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Biology

वयस्क माउस छेनी से चिकित्सकीय उपकला स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति

Published: May 1, 2014 doi: 10.3791/51266
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 4,5,6, 1,7, 1,8
1Department of Orofacial Sciences and Program in Craniofacial and Mesenchymal Biology, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 3Department of Pathology and Research Center, Zhongshan Hospital of Dalian University, 4Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, UMR S872, 5Centre de Recherche des Cordeliers, Université Pierre et Marie Curie, UMR S872, 6INSERM U872, 7Division of Endodontics, Department of Preventive and Restorative Dental Sciences, University of California, San Francisco, 8Department of Pediatrics and Institute for Human Genetics, University of California, San Francisco

Summary

लगातार बढ़ रही माउस छेनी दंत उपकला स्टेम कोशिकाओं (DESCs) से दंत ऊतकों के नवीकरण के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रदान करता है. लगातार और मज़बूती से छेनी से इन कोशिकाओं को प्राप्त करने और इन विट्रो में उन्हें विस्तार के लिए एक मजबूत प्रणाली यहाँ की सूचना दी है.

Abstract

दांत उत्थान और नवीकरण आबाद कि सेलुलर और आणविक तंत्र को समझना बहुत रुचि 1-4 का विषय बन गया है, और माउस छेनी इन प्रक्रियाओं के लिए एक मॉडल प्रदान करता है. यह उल्लेखनीय अंग जानवर के जीवन भर लगातार बढ़ता है और (जीभ की ओर) (होंठ की ओर) ओष्ठ और बहुभाषी ग्रीवा पाश (सीएल) क्षेत्रों में रखे वयस्क स्टेम सेल के सक्रिय पूल से सभी आवश्यक प्रकार की कोशिकाओं को उत्पन्न करता है. ओष्ठ सी.एल. से केवल डेंटल स्टेम सेल ओष्ठ सतह पर तामचीनी, दांत के बाहरी कवर, उत्पन्न कि ameloblasts को जन्म दे. इस असममित तामचीनी गठन छेनी टिप पर घर्षण की अनुमति देता है, और समीपस्थ छेनी में progenitors और स्टेम सेल दंत ऊतकों लगातार मंगाया जाता है यह सुनिश्चित. इन विट्रो में इन पूर्वज या स्टेम कोशिकाओं को अलग और विकसित करने की क्षमता उनके विस्तार की अनुमति देता है और इस तरह के घंटे के रूप में vivo में प्राप्त नहीं कई प्रयोगों, के लिए दरवाजे खोलतासंभावित स्टेम सेल नियामक कारकों की igh throughput परीक्षण. यहाँ, हम वर्णन और माउस छेनी के ओष्ठ सी.एल. से संस्कृति की कोशिकाओं के लिए एक विश्वसनीय और सुसंगत विधि का प्रदर्शन.

Introduction

रीढ़ की अनूठी विशेषताओं में से एक दांत का विकास है. आणविक मार्ग है और इस अंग को प्रासंगिक रूपात्मक विशेषज्ञताओं विकास और विकासवादी जीव 5 से सहित कई दृष्टिकोण से जांच की गई है के रूप में दांत, अनुसंधान के कई क्षेत्रों के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली बन गया है. हाल ही में, पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में एक मॉडल के रूप में दांत का उपयोग बहुमूल्य अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए शुरू हो गया है. विशेष रूप से, दंत उपकला स्टेम कोशिकाओं की खोज एक महत्वपूर्ण अग्रिम 6-13 दिया गया है.

सभी कृन्तकों वयस्क स्टेम सेल विनियमन अध्ययन करने के लिए इन दांत एक सुलभ मॉडल प्रणाली बनाने, जिसका विकास स्टेम सेल से बल मिलता है लगातार बढ़ रही कृन्तक अधिकारी. आनुवंशिक वंश अनुरेखण प्रयोगों 8,9,12,14 द्वारा पीछा 1970 के दशक 10,11 में लेबलिंग प्रयोगों, DESCs छेनी के समीपस्थ क्षेत्र में रहते हैं कि प्रदर्शन किया है. तनासेल ओष्ठ ग्रीवा पाश (सीएल) के रूप में जाना ख्यात आला, के बाहर ओष्ठ ओर कदम पर उपकला डिब्बे में संतान, और पारगमन-amplifying (टीए) कोशिकाओं (चित्रा 1) नामक कोशिकाओं की आबादी के लिए योगदान करते हैं. विशेष रूप से, DESCs बाहरी तामचीनी उपकला (OEE) और तारामय जालिका (एसआर) 8,9,14 में रहते हैं, और आंतरिक तामचीनी उपकला (IEE) तो चाल सेल चक्र का एक सीमित संख्या के माध्यम से प्रगति है कि टीए कोशिकाओं को जन्म देता है और distally छेनी की लम्बाई (चित्रा 1) के साथ. माउस छेनी में फर्क ameloblasts एक ही दिन 15,16 में लगभग 350 मीटर की एक उल्लेखनीय दर से छेनी साथ distally ले जाने के लिए जारी है. वे ले जाते हैं, कोशिकाओं को परिपक्व ameloblasts और परत इंटर व्यक्ति (एसआई) कोशिकाओं में अंतर. तामचीनी मैट्रिक्स की पूरी मोटाई जमा करने के बाद, ameloblasts के कई apoptosis से गुजरना है, और शेष कोशिकाओं के आकार में छोटा और तामचीनी परिपक्वता विनियमित <> 17 समर्थन. ऐसे एसआर रूप ओष्ठ सी.एल., में अन्य प्रकार की कोशिकाओं के वंश कम स्पष्ट है, और mesenchyme 18 में और बहुभाषी सी.एल. में स्टेम सेल के बारे में डेटा केवल उभरने शुरू हो गए हैं.

माउस छेनी मॉडल का उपयोग करना, समूहों की एक संख्या आनुवंशिक रास्ते और प्राकृतिक स्टेम सेल आधारित अंग नवीकरण में शामिल सेल जैविक प्रक्रियाओं को स्पष्ट करने के लिए काम किया है. हालांकि, ओष्ठ सीएल के बारे में 5,000 प्राथमिक कोशिकाओं को चुनौती देने के साथ काम करता है जो माउस छेनी, प्रति होने का अनुमान कोशिकाओं की संख्या अपेक्षाकृत छोटे होते हैं. इसलिए, प्रयासों संस्कृति को बनाया और इन विवो में प्राप्त नहीं कर रहे हैं कि प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लिए नए दरवाजे खोलने के लिए आदेश में इन विट्रो 6,16,19,20 में इन कोशिकाओं का विस्तार किया गया है. सबसे ताजा अध्ययन में इन कोशिकाओं को स्वयं को नवीनीकृत और जब सुसंस्कृत 13 कोशिकाओं को व्यक्त amelogenin में अंतर कर सकते है कि दोनों का प्रदर्शन किया है. यहाँ, हम वीं के लिए एक विधि का वर्णन है और दिखाना हैमाउस ओष्ठ सी.एल. से कोशिकाओं की ई विश्वसनीय और संगत संस्कृति.

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Protocol

वयस्क माउस से 1. काटना लोअर Hemi-mandibles

  1. पहले इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने, आवश्यक संस्थागत अनुमोदन प्राप्त है और सभी जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों का अनुपालन सुनिश्चित करें. मानक IACUC प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी उपयोग कर पशु euthanize. इस काम के लिए सीओ 2 asphyxiation ग्रीवा अव्यवस्था के बाद किया गया था.
    1. वैकल्पिक: एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर शरीर के बाकी हिस्सों से अलग सिर.
  2. Neckline के लिए निचले होंठ से त्वचा निकालें.
  3. एक छुरी का प्रयोग, शिथिल जुड़े हुए हैं जो दो कम कृन्तक, के बीच एक चीरा बनाते हैं. दबाव लागू करने पर, जबड़ा दो हिस्सों में विभाजित किया जाएगा.
  4. जबड़े से अलग करने के जबड़े का कंद और अस्थायी जबड़े संयुक्त और जबड़ा मांसपेशियों के साथ कटौती के बीच स्केलपेल कील.
  5. केवल हड्डी बनी हुई है, जब तक सभी मांसपेशी, पट्टा, और बंधन निकालें.

2. छेनी अलग

  1. एक # 15 स्केलपेल का उपयोग, ध्यान से झिल्लीदार क्षेत्र के समीपस्थ अंत करने के लिए बाहर का अंत से एक 45 डिग्री के कोण पर हड्डी दाढ़ी. किनारे पर हड्डी के टुकड़े सहित किसी भी शेष हड्डी दूर लेने के लिए स्केलपेल के टिप का उपयोग करें. धीरे धीरे सिर्फ 3 दाढ़ नीचे शुरू, जबड़ा के बहुभाषी cortical थाली में दूर लेने के लिए शुरू करते हैं.
  2. छेनी सी.एल. वाले क्षेत्र की ओर ध्यान से काम करना, साफ है जब तक जारी रखें.
  3. अवर दंतउलूखल तंत्रिका बंडल निकालें.
  4. पहली सीएल के समीपस्थ हड्डी और ऊतकों को हटाने के लिए एक साफ कटौती करें.
  5. मोटे तौर पर 2 एन डी दाढ़ नीचे स्केलपेल के साथ distally एक दूसरी कटौती, बनाओ. समीपस्थ छेनी क्षेत्र तो हड्डी और समीपस्थ छेनी की औसत दर्जे का सतह के बीच स्केलपेल डालने से बाहर विच्छेदित है. ऊतक आंसू के रूप में नहीं तो यह सावधानी से किया जाना चाहिए. चीरा गति समीपस्थ-बाहर का है.
    वैकल्पिक कदम:
    मैं ऊपर क्षेत्र के साथ जितना संभव हड्डी निकालेंncisor. क्षेत्र को मंजूरी दे दी है, एक बार ध्यान से तामचीनी भाग सी.एल. क्षेत्र के सबसे करीब संभाल करने के लिए एक आकार 5 संदंश का उपयोग पूरे छेनी हटा दें.
  6. एक कम पालन थाली में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे के लिए 1X पीबीएस में 2% collagenase में विच्छेदित ऊतक (वैकल्पिक 2.5 कदम के रूप में चित्रा 3E में के रूप में अलग सी.एल., या पूरे छेनी या तो) रखें. 1-10 कृन्तक के लिए, एक 12 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 100 μl का उपयोग करें. अधिक से अधिक 10 कृन्तक के लिए, 6 अच्छी तरह से कम पालन थाली में अच्छी तरह से प्रति 500 ​​μl का उपयोग करें.

3. Microdissect ओष्ठ सरवाइकल लूप

  1. ठंड DMEM/F12 मीडिया में collagenase और जगह से सी.एल. क्षेत्र निकालें.
  2. आकार 5 संदंश या एक इंसुलिन सिरिंज (1 सीसी, 28 जी साढ़े) का उपयोग सीएल के निचले सिरे पर धीरे से खींच; उपकला बरकरार है जबकि mesenchyme के अलावा गिर जाएगी. एक "पंख" की तरह संरचना के रूप में laterally फैली कि सी.एल. और आसन्न उपकला दिखाई जाएगी.
  3. हटानादोनों तरफ एक वी के आकार का चीरा, और तुरंत बर्फ पर ठंड DMEM/F12 में जगह से सटे उपकला से शिखर कली.
  4. 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में ले लीजिए, सब CLs के लिए दोहराएँ.
  5. , नमूनों के साथ microfuge ट्यूब स्पिन मीडिया को दूर, 100 μl सेल टुकड़ी समाधान के साथ बदलें.
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेल टुकड़ी समाधान में ऊतकों सेते
  7. धीरे से ऊपर और नीचे pipetting एक 1000 μl कम आसंजन पिपेट टिप का उपयोग करके किसी एकल कक्ष निलंबन का उत्पादन करने के लिए ऊतकों को अलग कर देना. कोशिकाओं को भी हदबंदी को प्राप्त करने के लिए एक बाँझ सेल झरनी के माध्यम से रखा जा सकता है.
  8. टिशू कल्चर प्लास्टिक या अन्य वांछित सामग्री पर hemocytometer, थाली के साथ कोशिकाओं की गणना.

DESCs के 4. प्राथमिक संस्कृति

  1. 6 अच्छी तरह से थाली में प्लेट कोशिकाओं 1-6 एक्स 10 20 उत्तर की एकाग्रता पर माउस EGF पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ पूरक DMEM/F12 के होते हैं जो DESC मीडिया में 4 सेल / एमएल,जी / एमएल, एक 25 एनजी / एमएल की एकाग्रता, 1X B27 पूरक, और 1% एंटीबायोटिक समाधान (पेनिसिलिन, 100 यू / एमएल, स्ट्रेप्टोमाइसिन, 50 माइक्रोग्राम / एमएल) में FGF पुनः संयोजक प्रोटीन.
  2. 5% सीओ 2 DESC मीडिया के 1 मिलीलीटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 अच्छी तरह से थाली पर चढ़ाया कोशिकाओं को विकसित. सेल आसंजन और कॉलोनी गठन की अनुमति देने के चढ़ाना के बाद 5 दिनों के लिए प्रारंभिक संस्कृतियों को परेशान मत करो.
  3. पहले मीडिया परिवर्तन के लिए, नए मीडिया की आधी मात्रा (500 μl) के साथ पुराने मीडिया की मात्रा (500 μl) के आधे की जगह. मीडिया बदल रहा है जब खुर्दबीन के नीचे कालोनियों की जाँच करें.
  4. पहले मीडिया परिवर्तन के बाद, हर 2 दिनों मीडिया (1-2 मिलीलीटर) को बदलने के लिए जारी है. मीडिया बदल रहा है जब खुर्दबीन के नीचे कालोनियों की जाँच करें.

5. बीतने DESCs

  1. महाप्राण मीडिया और कोशिकाओं धो पूर्व गर्म पीबीएस के साथ 3x.
  2. नमकीन घोल में पूर्व गर्म 0.25% trypsin EDTA जोड़ें और अलग करने के लिए DESCs के लिए 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. Trypsin बेअसर करने के लिए DESC मीडिया जोड़ें, धीरे से एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में कोशिकाओं, और जगह इकट्ठा करने के लिए टिशू कल्चर प्लेट साथ विंदुक.
  4. 2 मिनट के लिए 800 XG पर कोशिकाओं स्पिन.

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Representative Results

माउस Hemi-जबड़ा एक लगातार बढ़ रही है छेनी और तीन जड़ें दाढ़ (चित्रा 1 ए) शामिल हैं. सभी दांत डेंटिन और तामचीनी, दांत मुकुट की दो mineralized घटकों (आंकड़े 1 ए और 1 ए ') से मिलकर बनता है. छेनी घरों दो स्टेम सेल आलों ओष्ठ सी.एल. और बहुभाषी सी.एल. कहा जाता है, और तामचीनी ओष्ठ ओर (चित्रा 1 ए ') पर विशेष रूप से बनाई है. DESCs छेनी तामचीनी गठन के लिए जिम्मेदार हैं और ओष्ठ सी.एल., विशेष रूप से OEE और एसआर (चित्रा 1 ए'') 8,9 में रखे जाते हैं. ओष्ठ सी.एल. भी IEE, टीए कोशिकाओं, और एसआई (चित्रा 1 ए'') शामिल हैं. हमारी तकनीक ओष्ठ सीएल (चित्रा 1 ए'') के DESCs के विच्छेदन और अलगाव पर जोर दिया है. Krt14-actin GFP Hemi-जबड़ा (चित्रा 1 बी) के सभी उपकला व्युत्पन्न कोशिकाओं के निशान, और ओष्ठ सी.एल. स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है अपरोक्षऊ जबड़ा (चित्रा 1 बी ', सफेद तीर). यह सभी प्रकार की कोशिकाओं (आंकड़े 1 ए तुलना 'और बी'') उच्च वृद्धि के तहत पहचाना जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए.

ओष्ठ सी.एल. से DESCs के अलगाव के लिए प्रक्रिया चित्रा 2 में संक्षेप. संक्षेप में, Hemi-जबड़ा पहले पशु से निकाल दिया जाता है, जबड़े की हड्डी ओष्ठ सी.एल. का पर्दाफाश करने के लिए निकाल दिया जाता है, और फिर ओष्ठ सीएल के collagenase के साथ व्यवहार किया जाता है आसपास के mesenchyme से उपकला अलग. सी.एल., microdissected सेल हदबंदी बफर के साथ इलाज किया, और टिशू कल्चर प्लेटों में चढ़ाया जाता है. अंतर्निहित जबड़े की हड्डी से ओष्ठ सी.एल. का पृथक्करण (चित्रा 3) और मीडिया की उचित मात्रा के अलावा क्रमशः, अलगाव और कालोनियों के विकास के लिए आवश्यक हैं. इस तकनीक का उपयोग का गठन छोटे, तंग उपकला कालोनियों, 7 दिनों (चित्रा -4 ए) द्वारा दिखाई दे रहे हैंऔर इन 2-3 सप्ताह (चित्रा 4 बी) के भीतर बड़ी कालोनियों में हो जाना.

चित्रा 1
चित्रा 1. वयस्क माउस छेनी के चित्र. (ए) वयस्क माउस Hemi-जबड़ा mineralized घटकों, तामचीनी और dentin, और दांत, दाढ़ और कृन्तक के दो प्रकार दिखा. DESCs रखे जाते हैं जहां समीपस्थ छेनी क्षेत्र में प्रकाश डाला है '. (ए') 2 स्टेम सेल आलों दिखा समीपस्थ छेनी के बाण के समान देखें, ओष्ठ और बहुभाषी ग्रीवा पाश (laCL और LiCl), मीना उत्पन्न कि ameloblasts, और डेंटिन कि फार्म ओडॉन्टोब्लास्ट. विशेष रूप से दंतमज्जाप्रसू पूर्वज कोशिकाओं को उत्पन्न करता है और अंततः laCL बाहरी तामचीनी उपकला दिखा. (ए'')'' छेनी तामचीनी एक में प्रकाश डाला है जो फार्म laCL, (OEE), तारामय जालिका (एसआर), आंतरिक तामचीनी उपकला (IEE), पारगमन-amplifying (टीए) क्षेत्र, और परत इंटर व्यक्ति (एसआई). एसआर भिन्न घनत्व के साथ subpopulations प्रतिबिंबित करने के लिए नीले और गहरे गुलाबी में प्रतिनिधित्व किया है. एक फ्लोरोसेंट संवाददाता माउस, KRT14-EGFP/Actb का उपयोग ग्रीवा पाश (बी) दृश्य. अस्थि अपेक्षाकृत autofluorescent है, और हड्डी को हटाने ग्रीवा पाश (बी) और फिर आसानी से excised जा सकता है जो उपकला, के बाकी को उजागर करता है. (बी'') OEE, IEE, टीए सहित ग्रीवा पाश की सभी संरचनाओं और एसआई आसानी से रिपोर्टर जीन के साथ देखे जा सकते हैं. स्केल सलाखों बी ', बी' = 2 मिमी, बी '= 50 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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माउस छेनी प्रक्रिया की. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व के सीएल के विच्छेदन और अलगाव की चित्रा 2. अवलोकन. सी.एल. जबड़े छेनी के समीपस्थ छोर पर स्थित है. पहला कदम बरकरार सीएल के साथ छेनी बेनकाब करने के लिए आसपास के जबड़े की हड्डी को दूर करने के लिए है. अगला, दांत अंग mesenchyme से अलग उपकला करने के लिए अलग और 2% collagenase में रखा गया है. 4 घंटा ऊष्मायन के बाद, सी.एल. मैन्युअल रूप से excised है एकल कक्षों में अलग, और मानक टिशू कल्चर प्लेटों के ऊपर सुसंस्कृत.

चित्रा 3
अंतर्निहित सी.एल. क्षेत्र का पर्दाफाश करने के लिए माउस जबड़ा के चित्रा 3. अस्थि हटाने. विच्छेदन की प्रक्रिया की हड्डी को हटाने के लिए दृश्य चौकियों दिखाए जाते हैं. (ए) Hemi-जबड़ा एक दिखाता हैfter चरण 1.5, मांसपेशी, पट्टा और बंध हड्डी से हटा रहे हैं. (बी) सी.एल. युक्त क्षेत्र की ओर proximally चलती है, सिर्फ 3 दाढ़ के नीचे से शुरू करने, हड्डी को हटाने शुरू करने के लिए क्षेत्र दर्शाती है. 2.4 चरण में के रूप में विख्यात अगला, सीएल के सभी हड्डी समीपस्थ, (सी) हटा दिया है. 2.5 कदम के रूप में कहा हड्डी के बाकी को दूर करने के लिए अगले चीरा (डी) में दिखाया गया है. अंत में, सी.एल. चरण 2.6 (ई) में कहा गया है शेष हड्डी से निकाल दिया जाता है, आवर्धित दृश्य (इनसेट).

चित्रा 4
चित्रा 4. विट्रो में सफल कॉलोनी गठन के प्रतिनिधि परिणाम है. 7 दिनों के लिए संस्कृति में चढ़ाना के बाद DESCs की ए चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी,. चुस्त कॉलोनी गठन सफल उपकला isolatio इंगित करता हैn कोई mesenchymal संदूषण के साथ. स्केल बार = 400 माइक्रोन. बी ऊष्मायन के 10 दिनों के बाद, कालोनियों आकार में बड़े होते हैं और कोशिकाओं को एक ठेठ उपकला cobblestone आकारिकी है. = 100 माइक्रोन स्केल बार. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

उपकला कोशिकाओं 40 साल पहले 21-24 ओवर सफलतापूर्वक पहले सुसंस्कृत थे, और अधिक हाल ही में, उपकला स्टेम कोशिकाओं 25-27 के सफल अलगाव उपकला जीव विज्ञान के हमारे ज्ञान को उन्नत किया है. हम वयस्क माउस छेनी की DESCs, दंत चिकित्सा और जीव विज्ञान तामचीनी गठन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि उपज की क्षमता है कि स्टेम कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत understudied आबादी को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट. इस प्रोटोकॉल शुरू में बाल कूप 28 से उपकला स्टेम सेल अलगाव की पिछली रिपोर्टों पर आधारित था. कई प्रोटोकॉल उपकला स्टेम कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए फीडर परतों और सीरम का उपयोग जबकि, हमारे विधि एक फीडर मुक्त, सीरम मुक्त प्रणाली है. हालांकि, हमारे विकास मीडिया EGF, FGF2 और B27 पूरक के एक कॉकटेल के उपयोग की आवश्यकता होती है. EGF लंबे undifferentiated कोशिकाओं 29 बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है. B27 के साथ EGF और FGF2 के एक कॉकटेल संस्कृति बाल कूप स्टेम सेल 27 के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया था, और बी27 व्यापक रूप से संस्कृति 30,31 में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. हम भी पहले से टिशू कल्चर प्लास्टिक के ऊपर और ईसीएम substrates की एक किस्म पर DESCs की व्यवहार्यता और विकास दर विशेषताओं मापा है, और कोई मतभेद प्रसार 19 की दरों में पाया गया. कोशिकाओं के लिए 10 धारावाहिक मार्ग 19 के लिए बनाए रखा जा सकता है.

हम क्योंकि ऊपरी incisors की तुलना में हटाने की आसानी से इस प्रक्रिया के लिए कम incisors का उपयोग करें. अलगाव के दौरान हमारे प्रोटोकॉल के भीतर सबसे महत्वपूर्ण कदम collagenase और सीएल के लिए एक साफ microdissection में रखने से पहले जबड़े की हड्डी से सी.एल. क्षेत्र की पूरी तरह हटाने की हैं. समीपस्थ छेनी बहुत नाजुक होती है, इसलिए यह ओष्ठ सीएल के नुकसान में परिणाम सकता है, जो विच्छेदन के दौरान यह नुकसान नहीं है महत्वपूर्ण है. अधूरी हटाने labialCL के अवशेष और DESCs की कम उपज को बढ़ावा मिलेगा. इसके अलावा, यह गैर सी के साथ संक्रमण से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैएल उपकला कोशिकाओं. उपकला mesenchyme से अलग होने के बाद इस प्रकार, एक साफ वी के आकार का चीरा पड़ोसी उपकला से ओष्ठ सी.एल. दूर करने के लिए किया जाना चाहिए. अंत में, यह मिलीलीटर प्रति 4 10 एक्स 1 से अधिक कोशिकाओं के एक एकाग्रता में इन कोशिकाओं की थाली और पहली मीडिया परिवर्तन के लिए वातानुकूलित मीडिया के आधे छोड़ने के लिए आवश्यक है.

चिकित्सकीय अनुसंधान के लिए इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ यह है कि कुशल उत्पादन और इन विट्रो में DESCs के हेरफेर की अनुमति देता है. माउस छेनी एक में vivo मॉडल 7-9,12,32-34, एक में इन विट्रो प्रणाली के विकास के रूप में स्थापित किया जाता है vivo में प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि प्रयोगों के लिए दरवाजे खोलने के द्वारा चिकित्सकीय अनुसंधान के क्षेत्र अग्रिम. इस प्रणाली का लाभ आसानी से विभिन्न संस्कृति की स्थिति, एकल या यहां तक ​​कि कई संकेत दे रास्ते के लिए आसान लक्ष्यीकरण में कोशिकाओं में हेरफेर करने की क्षमता, और प्रादेशिक सेना के निषेध या सक्रियण शामिलsiRNA या वृद्धि कारकों का उपयोग rgeted अणुओं. इस में इन विट्रो प्रणाली के बहाव के अनुप्रयोगों विशेष रूप से एकल कोशिका के स्तर पर, कार्यात्मक और / या यंत्रवत अध्ययन का संचालन करने के लिए ऊपर सूचीबद्ध तकनीक के साथ ही अन्य अत्याधुनिक तकनीक का उपयोग शामिल है.

कुल मिलाकर, इन विट्रो संस्कृति में DESC से gleaned जानकारी स्टेम सेल आधारित दांत नवीकरण की पेचीदगियों को जानने के लिए मदद कर सकते हैं.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष है.

Acknowledgments

लेखकों DESC संस्कृतियों के साथ प्रारंभिक सहायता के लिए Xiu-पिंग वैंग धन्यवाद. लेखकों (ओह MGC, K08-DE022377-02 के लिए AHJ, K12-GM081266 को K99-DE022059, और ODK लिए R01-DE021420) के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से फैलोशिप और अनुदान द्वारा वित्त पोषित में भाग रहे हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps, size 5 Fine Science Tools 11251-30 FST by Dumont, Dumoxel
Forceps straight, fine, 3.5 Roboz RS5070
Razorblades Electron Microscopy Services #71960
Scalpel Handle No. 3 VWR
Feather Blade No. 15 Electron Microscopy Services #72044-15 Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered Worthington Biochemical Corporation #4214
Insulin syringe BD #329424
Accumax EMD Millipore #SCR006
DMEM/F12 Gibco 11320-033
EGF R&D 2028-EG-200
FGF2 R&D 233-FB-025
B27 Supplement Gibco 10889-038

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Chavez, M. G., Hu, J., Seidel, K., Li, C., Jheon, A., Naveau, A., Horst, O., Klein, O. D. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. J. Vis. Exp. (87), e51266, doi:10.3791/51266 (2014).

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