Summary
El continuo crecimiento de los incisivos ratón proporciona un modelo para el estudio de la renovación de los tejidos dentales a partir de células madre epiteliales dentales (DESCs). Un sistema sólido para la obtención de manera consistente y confiable de estas células de la incisivo y expandir in vitro se informó aquí.
Abstract
La comprensión de los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la regeneración de dientes y la renovación se ha convertido en un tema de gran interés 1-4, y el incisivo ratón proporciona un modelo para estos procesos. Este órgano notable crece continuamente durante toda la vida del animal y genera todos los tipos de células necesarios de piscinas activas de las células madre adultas alojados en el labial (hacia el labio) y lingual (hacia la lengua) (CL) regiones cervical bucle. Sólo las células madre dentales de la labial CL dan lugar a ameloblastos que generan esmalte, la cubierta externa de los dientes, en la superficie labial. Esta formación del esmalte asimétrica permite a la abrasión en la punta de los incisivos, y progenitores y células madre en el incisivo proximal asegurar que los tejidos dentales se reponen constantemente. La capacidad para aislar y cultivar estas células progenitoras o madre in vitro permite su expansión y abre las puertas a numerosos experimentos no alcanzables in vivo, tales como High prueba de rendimiento de los factores de regulación potencial de células madre. A continuación, describimos y demostrar un método fiable y consistente para las células de cultivo de la CL labial del incisivo ratón.
Introduction
Una de las características únicas de los vertebrados es la evolución de los dientes. El diente se ha convertido en un importante sistema modelo para muchas áreas de investigación, como las vías moleculares y especializaciones morfológicas relevantes a este órgano se han investigado desde varias perspectivas, incluso por los biólogos del desarrollo y evolución 5. Más recientemente, el campo de la medicina regenerativa ha comenzado a obtener información valiosa utilizando el diente como modelo. En particular, el descubrimiento de las células madre epiteliales dentales ha sido un importante avance 6-13.
Todos los roedores tienen incisivos de crecimiento continuo cuyo crecimiento es impulsado por las células madre, por lo que estos dientes un modelo de sistema accesible para estudiar la regulación de células madre adultas. Experimentos de etiquetado en la década de 1970 10,11, seguido de linaje genético experimentos de rastreo 8,9,12,14, han demostrado que DESCs residen en la región proximal del incisivo. El vástagoprogenie de células en el compartimiento epitelial en el lado labial movimiento fuera del nicho putativo, conocido como el bucle de cuello uterino labial (CL), y contribuir a una población de células llamadas de tránsito de amplificación de células (TA) (Figura 1). Específicamente, DESCs residen en el epitelio externo del esmalte (OEE) y retículo estrellado (SR) 8,9,14, y el epitelio interno del esmalte (IEE) da lugar a las células de AT que progresan a través de un número limitado de ciclos celulares y luego mueven distalmente a lo largo de la longitud del incisivo (Figura 1). Los ameloblastos de diferenciación en el incisivo ratón continúan moviéndose distalmente a lo largo del incisivo a un ritmo notable de aproximadamente 350 micras en un solo día 15,16. Mientras se mueven, las células se diferencian en ameloblastos maduros y células estrato intermedio (SI). Después de depositar el espesor completo de la matriz del esmalte, muchos de los ameloblastos someterse a la apoptosis, y las células restantes se encogen en tamaño y regulan maduración del esmalte <sup> 17. El linaje de los otros tipos de células en el labial CL, como el SR, es menos clara, y los datos con respecto a las células madre en el mesénquima de 18 años y en la lingual CL sólo están comenzando a emerger.
Utilizando el modelo de ratón incisivo, un número de grupos han trabajado para dilucidar las vías genéticas y los procesos biológicos de células que participan en la renovación de órganos basado en células madre natural. Sin embargo, el labial CL contiene un número relativamente pequeño de células, estimada en aproximadamente el 5,000 por incisivo ratón, lo que hace que el trabajo con células primarias desafiante. Por lo tanto, se han hecho esfuerzos para la cultura y expandir estas células in vitro 6,16,19,20 con el fin de abrir nuevas puertas a los enfoques experimentales que no son alcanzables in vivo. El estudio más reciente ha demostrado que estas células pueden tanto auto-renovarse y diferenciarse en células que expresan amelogenina cuando se cultivan 13. A continuación, describimos y demostrar un método para the cultura fiable y consistente de las células de la labial ratón CL.
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Protocol
1. Dissect Menores Hemi-mandíbulas de Adultos Mouse
- Antes de realizar este protocolo, obtener la aprobación institucional necesario y asegúrese de cumplir con todas las directrices de cuidado de animales. La eutanasia a los animales utilizando el estándar aprobado por el IACUC procedimientos. Para este trabajo se utilizó asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical.
- OPCIONAL: Cabeza separada del resto del cuerpo, utilizando una hoja de afeitar.
- Quite la piel del labio inferior hasta el cuello.
- Usando un bisturí, hacer una incisión entre los dos incisivos inferiores, que están conectados libremente. Al aplicar presión, la mandíbula se dividirá en dos mitades.
- Cuña El escalpelo entre el cóndilo de la mandíbula y la articulación mandibular temporal y cortar junto con el músculo de la mandíbula para separar la mandíbula.
- Quite todo el músculo, tendón y ligamento hasta sólo queda el hueso.
2. Aislar el Incisivo
- Usando un bisturí # 15, Afeitarse cuidadosamente el hueso en un ángulo de 45 ° desde el extremo distal hasta el extremo proximal de la región membranosa. Use la punta del bisturí para recoger la basura cualquier hueso remanente incluyendo los fragmentos de hueso en el borde. Poco a poco empiezan a recoger lejos en la cortical lingual de la mandíbula, empezando justo debajo del 3 er molar.
- Continúe hasta que el incisivo es limpio, trabajando cuidadosamente hacia el área que contiene el CL.
- Retire el conjunto de nervios alveolar inferior.
- Haga un corte limpio para quitar primero el hueso y los tejidos proximal a la CL.
- Haga un segundo corte distal con el bisturí, más o menos por debajo del 2 º molar. La región de los incisivos proximal se diseca a cabo mediante la inserción de la escalpelo entre el hueso y la superficie medial del incisivo proximal. Esto debe hacerse cuidadosamente, con el fin de no romper el tejido. El movimiento de la incisión es proximal-distal.
PASO ALTERNATIVA:
Quite la mayor cantidad de hueso como sea posible a lo largo de la zona superior de la incisor. Una vez que el área se limpia, quite cuidadosamente todo incisivo usando un tamaño de 5 pinzas para manejar la porción de esmalte más cercana a la región CL. - Coloque el tejido diseccionado (ya sea CL aislado como en la Figura 3E, o todo incisivo como en alternativa Paso 2.5) en 2% de colagenasa en 1X PBS durante 3-4 horas a 4 ° C en una placa de baja adherencia. Para 1-10 incisivos, utilice 100 l por pocillo en una placa de 12 pocillos. Por más de 10 incisivos, utilice 500 l por pocillo en una placa de 6 pocillos de baja adherencia.
3. Microdissect el labial Cervical Loop
- Retire región CL de la colagenasa y lugar en los medios de comunicación DMEM/F12 frío.
- Tire suavemente en el extremo inferior de la CL utilizando ya sea el tamaño de 5 fórceps o una jeringa de insulina (1 cc, 28 G ½); el mesénquima se vendrá abajo mientras que el epitelio se mantiene intacta. El CL y el epitelio adyacente que se extiende lateralmente como una estructura "de ala" serán visibles.
- Eliminarla yema apical del epitelio adyacente al hacer una incisión en forma de V a cada lado, y colocar inmediatamente en DMEM/F12 frío en hielo.
- Repita el procedimiento para todas las cartas circulares, recoge en 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
- Centrifugar el tubo de microcentrífuga con muestras, extraer los medios de comunicación, reemplace con una solución de 100 células destacamento l.
- Incubar los tejidos en solución de desprendimiento de las células durante 30 min a 37 ° C.
- Disociar los tejidos para producir una suspensión de células pipeteando suavemente hacia arriba y el uso de un bajo coeficiente de adherencia de puntas de pipeta 1.000 l abajo. Las células también se pueden colocar a través de un filtro de células estéril para lograr la disociación.
- Contar las células con un hemocitómetro, placa de plástico de cultivo de tejido u otro material deseado.
4. Cultivo primario de DESCs
- Las células de la placa en una placa de 6 pocillos a 1-6 x 10 4 células / ml en medio DESC, que consta de DMEM/F12 complementado con proteína recombinante EGF de ratón a una concentración de 20 ng / ml, la proteína recombinante FGF a una concentración de 25 ng / ml, 1X suplemento B27, y solución de 1% de antibiótico (penicilina, 100 U / ml, estreptomicina, 50 mg / ml).
- Crecer células sembradas en una placa de 6 pocillos a 37 º C en 5% de CO 2 en 1 ml de medio DESC. No moleste a los cultivos iniciales durante 5 días después de la siembra para permitir la adhesión celular y la formación de colonias.
- Para el primer cambio de los medios de comunicación, reemplace la mitad del volumen (500 l) de los medios tradicionales con la mitad del volumen (500 l) de los nuevos medios de comunicación. Compruebe colonias bajo el microscopio al cambiar el soporte.
- Después del primer cambio de los medios de comunicación, a seguir cambiando los medios de comunicación (1-2 ml) cada 2 días. Compruebe colonias bajo el microscopio al cambiar el soporte.
5. DESCs Passage
- Medios Aspirar y lavar las células 3 veces con PBS precalentado.
- Añadir precalentado 0,25% de tripsina-EDTA en solución salina y se incuba a 37 ° C durante 10-15 minutos para los DESCs separar.
- Añadir media DESC para neutralizar la tripsina, la pipeta suavemente a lo largo de la placa de cultivo de tejidos para recoger las células, y el lugar en un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar las células a 800 xg durante 2 min.
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Representative Results
El ratón hemimandíbula comprende un continuo crecimiento de los incisivos y molares tres raíces (Figura 1A). Todos los dientes se componen de la dentina y el esmalte, los dos componentes mineralizados de la corona del diente (Figuras 1a y 1a '). Las casas incisivos dos nichos de células madre llaman la CL labial y lingual CL, y el esmalte se forma exclusivamente en el lado labial (Figura 1A '). DESCs son responsables de la formación del esmalte de los incisivos y se alojan en el labial CL, en concreto el OEE y SR (Figura 1A'') 8,9. El labial CL también contiene la EEI, las células AT, y el SI (Figura 1A''). Nuestra técnica se centra en la disección y el aislamiento de DESCs de la CL labial (Figura 1A''). KRT14-Actina GFP marca todas las células epiteliales derivadas de la hemi-mandíbula (Figura 1B), y el labial CL se puede ver claramente through la mandíbula (Figura 1B ', flecha blanca). Cabe señalar que todos los tipos de células se pueden identificar en virtud de un aumento mayor (compárense las Figuras 1A '' y B'').
El procedimiento para el aislamiento de DESCs de la labial CL se resume en la Figura 2. Brevemente, se retira primero del animal el hemi-mandíbula, se quita el hueso de la mandíbula para exponer el labial CL, y luego el labial CL se trata con colagenasa a separar el epitelio de la mesénquima circundante. La CL se microdissected, se trató con tampón de disociación de células, y se sembraron en placas de cultivo de tejidos. La separación de la labial CL desde el hueso de la mandíbula subyacente (Figura 3) y la adición de un volumen adecuado de los medios de comunicación son esenciales para el aislamiento y el crecimiento de las colonias, respectivamente. Colonias pequeñas, estrechas epiteliales formados con esta técnica son visibles en 7 días (Figura 4A),y éstos se convierten en grandes colonias dentro de 2-3 semanas (Figura 4B).
Figura 1. Ilustraciones de la incisivo del ratón adulto. (A) El ratón adulto hemi-mandíbula que muestra los componentes mineralizadas, el esmalte y la dentina, y los dos tipos de dientes, incisivos y molares. La región de los incisivos proximal donde se alojan los DESCs se resalta en A '. (A') vista sagital del incisivo proximal que muestra los 2 nichos de células madre, el bucle cervical labial y lingual (LACL y LiCl), ameloblastos que generan esmalte y los odontoblastos que forman la dentina. El LACL, que genera exclusivamente células progenitoras ameloblastos y finalmente forman el esmalte de los incisivos se resalta en A''. (A'') El LACL mostrando el epitelio externo del esmalte (OEE), retículo estrellado (SR), el epitelio interno del esmalte (IEE), el tránsito-amplificación (TA) región y el estrato intermedio (SI). El SR se representa en azul y rosa oscuro para reflejar las subpoblaciones con diferentes densidades. (B) Visualización del lazo del cuello uterino usando un ratón reportero fluorescente, KRT14-EGFP/Actb. El hueso es relativamente autofluorescente, y la eliminación del hueso expone el bucle de cuello uterino (B ') y el resto del epitelio, que luego pueden ser extirpada con facilidad. (B'') Todas las estructuras del bucle de cuello uterino incluyendo la OEE, EEI, TA y SI se puede visualizar fácilmente con el gen reportero. Las barras de escala B ', B "= 2 mm, B" = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 2. Descripción general de la disección y el aislamiento de la CL del incisivo ratón. Representación esquemática del procedimiento. La CL se encuentra en el extremo proximal del incisivo inferior. El primer paso es quitar el hueso de la mandíbula alrededores para exponer el incisivo con CL intacto. A continuación, el órgano diente está aislado y se coloca en 2% de colagenasa al epitelio separado a partir del mesénquima. Después de 4 horas de incubación, el CL se extirpa de forma manual, disocia en células individuales y se cultivaron encima de bandejas de cultivo de tejidos.
Figura 3. La extracción del hueso de la mandíbula del ratón para exponer la región subyacente CL. Puestos de control visual de la eliminación de hueso del proceso de disección se muestran. (A) muestra el hemi-mandíbula de unespués Paso 1.5, una vez que el músculo, tendón y ligamento se eliminan de la médula. (B) indica la zona para empezar a retirar el hueso, a partir desde justo debajo de la 3 ª molar, mueva proximalmente hacia la región que contiene la CL. A continuación, todos proximal del hueso a la CL se retira (C), como se ha indicado en el paso 2.4. El siguiente incisión para eliminar el resto del hueso como se indica en el paso 2.5 se muestra en (D). Por último, la CL se elimina de la médula restante como se indica en el paso 2.6 (E), vista ampliada (recuadro).
Figura 4. Los resultados representativos de la formación de colonias con éxito in vitro. Microscopía de contraste de A. Fase de DESCs, después de la siembra en el cultivo durante 7 días. La formación de colonias Tight indica isolatio epitelial exitosan sin contaminación mesenquimales. Barra de escala = 400 m. B. Después de 10 días de incubación, las colonias son más grandes en tamaño y células tienen una morfología típica de adoquines epitelial. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las células epiteliales fueron primero cultivadas con éxito hace más de 40 años 21-24, y más recientemente, el aislamiento con éxito de células madre epiteliales 25-27 ha avanzado nuestro conocimiento de la biología epitelial. Se presenta un protocolo para aislar el DESCs del incisivo ratón adulto, una población relativamente poco estudiado de las células madre que tiene el potencial de producir importantes conocimientos sobre la biología y la formación del esmalte dental. Este protocolo se basó inicialmente en los informes anteriores de aislamiento de células madre epiteliales del folículo piloso 28. Mientras que muchos protocolos usan capas de alimentación y el suero para mantener las células madre epiteliales, nuestro método es un alimentador libre, el sistema libre de suero. Sin embargo, nuestro medio de crecimiento requiere el uso de un cóctel de EGF, FGF2 y suplemento B27. EGF ha sido utilizado para mantener las células indiferenciadas 29. Un cóctel de EGF y FGF2 junto con B27 se utilizó anteriormente para las células madre del folículo piloso cultura 27, y B27 es ampliamente utilizado para mantener las células madre neurales en cultivo 30,31. También hemos medido previamente las características de viabilidad y la tasa de crecimiento de DESCs encima de cultivo de plástico de tejido y sobre una variedad de sustratos de ECM, y no se detectaron diferencias en las tasas de proliferación 19. Las células se podrían mantener durante un máximo de 10 pases en serie 19.
Utilizamos los incisivos inferiores para este procedimiento debido a la facilidad de eliminación en comparación con los incisivos superiores. Los pasos más importantes dentro de nuestro protocolo durante el aislamiento son la eliminación completa de la zona de CL desde el hueso de la mandíbula antes de colocar en la colagenasa y una microdisección limpia de la CL. Debido a que el incisivo proximal es muy delicada, es importante no dañarlo durante la disección, lo que podría resultar en la pérdida de la labial CL. La eliminación incompleta dará lugar a los restos de la labialCL y un menor rendimiento de DESCs. Además, es importante para evitar la contaminación con no-CL células epiteliales. Por lo tanto, después de que el epitelio ha sido separado del mesénquima, se debe hacer una incisión en forma de V limpia para eliminar el labial CL del epitelio vecina. Por último, es esencial a la placa estas células a una concentración de más de 1 x 10 4 células por ml y dejar medio de los medios acondicionados para el primer cambio de los medios de comunicación.
El principal beneficio de este protocolo para la investigación dental es que permite la producción y manipulación de DESCs in vitro eficiente. Aunque el incisivo ratón se estableció como un modelo in vivo en 7-9,12,32-34, el desarrollo de un sistema in vitro avanza el campo de la investigación dental, abriendo las puertas a experimentos que son difíciles de realizar en vivo. Las ventajas de este sistema incluyen la capacidad de manipular fácilmente las células en diferentes condiciones de cultivo, facilitar la orientación de las vías individuales o incluso múltiples de señalización, y la inhibición o activación de TAmoléculas rgeted utilizando siRNA o factores de crecimiento. Aplicaciones posteriores de este sistema in vitro incluyen el uso de las técnicas mencionadas anteriormente, así como otras técnicas de vanguardia para llevar a cabo estudios funcionales y / o mecánicos, en particular a nivel de células individuales.
En general, la información obtenida de DESC cultivo in vitro puede ayudar a desentrañar las complejidades de la renovación de dientes a base de células madre.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Xiu-Ping Wang ayuda inicial con culturas DESC. Los autores son financiados en parte por becas y subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (K99-DE022059 a AHJ, K12-GM081266 a MGC, K08-DE022377-02 a OH y R01-DE021420 a ODK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, size 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | FST by Dumont, Dumoxel |
| Forceps straight, fine, 3.5 | Roboz | RS5070 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Services | #71960 | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | ||
| Feather Blade No. 15 | Electron Microscopy Services | #72044-15 | Surgical Stainless Steel |
| Collagenase Type-1 filtered | Worthington Biochemical Corporation | #4214 | |
| Insulin syringe | BD | #329424 | |
| Accumax | EMD Millipore | #SCR006 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| EGF | R&D | 2028-EG-200 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB-025 | |
| B27 Supplement | Gibco | 10889-038 |
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