedövningsmedel preconditioning ^8,9.

Protokollen nedan visar hur man efterlikna IR i C. elegans med hjälp av AS-modellen, hur man gör mål morfologiska och beteendeavvikelser som beror på AS, och hur man anpassar protokollet på ett sätt som gör att försöket skall genomföras med en lägre initial investering med hjälp av en skräddarsydd, lätt-konstruerad kammar alternativ .

Protocol

1. C. elegans Tillväxt

1. Förbered 35 mm Nematode Growth Media (NGM) agarplattor ympats med OP50 bakterier, som per standardodlingsmetoder ^1.
2. Synkronisera C. elegans genom att placera sex gravida vuxna på en ympad NGM platta. Ta bort de vuxna efter ~ 100 ägg har lagts (~ 3 tim).
3. Inkubera plattorna i 3 dygn vid 20 ° C, vid vilken punkt maskarna kommer att ha utvecklats till unga vuxna stadium och är optimala för detta experiment. Alternativa protokoll för att synkronisera C. elegans beskrivs på annan plats ^10.

2. Material för AS

1. M9 buffert (22 mM KH ₂ PO _4, 42 mM Na ₂ HPO _4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO ₄₎ bör rensas från syre genom jämvikt med _N2 (argon kan också användas) under 30 minuter före experimentet och hålls omgiven av is.
2. Gör ett litet hål (3 mmbred) i locket på 1,5 ml mikrorör i vilket maskarna kommer att placeras under AS. Hålet tillåter gasutbyte utan att hålla locket öppet, eftersom det kan leda till överdriven media avdunstning.

3. Anoxi / Svält

1. Utför alla experiment i minst tre exemplar.
2. Tillsätt 1 ml RT, syre M9 buffert till varje 35 mm platta med unga vuxna maskar som odlas enligt ovan. Var noga med att undvika att ta bort bakterier från plattan (lägg M9 till kanterna där bakterier inte var seedade). Efter ~ 1 min maskarna ska simma i M9.
3. Coat en 1 ml pipettspets med BSA genom pipettering och uttömning av en steril 1% BSA-lösning.
4. Försiktigt luta plattan innehåller maskar i M9 buffert, ta bort M9 från samma ställe där den tillsattes, och placera suspensionen i de förberedda mikrocentrifugrör. Låt vila i is tills maskarna har sjunkit till botten av rören (~ 1-2 Minuter).
5. Ta den maximala mängden M9 möjligt utan att störa maskarna från röret (lämnar runt 100 l), tillsätt 1 ml av syreenad och iskallt M9 och placera röret på is tills maskarna sjunka till botten igen. Upprepa det sista steget 3x. I den sista tvätten, ta bort M9 till ~ 100 l kvar i röret.
6. Placera rören med maskar i deoxigenerad M9 inne en anoxisk / hypoxisk kammare (se instruktionerna nedan, avsnitt 3.6.1) eller, alternativt, i en anpassad förseglad behållare (se instruktioner nedan, avsnitt 3.6.2).
   1. Om en kommersiell anoxiska / hypoxiska kammare ska användas, lämna lite rensas M9 inne i kammaren innan steg 3,5 och upprepa steg 3,5 när maskarna är inne i kammaren.
   2. Om en anpassad kammare ska användas, är en detaljerad beskrivning av hur man skapar en billig apparat som presenteras i slutet av detta protokoll och har beskrivits av en annan grupp som tidigare ^11. I korthet: Gör två hål i ett lock 250 ml Tupperware-typ behållare och lägga rör kopplingar till dem. En kommer att användas för att injicera gasblandningen medan den andra kommer att vara gasutgången i ett vattenbad.
   3. Placera maskar in i kammaren och försegla kammaren med hjälp av locket.
   4. Gas med en konstant N ₂ flöde (100 ml / min).
   5. Placera behållaren i ett vattenbad vid 26 ° C. Se till att utloppsröret är väl nedsänkt i vatten så inga luft avkastning och att det inte finns några läckor i systemet (sken av bubblor som uppstår från kammaren själv).

Inkubera maskarna vid 26 ° C under 20 timmar.

4. Simulerad Reperfusion

1. Efter 20 timmar i AS förhållanden, ta bort rören från inkubationskammaren in i rumsluften.
2. Pipett C. elegans med en BSA-belagd spets (som i steg 3.3) på en OP50 seedad 35 mm NGM tallrik. Inkubera plattorna vid 20 ° C under 24 timmar.Efter detta kommer maskarna vara redo att göras.

5. Identifiera Dead Versus Live Worms

1. Med hjälp av en platina plocka, lätt på hjässan av masken. Levande maskar kommer att gå bakåt efter beröring. Om maskarna är inte svarar, poäng som död. Ibland kommer en mask inte röra sig bakåt, men kan uppvisa en liten sida-till-sida-huvudrörelse. Även om det inte är tekniskt död, dessa maskar är nästan säker på att löpa ut inom några timmar, och bör antecknas som döda. Om man väntar för länge med att göra mål maskar, kan intern kläckning av avkomma inträffa och dessa "påsar-av-maskar" kan spricka, vilket gör att upptäcka slaktkroppar mycket svårt.
2. Ta bort både levande och döda maskar från plattan eftersom de räknas för att undvika dubbla räkningar. De levande maskar kan flyttas till en separat plåt för att utföra beteendeanalyser. Mängden levande maskar i förhållande till totalt representeras som% överlevande maskar (Figur 1A

6. Anslagskänslighet Assay

1. En detaljerad beskrivning av detta protokoll har presenterats i Hart, Anne C, ed. Behavior (3 juli 2006), WormBook, ed. The C. elegans Research Community, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org.
   1. Att göra mål för anslagskänslighet, identifiera maskar som rör sig och lätt på sidan av masken huvud (nära den mellersta delen av svalget) med en ögonfrans hacka (Figur 3).
   2. Om masken rör sig bakåt, göra så lyhörd, om inte, gör så nonresponsive (Figur 1B). Upprepa steg 10-15x för varje mask med 10 sek intervall. Probe minst 10 maskar i varje grupp för att få korrekta uppgifter. Samma analys kan användas för att bedöma framåt motoriskt förändringar efter lätt beröring till den bakre kroppsväggen. Se till att inte röra huvudet eller svansen av masken, eftersom detta stimulerar ett distinkt beteende.
   3. Slutligen, iföretagens stammar genetisk kontroll [N2 Bristol vildtyp för positiv, mec (mechanosensory) mutant för negativ - t.ex. CB1338 mec-3 (e1338) IV] för att kalibrera den kraft med vilken röra maskarna. För hård för en stimulans kommer framkalla en beteendesvar på MEC mutanter, för lite kommer inte att framkalla en effekt i vildtyp N2 kontroller.

7. Neuronal Modifieringar

1. Att visualisera inlägget AS neuronala modifieringar, använd en stam som uttrycker GFP i touch-svarar mec nervceller ^4,5. Dessa nervceller har långa processer som löper längs kroppen väggen och är ett enkelt mål för morfologiska abnormiteter. Dessutom kan den morfologiska informationen integreras med beteendemätningar av neuronal funktion, såsom beskrivits ovan. En stam, som kan användas för detta ändamål är TU2583, som är tillgänglig från C. elegans Genetics Center och innehåller uIs25 integrerad transgen uttrycker GFP tillbakam den mec-18 promotorn, eller alternativt TU2562, som innehåller en integrerad mec-3 :: GFP fusion.
2. Förbered en agaros pad.
   1. Smält 2% agaros i vatten, ta med till 1x M9 med en 10x lager, och underhålla lösningen vid 70 ° C.
   2. Placera en droppe (~ 20 | il) av denna lösning på ett objektglas (25 mm x 75 mm) som har placerats mellan två andra bilder, var och en av vilka har en enda tejpremsa på sin undersida.
   3. Placera en slutlig glasskiva vinkelrät mot den första på toppen av agaroslösningen 2%, och låt den svalna till RT. Detta bör bilda en dyna som är tjockleken hos bandet.
   4. Ta bort den översta bilden och lägga till 10 l av M9 innehållande 0,1% tetramisol, vilket kommer att immobilisera maskar.
3. Flytta en del (~ 10) levande maskar på 2% agaros slide. Placera ett täckglas över dem och visualisera GFP med hjälp av en fluorescensmikroskop under 100X objektiv med lämplig belysning.
4. Skadadenervceller kommer att visa ett cytosoliskt membran pärlband mönster i de processer, som består av multipel punctum (figur 2A), och / eller abnormiteter där processerna förefaller brytas (Figur 2B). Räkna punctum och avvikelser i både nervceller för varje mask, med hjälp av sammanlagt minst 10 maskar.

8. Lab-tillverkade hypoxisk avdelningen

1. En Tupperware-stil, förslutningsbar, lufttät behållare kan eftermonteras som en anoxisk kammare. Var noga med att välja en behållare som är så liten som möjligt. En liten behållare skapar en hypoxisk miljö snabbare och är lättare att passa i vattenbadet (Figur 4).
2. Gör två hål på locket (kan göras med en skruvmejsel eller genom upphettning av pincett och tvingar i locket) och sätt i en plast-eller metallkontakt som passar i slangen (Figur 5A). Använd lim som kan placeras under vatten, och dessutom blir hårt efter torkning, undvika rörelsekontaktdonet och därmed minskar risken för läckage (Figur 5B).
3. Behållaren bör placeras i vattenbadet så att den är nedsänkt helt (Figur 4). För att fördjupa behållaren, använd en flaska vikt eller en dykning vikt.
4. En av anslutningarna röret kommer att användas för att införa en gasblandning och det andra röret kommer att fungera som en tryckavlastnings, varför det bör lämnas under vattnet så att behållaren är avtätad från den yttre miljön (Figur 4).
5. Luften kompositionen kan moduleras genom att använda specialtillverkade gas, massflödes-kontrollorgan eller någon anordning som blandar de önskade gaserna. Gasflödet skall styras, så högt flöde kan skapa överdriven avdunstning. Till exempel, i en 250 ml behållare, kommer att 100 ml / min av gas ger bra utrymme för maskar och ett lämpligt flussmedel.
6. Längden av röret skall hållas till ett minimum, eftersom de kan vara genomträngligt för gas, enllowing ingången O _2. Det är viktigt att undvika att använda silikon, rör Tygon eftersom dessa material är permeabelt för gasutbyte. Vi föredrar polypropen eller nylon-rör. Glas-eller metallrör bibehålla gaserna väl, men är också svårare att arbeta med.

Representative Results

Utsätta C. elegans till 20 h av AS vid 26 ° C i en anpassad lab gjorda inkubationskammaren såsom beskrivits (avsnitt 3.6.2) resulterade i betydande dödlighet (figur 1A) ^5. Efterföljande fluorescerande avbildning av punctum och avbrott i GFP märkt neuronala processer överlevande bekräftade förekomsten av morfologiska abnormaliteter (Figur 2). De överlevande svarade också dåligt för ljus kroppen väggen touch (Figur 1B). Denna modell har använts av flera grupper för att studera hur genetiska anlag, läkemedels-ingripanden, och metabola plasticitet påverkar AS beroende utfall ^{4-6,8,9,12,13.}

Figur 1. C. elegans överlevnad och anslagskänslighet efterAS. A) Procent av maskar som uppvisar 24 h efter AS överlevnad. Den N2 stammen är den vilda typen genetisk bakgrund, och KWN85 innehåller en integrerad transgen som märker MEC nervceller med GFP. B) Svar röra stimuli av levande C. elegans (N2 Strain) efter AS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Peka neuron ändringar efter AS. Touch neuron (PLML och PLMR) störningar såsom slingrande processer och raster (A) eller ansamling av GFP aggregat i processerna (B) övervakades i överlevande bedövade C. elegans ans efter AS.

Figur 3. Frans plockning. En sammansatt ögonfrans plocka. I inlägg, en detalj av ögonhår limmas på tandpetare trä.

Figur 4. Lab-tillverkade hypoxisk kammare inne i vattenbad. En sluten behållare redo att starta experimentet. Pilar indikerar gas in-och utgång och flaskan vikt som används för att hålla den från att flyta.

231fig5.jpg "/>
Figur 5. Detaljer för den inre och yttre sidan av behållarlocket. A) Yttre sida av behållarlocket, vilket indikerar röret och dess kontakt fäst vid det tidigare gjorda hål. B) Extern sidan av behållarlocket, vilket indikerar slangförbindningen fäst vid det tidigare gjorda hål.

Discussion

AS har använts i stor utsträckning i C. elegans att modellera IR skada. Några viktiga punkter bör betonas att detta protokoll: C. elegans är resistenta mot ett brett spektrum av skador, som motiverar behovet av 3 samtidiga förolämpningar (värme, svält och anoxi) för att åstadkomma död med hjälp av detta system. Anoxi ensam inte döda maskar i detta tidsfönster ^14. Vidare är temperaturhöjningen en ytterligare stress, så det är viktigt att noggrant övervaka. Strängt taget innebär svält inte signifikant bidrar till graden av mortalitet ^7, per se, men det verkar att minska variationen bland experimentella replikat. Med tanke på att det kan finnas betydande variation från dag till dag, är det oerhört viktigt att jämföra prover körs direkt parallellt, och att upprepa experiment över flera dagar. I allmänhet är resultaten mäts för tre separata plattor av 50-100 maskar / experimentell skick och det är den genomsnitt och betraktas som en enda experimentell replikera. Generellt, mellan sju och nio replikat verkar vara tillräckligt för att uppnå eller utesluta statistisk signifikans.

Utvecklingsstadiet av maskarna som används i experimentet måste också följas noggrant eftersom känsligheten för olika stadier till AS skador varierar kraftigt ^15,16. Användningen av unga vuxna är standard, och larvstadiet (L3 och L4) maskar verkar vara mer motståndskraftiga mot de skadliga effekterna av AS (opublicerade data).

Detta protokoll utgör två sätt att utföra experiment, en med en lab-made apparater (med Tupperware-typ behållare och gas ingång ¹¹⁾ och andra med hjälp av en kommersiell hypoxisk kammare ^4,6. Syrebrist kan uppnås med andra medel som förbrukar syre, som beskrivs på annan plats ^13,17. Användningen av alternativa metoder för att skapa en hypoxisk miljö kan förändra AS inkubationstid nödvändigför att skapa den önskade mängden dödsfall. Inriktning ~ 20% överlevnad är en idealisk utgångspunkt för att studera skyddsinsatser, medan 80% är lika perfekt för interventioner som förvärrar de skadliga effekterna av AS. Ett annat viktigt förbehåll är den tid vid vilken observatören tjog döda / levande maskar. Om tiden för analysen förlängas efter 24 timmar, kan uppgifterna vara missvisande eftersom döda maskar blivit allt svårare att identifiera. Detta kan bero på masken slaktkroppar blir relativt transparent över tid, men också på det faktum att befruktade embryon kan utvecklas till avkomma efter slakt insidan av slaktkroppar och störa dem när de dyker upp.

Analysen av neuronal morfologi kan modifieras för att titta på proteinuttrycksmönster ^18, nukleär fragmentation ⁴ och andra parametrar ¹⁹ genom substitution av en mask-stam som uttrycker den lämpliga genetiskt kodad markör. En sista varning är att visualisering avneuronala processerna bör göras mindre än 30 minuter efter att placera maskarna på bilden. Djuren hålls under narkos på diabilder under längre perioder kan uppvisa AS oberoende skador. Justera mängden djur per slide efter den tid som behövs för att spåra och analysera dem.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2  strain	CGC		Wild type strain. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)	CGC	TU2583	integrated fluorescent transgene used to label touch neurons. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
CB1338 mec-3 (e1338)IV	CGC	CB1338	canonical mec-3 mutant that is touch insensitive. http://www.cbs.umn.edu/CGC/
Microcentrifuge Tube	Eppendorf	0030 120.086
Nikon Eclipse TE2000-U Microscope	Nikon USA	TE2000-U
Low Temperature Incubator	Sheldon Manufacturing Inc.	Model 2005
Eyelash Pick			An eyelash pick can be prepared by attaching  an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3).
Hypoxic Chamber	Coy	8307030	Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller.