Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Published: May 1, 2014 doi: 10.3791/51266
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 4,5,6, 1,7, 1,8
1Department of Orofacial Sciences and Program in Craniofacial and Mesenchymal Biology, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 3Department of Pathology and Research Center, Zhongshan Hospital of Dalian University, 4Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, UMR S872, 5Centre de Recherche des Cordeliers, Université Pierre et Marie Curie, UMR S872, 6INSERM U872, 7Division of Endodontics, Department of Preventive and Restorative Dental Sciences, University of California, San Francisco, 8Department of Pediatrics and Institute for Human Genetics, University of California, San Francisco

Summary

يوفر القاطعة الماوس تزايد مستمر نموذجا لدراسة تجديد أنسجة الأسنان من الخلايا الجذعية الظهارية الأسنان (DESCs). وتفيد التقارير ان نظام قوي للباستمرار وبشكل موثوق الحصول على هذه الخلايا من القاطعة وتوسيعها في المختبر هنا.

Abstract

فهم الآليات الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء تجديد الأسنان والتجديد أصبح موضوع اهتمام كبير 1-4، ويوفر الماوس القاطعة نموذجا لهذه العمليات. هذا الجهاز الرائع تنمو باستمرار طوال حياة الحيوان ويولد كل أنواع الخلايا اللازمة من أحواض نشطة من الخلايا الجذعية البالغة يضم في الشفة (الشفة نحو) واللغات (نحو اللسان) حلقة عنق الرحم (CL) المناطق. فقط الخلايا الجذعية الأسنان من CL شفوي تؤدي إلى خلايا تكوين المينا التي تولد المينا، والغطاء الخارجي للأسنان، على سطح شفوي. هذا التشكيل المينا غير المتماثلة يسمح التآكل في الطرف القاطعة، والأسلاف والخلايا الجذعية في القاطعة الداني ضمان أن أنسجة الأسنان تتجدد باستمرار. القدرة على عزل وزراعة هذه الخلايا الاصلية أو الجذعية في المختبر يسمح توسعها وتفتح الأبواب أمام العديد من التجارب لا يمكن تحقيقه في الجسم الحي، مثل حIGH اختبار الإنتاجية من العوامل التنظيمية الخلايا الجذعية المحتملة. هنا، نحن تصف ويبرهن على وجود طريقة موثوقة ومتسقة لخلايا الثقافة من CL شفوي من القاطعة الماوس.

Introduction

واحدة من الخصائص الفريدة من الفقاريات هو تطور الأسنان. أصبح الأسنان نظام نموذجا هاما للمناطق عديدة من البحث، حيث تم التحقيق في المسارات الجزيئية والمورفولوجية التخصصات ذات الصلة لهذا الجهاز من عدة زوايا، بما في ذلك علماء البيولوجيا التطورية والتطورية 5. وفي الآونة الأخيرة، بدأ مجال الطب التجديدي للحصول على معلومات قيمة باستخدام الأسنان كنموذج. على وجه الخصوص، وقد تم اكتشاف الخلايا الجذعية الظهارية الأسنان تقدما هاما 6-13.

جميع القوارض تمتلك القواطع تزايد مستمر الذي يغذيه نمو الخلايا الجذعية، مما يجعل هذه الأسنان نظام نموذج الوصول إليها لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية للبالغين. ، وقد أثبتت التجارب وضع العلامات في 1970s 10،11، تليها النسب الوراثية التجارب التي تتبع 8،9،12،14 DESCs يقيمون في المنطقة القريبة من القاطعة. جذعذرية خلية في مقصورة الظهارية على هذه الخطوة الجانب شفوي من مكانة المفترضة، والمعروفة باسم حلقة عنق الرحم شفوي (CL)، والمساهمة في السكان من الخلايا تسمى (TA) العبور تضخيم الخلايا (الشكل 1). على وجه التحديد، DESCs يقيمون في ظهارة الخارجي المينا (OEE) وشبكية النجمية (SR) 8،9،14، والمينا ظهارة الداخلية (IEE) يثير الخلايا TA التي تقدم من خلال عدد محدود من دورات الخلية ثم الخطوة بشكل أقصى طول طول القاطعة (الشكل 1). تواصل خلايا تكوين المينا التفريق في القاطعة الماوس للتحرك بشكل أقصى طول القاطعة بمعدل ملحوظ من حوالي 350 ميكرومتر في يوم واحد 15،16. لأنها تتحرك، فإن الخلايا تتمايز إلى خلايا تكوين المينا ناضجة والطبقة intermedium (SI) الخلايا. بعد إيداع كامل سماكة المينا المصفوفة، فإن العديد من خلايا تكوين المينا الخضوع لموت الخلايا المبرمج، والخلايا المتبقية في تقليص حجم وتنظيم نضوج المينا <سوب> 17. سلالة من أنواع الخلايا الأخرى في CL شفوي، مثل SR، هو أقل وضوحا، والبيانات المتعلقة الخلايا الجذعية في اللحمة المتوسطة 18 و CL في اللغات ليست سوى بداية في الظهور.

باستخدام نموذج القاطعة الماوس، عملت عدد من المجموعات لتوضيح مسارات الجينية والعمليات البيولوجية الخلايا الجذعية تشارك في تجديد الجهاز القائم على الخلايا الطبيعية. ومع ذلك، فإن CL شفوي يحتوي على عدد قليل نسبيا من الخلايا، تشير التقديرات إلى أن حوالي 5،000 في القاطعة الماوس، مما يجعل العمل مع الخلايا الأولية التحدي. لذلك، بذلت جهود للثقافة وتوسيع هذه الخلايا في المختبر 6،16،19،20 من أجل فتح أبواب جديدة للمناهج التجريبية التي ليست قابلة للتحقيق في الجسم الحي. وقد أظهرت الدراسة الأخيرة أن هذه الخلايا يمكن أن كلا تجديد الذات والتمايز إلى أميلوجينين معربا عن الخلايا عند مثقف 13. هنا، نحن تصف ويبرهن على وجود طريقة لالالبريد ثقافة موثوقة ومتسقة من الخلايا من شفوي الماوس CL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تشريح السفلى هيمي-الفك السفلي من الكبار ماوس

  1. قبل تنفيذ هذا البروتوكول، والحصول على موافقة المؤسسية اللازمة والتأكد من الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان. الموت ببطء الحيوان باستخدام معيار وافق IACUC الإجراءات. لهذا العمل كان يستخدم CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم.
    1. اختياري: رئيس منفصلة عن بقية الجسم باستخدام شفرة حلاقة.
  2. إزالة الجلد من الشفة السفلى لمستوى خط الرقبة.
  3. باستخدام مشرط، وجعل شق بين اثنين من القواطع السفلية، والتي ترتبط بشكل فضفاض. عند الضغط سيتم تقسيم الفك السفلي إلى نصفين.
  4. إسفين مشرط بين اللقمة من الفك ومفصل الفك الصدغي وقطع جنبا إلى جنب مع العضلات الفك لفصل الفك.
  5. إزالة جميع العضلات والأوتار، والأربطة حتى يبقى سوى العظام.

2. عزل القاطعة

  1. باستخدام مشرط رقم 15، يحلق بعناية قبالة العظام في زاوية 45 درجة من النهاية البعيدة للنهاية القريبة من المنطقة الغشائية. استخدام غيض من مشرط لاختيار بعيدا أي العظام المتبقية بما في ذلك شظايا العظام عند الحافة. تبدأ ببطء لالتقاط بعيدا في لوحة القشرية اللغات للفك السفلي، بدأت للتو تحت الرحى الثالثة 3.
  2. تستمر حتى القاطعة نظيفة، والعمل بعناية تجاه المنطقة التي تحتوي على CL.
  3. إزالة حزمة الأعصاب السنخية السفلية.
  4. اجراء خفض نظيفة لإزالة الأولى العظام والأنسجة الأقرب إلى CL.
  5. اجراء خفض الثانية بشكل أقصى مع مشرط، تقريبا تحت الرحى الثانية 2. ثم يتم تشريح المنطقة القريبة القاطعة للخروج عن طريق إدراج مشرط بين العظام والسطح الإنسي من القاطعة الداني. هذا يجب أن يتم بعناية، حتى لا تمزق الأنسجة. الحركة شق الداني القاصي-.
    الخطوة البديلة:
    إزالة أكبر قدر ممكن العظام على طول المنطقة فوق طncisor. مرة واحدة يتم مسح المنطقة، وإزالة بعناية القاطعة بأكمله باستخدام حجم 5 ملقط للتعامل مع جزء المينا الأقرب إلى المنطقة CL.
  6. وضع الأنسجة تشريح (CL إما معزولة كما في الشكل 3E، أو القاطعة بأكملها كما هو الحال في البديل الخطوة 2.5) في 2٪ كولاجيناز في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 3-4 ساعة في 4 درجات مئوية في لوحة التقيد منخفضة. ل1-10 القواطع، استخدم 100 ميكرولتر لكل بئر في لوحة 12 جيدا. لأكبر من 10 القواطع، استخدم 500 ميكرولتر لكل بئر في أدنى مستوى 6 جيدا لوحة الالتزام.

3. Microdissect في عنق الرحم حلقة شفوي

  1. إزالة المنطقة CL من كولاجيناز ومكان في وسائل الاعلام DMEM/F12 الباردة.
  2. برفق في الطرف الأدنى من CL باستخدام ملقط حجم 5 أو حقنة الأنسولين (1 سم مكعب، 28 G ½)؛ سوف اللحمة المتوسطة ينهار بينما يبقى ظهارة سليمة. سوف CL وظهارة المجاورة التي تمتد أفقيا كهيكل "الجناحين مثل" تكون مرئية.
  3. نزعبرعم قمية من ظهارة المجاورة عن طريق إجراء شق على شكل حرف V على جانبي، ووضع على الفور في DMEM/F12 الباردة على الجليد.
  4. أكرر لجميع CLS، وجمع في 1.5 مل microfuge أنبوب.
  5. تدور باستمرار microfuge أنبوب مع العينات، وإزالة وسائل الإعلام، مع استبدال 100 ميكرولتر حل مفرزة الخلية.
  6. احتضان الأنسجة في حل مفرزة خلية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  7. فصل الأنسجة لإنتاج تعليق خلية واحدة بواسطة pipetting بلطف صعودا وباستخدام 1،000 ميكرولتر المنخفضة التصاق ماصة أسفل. يمكن أيضا أن توضع الخلايا من خلال مصفاة الخلية العقيمة لتحقيق التفكك.
  8. عد الخلايا مع عدادة الكريات، لوحة من البلاستيك على زراعة الأنسجة أو المواد المطلوبة الأخرى.

4. الثقافة الابتدائية من DESCs

  1. خلايا لوحة في لوحة 6 جيدا في 1-6 × 10 4 خلية / مل في وسائل الإعلام DESC، والذي يتألف من DMEM/F12 تستكمل مع الماوس EGF المؤتلف البروتين بتركيز 20 نز / مل، جمعية جيل المستقبل المؤتلف البروتين بتركيز 25 نانوغرام / مل، 1X B27 الملحق، و 1٪ حل المضادات الحيوية (البنسلين، و 100 U / مل، الستربتوميسين، 50 ميكروغرام / مل).
  2. تنمو الخلايا مطلي على لوحة 6 جيدا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 في 1 مل من DESC سائل الإعلام. لا تخل الثقافات الأولية لمدة 5 أيام بعد الطلاء للسماح التصاق الخلايا وتشكيل مستعمرة.
  3. لتغير وسائل الإعلام الأولى، يستعاض عن نصف حجم (500 ميكرولتر) من وسائل الإعلام القديمة مع نصف حجم (500 ميكرولتر) من وسائل الإعلام الجديدة. تحقق المستعمرات تحت المجهر عند تغيير وسائل الإعلام.
  4. بعد التغيير الأول وسائل الإعلام، والاستمرار في تغيير وسائل الإعلام (1-2 مل) كل يوم 2. تحقق المستعمرات تحت المجهر عند تغيير وسائل الإعلام.

5. DESCs الممر

  1. وسائل الاعلام نضح وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 3x أخرى قبل تحسنت.
  2. إضافة قبل تحسنت 0.25٪ التربسين EDTA-في محلول ملحي واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة لDESCs إلى فصل.
  3. إضافة وسائط DESC لتحييد التربسين، ماصة بلطف على طول لوحة زراعة الأنسجة لجمع الخلايا، ومكان في أنبوب 15 مل المخروطية.
  4. تدور باستمرار الخلايا في 800 x ج لمدة 2 دقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتضم الماوس نصفي الفك السفلي واحد تزايد مستمر القاطعة وثلاثة الأضراس الجذور (الشكل 1A). تتكون جميع الأسنان من عاج والمينا، واثنين من المكونات المعدنية للتاج الأسنان (أرقام 1A 1A و'). المنازل القاطعة اثنين من محاريب الخلايا الجذعية تسمى CL شفوي واللغات CL، ويتم تشكيل المينا حصرا على الجانب شفوي (الشكل 1A). DESCs هي المسؤولة عن تشكيل القاطعة المينا ويسكنون في CL شفوي، وتحديدا OEE وSR (الشكل 1A'') 8،9. يحتوي على CL شفوي أيضا التقييم الخارجي المستقل، والخلايا TA، وSI (الشكل 1A''). وتركز أسلوبنا على تشريح وعزل DESCs من CL شفوي (الشكل 1A''). يصادف Krt14-أكتين GFP جميع الخلايا المشتقة الظهارية للنصفي الفك السفلي (الشكل 1B)، وCL شفوي يمكن رؤيتها بوضوح ترولاف الفك السفلي (الشكل 1B "، السهم الأبيض). تجدر الإشارة إلى أن جميع أنواع الخلايا يمكن تحديدها بموجب أعلى التكبير (قارن أرقام 1A 'وباء'').

وتتلخص إجراءات لعزل DESCs من CL شفوي في الشكل 2. لفترة وجيزة، تتم إزالة نصفي الفك السفلي الأول من الحيوان، تتم إزالة العظام الفك السفلي لفضح CL شفوي، ومن ثم يتم التعامل مع CL شفوي مع كولاجيناز ل فصل ظهارة من اللحمة المتوسطة المحيطة بها. وmicrodissected في CL، وتعامل مع العازلة تفارق الخلية، ومطلي في لوحات زراعة الأنسجة. فصل CL شفوي من عظم الفك الكامنة (الشكل 3) وبالإضافة إلى ذلك من حجم المناسبة من وسائل الإعلام ضرورية لعزل ونمو المستعمرات، على التوالي. ، مستعمرات الظهارية ضيقة صغيرة تشكيلها باستخدام هذه التقنية واضحة من قبل 7 أيام (الشكل 4A)،وهذه تنمو في مستعمرات كبيرة في غضون 2-3 أسابيع (الشكل 4B).

الشكل 1
الشكل 1. الرسوم التوضيحية من القاطعة الماوس الكبار. (A) الفأر الكبار نصفي الفك السفلي تظهر المكونات المعدنية، والمينا وعاج، ونوعين من الأسنان، والأضراس والقواطع. يتم تمييز منطقة القاطعة الداني حيث يضم DESCs في A '. (A') عرض سهمي من القاطعة الداني تبين محاريب الخلايا الجذعية 2، حلقة عنق الرحم شفوي واللغات (laCL وliCL)، التي تولد خلايا تكوين المينا المينا، و والخلايا المولدة للعاج التي تشكل عاج. وlaCL، الذي يولد حصرا خلايا الأسلاف أرومة الميناء وتشكل في نهاية المطاف يتم تمييز القاطعة المينا الموجودة في A''. (A'') وlaCL تبين ظهارة المينا الخارجي (OEE)، شبكية النجمية (SR)، المينا الداخلية ظهارة (IEE)، العابر تضخيم (TA) المنطقة، وintermedium الطبقة (SI). يتم تمثيل ريال باللون الأزرق الداكن والوردي لتعكس مجموعات سكانية فرعية ذات الكثافة المختلفة. (ب) تصور حلقة عنق الرحم باستخدام الماوس مراسل فلوري، KRT14-EGFP/Actb. العظام هو autofluorescent نسبيا، وإزالة العظم الكشف عن حلقة عنق الرحم (B ') وبقية ظهارة، ومن ثم يمكن رفعه بسهولة. (B'') جميع هياكل حلقة عنق الرحم بما في ذلك OEE، التقييم الخارجي المستقل، TA وSI يمكن تصور بسهولة مع الجين المراسل. أشرطة النطاق B '، B "= 2 مم، B" = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

es/ftp_upload/51266/51266fig2highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم 2 لمحة عامة عن تشريح وعزل CL من القاطعة الماوس. تمثيل تخطيطي لهذا الإجراء. يقع CL في نهاية القريبة من القاطعة الفك السفلي. فإن الخطوة الأولى هي لإزالة عظم الفك المحيطة لفضح القاطعة مع CL سليمة. المقبل، يتم عزل الجهاز الأسنان ووضعها في 2٪ كولاجيناز لظهارة منفصلة من اللحمة المتوسطة. بعد 4 ساعات الحضانة، يتم رفعه إلى CL يدويا، فصلها في الخلايا واحدة، ومثقف فوق أطباق زراعة الأنسجة القياسية.

الرقم 3
الرقم 3. إزالة العظام من الفك السفلي الماوس لفضح الكامنة المنطقة CL. تظهر نقاط التفتيش البصرية لإزالة العظام من عملية تشريح. (A) ويبين-نصفي الفك السفلي لأي fter الخطوة 1.5، مرة واحدة تتم إزالة العضلات والأوتار والأربطة من العظام. (B) يشير إلى المنطقة لبدء إزالة العظام، بدءا من أقل بقليل من المولي 3 الثالثة، والانتقال قريب نحو المنطقة التي تحتوي على CL. المقبل، يتم إزالة جميع الداني العظام إلى CL (C)، كما لوحظ في الخطوة 2.4. يظهر شق المقبل لإزالة ما تبقى من العظام كما جاء في الخطوة 2.5 في (D). أخيرا، تتم إزالة CL من العظام المتبقية كما ذكر في الخطوة 2.6 (E)، وعرض تضخيم (الشكل).

الرقم 4
الشكل 4. نتائج ممثل تشكيل مستعمرة ناجحة في المختبر. A. المرحلة المجهر النقيض من DESCs، بعد الطلاء في الثقافة لمدة 7 أيام. تشكيل مستعمرة ضيق يشير إلى نجاح isolatio الظهاريةن مع عدم وجود تلوث الوسيطة. مقياس شريط = 400 ميكرون. B. بعد 10 يوما من الحضانة، المستعمرات هي أكبر في الحجم والخلايا لديها نموذجي مورفولوجيا الحصوه الظهارية. مقياس شريط = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كانت الخلايا الظهارية الأولى بنجاح مثقف 40 عاما مضت أكثر من 21-24، وفي الآونة الأخيرة، والعزلة الناجحة من الخلايا الجذعية الظهارية 25-27 وقد تقدمت معرفتنا البيولوجيا الظهارية. نفيدكم بروتوكول للعزل DESCs من القاطعة الماوس الكبار، يبلغ عدد سكانها سلوكه نسبيا من الخلايا الجذعية التي لديها القدرة لانتاج رؤى مهمة في علم الأحياء الأسنان وتشكيل المينا. واستند هذا البروتوكول في البداية على التقارير السابقة من العزلة الخلايا الجذعية الظهارية من بصيلات الشعر 28. في حين أن العديد من البروتوكولات استخدام طبقات المغذية ومصل للحفاظ على الخلايا الجذعية الظهارية، أسلوبنا هو المغذية الحرة، نظام حر المصل. ومع ذلك، وسائل الإعلام نمونا لا تتطلب استخدام مزيج من صندوق تعديل العولمة الأوروبي، FGF2 وB27 الملحق. طالما استخدمت صندوق تعديل العولمة الأوروبي للحفاظ على خلايا غير متمايزة 29. تم استخدام مزيج من صندوق تعديل العولمة الأوروبي وFGF2 جنبا إلى جنب مع B27 سابقا على الشعر ثقافة الخلايا الجذعية جريب 27، وB27 يستخدم بشكل واسع للحفاظ على الخلايا الجذعية العصبية في الثقافة 30،31. ونحن أيضا قياس سابقا الجدوى ومعدل النمو خصائص DESCs فوق زراعة الأنسجة والبلاستيك على مجموعة متنوعة من ركائز ECM، تم الكشف عن وجود فروق في معدلات انتشار 19. يمكن الحفاظ على الخلايا لمدة تصل إلى 10 مقاطع المسلسل 19.

نستخدم أقل القواطع لهذا الإجراء بسبب سهولة إزالة بالمقارنة مع القواطع العلوية. أهم الخطوات ضمن بروتوكول لدينا خلال العزلة هي الاستئصال الكامل للمنطقة CL من عظم الفك السفلي قبل ان يضع في كولاجيناز وتسليخ مجهري نظيفة من CL. لأن القاطعة القريبة حساسة جدا، فمن المهم عدم الاضرار بها أثناء التشريح، مما قد يؤدي إلى فقدان CL شفوي. سوف يؤدي إلى إزالة كاملة فلول labialCL والعائد أقل من DESCs. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم لتجنب التلوث مع غير C-الخلايا الظهارية L. وهكذا، بعد أن تم فصل ظهارة من اللحمة المتوسطة، ينبغي إجراء شق على شكل حرف V نظيفة لإزالة CL شفوي من ظهارة المجاورة. أخيرا، لا بد من لوحة هذه الخلايا بتركيز أكثر من 1 × 10 4 خلايا لكل مل وترك نصف وسائل الإعلام مكيفة لتغير وسائل الإعلام أولا.

والفائدة الرئيسية من هذا البروتوكول لأبحاث طب الأسنان هو أنه يتيح إنتاج والتلاعب DESCs في المختبر كفاءة. على الرغم من أن يتم تأسيس القاطعة الماوس بمثابة نموذج في الجسم الحي 7-9،12،32-34، ووضع نظام في المختبر السلف مجال أبحاث طب الأسنان من خلال فتح الأبواب أمام التجارب التي يصعب القيام بها في الجسم الحي. وتشمل مزايا هذا النظام على القدرة على التعامل بسهولة الخلايا في ظروف ثقافة مختلفة، من السهل استهداف مسارات الإشارات واحد أو حتى متعددة، وتثبيط أو تفعيل تاجزيئات rgeted باستخدام سيرنا أو عوامل النمو. وتشمل التطبيقات المصب من هذا النظام في المختبر باستخدام التقنيات المذكورة أعلاه فضلا عن غيرها من التقنيات المتطورة لإجراء الدراسات الفنية و / أو الآلية، ولا سيما على مستوى خلية واحدة.

عموما، يمكن أن المعلومات المستقاة من DESC في الثقافة المختبر تساعد على كشف تعقيدات تجديد الأسنان الخلايا الجذعية القائمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

Acknowledgments

المؤلفين أشكر شيوى بينغ وانغ للمساعدة أولية مع الثقافات DESC. تمول من الكتاب في جزء من المنح الدراسية والمنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (K99-DE022059 لAHJ، K12-GM081266 إلى MGC، K08-DE022377-02 لOH، وR01-DE021420 إلى ODK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps, size 5 Fine Science Tools 11251-30 FST by Dumont, Dumoxel
Forceps straight, fine, 3.5 Roboz RS5070
Razorblades Electron Microscopy Services #71960
Scalpel Handle No. 3 VWR
Feather Blade No. 15 Electron Microscopy Services #72044-15 Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered Worthington Biochemical Corporation #4214
Insulin syringe BD #329424
Accumax EMD Millipore #SCR006
DMEM/F12 Gibco 11320-033
EGF R&D 2028-EG-200
FGF2 R&D 233-FB-025
B27 Supplement Gibco 10889-038

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharpe, P. T., Young, C. S. Test-tube teeth. Sci Am. 293, 34-41 (2005).
  2. D'Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
  3. Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
  4. Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
  5. Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
  6. Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
  7. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
  8. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
  10. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
  11. Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
  12. Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
  13. Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
  14. Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
  15. Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
  16. Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
  17. Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
  18. Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
  19. Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
  20. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  21. Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
  22. Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
  23. Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
  24. Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
  25. Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
  26. Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
  27. Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
  28. Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
  29. Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
  30. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  31. Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
  32. Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
  33. Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
  34. Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).

Tags

بيولوجيا الخلايا الجذعية، العدد 87، طلائي الخلايا الجذعية، الخلايا الجذعية البالغة، القاطعة، عنق الرحم حلقة، خلية ثقافة
العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chavez, M. G., Hu, J., Seidel, K.,… More

Chavez, M. G., Hu, J., Seidel, K., Li, C., Jheon, A., Naveau, A., Horst, O., Klein, O. D. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. J. Vis. Exp. (87), e51266, doi:10.3791/51266 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter