Abstract
प्रोटोकॉल मात्रा पुनर्निर्माण 3D आकार और कोशिकाओं से बना macrostructures के स्तर पर एक अंग की मात्रा परिवर्तन के अध्ययन की सुविधा. यह भी बड़ा मेडिकल इमेजिंग और चिकित्सा में उपन्यास तकनीक और एल्गोरिदम जांच और मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विभिन्न अंगों 1,2,3 के 3 डी उच्च संकल्प atlases बनाना ऊतक विज्ञान मात्रा पुनर्निर्माण की एक और आवेदन है. इस ऊतक संरचनाओं और विभिन्न सेलुलर सुविधाओं के बीच स्थानिक संबंध की जांच के लिए एक संसाधन उपलब्ध कराता है. हम ऑप्टिकल blockface छवियों का एक सेट का उपयोग करता है जो ऊतक विज्ञान मात्रा पुनर्निर्माण के लिए एक छवि पंजीकरण दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं. खंगाला ऊतक विज्ञान मात्रा कोई प्रचारित बाद के प्रसंस्करण के पंजीकरण त्रुटि के साथ कार्रवाई नमूना का एक विश्वसनीय आकार का प्रतिनिधित्व करता है. दो माउस स्तन ग्रंथियों के hematoxylin और eosin (एच एंड ई) दाग वर्गों एड से निकाले सीमा अंक का उपयोग कर उनके इसी blockface छवियों को दर्ज किए गए थेऊतक विज्ञान और blockface छवियों में नमूना की GES. पंजीकरण की सटीकता नेत्रहीन मूल्यांकन किया गया था. स्तन ग्रंथियों के macrostructures के संरेखण भी नेत्रहीन उच्च संकल्प पर मूल्यांकन किया गया था.
इस अध्ययन स्तन ग्रंथि के छांटना से 3 डी ऊतक विज्ञान मात्रा पुनर्निर्माण के माध्यम से लेकर, इस छवि पंजीकरण पाइपलाइन के विभिन्न चरणों रूपरेखा बनाती है. 2 डी ऊतक विज्ञान छवियों वर्गों के जोड़े के बीच बुनियादी फर्क पता चलता है, वहीं 3 डी ऊतक विज्ञान मात्रा आकार और स्तन ग्रंथियों की मात्रा में अंतर कल्पना करने की क्षमता प्रदान करता है.
Introduction
IGFBP7 (प्रोटीन 7 बाध्यकारी वृद्धि कारक जैसे इंसुलिन) IGF बंधनकारी प्रोटीन परिवार का एक सदस्य है, और IGF1 रिसेप्टर 4 बाध्य करने के लिए दिखाया गया है. Xenograft ट्यूमर मॉडल में IGFBP7 के reintroduction बहुत apoptosis और सेलुलर senescence 7 की प्रेरण के माध्यम से 6 विकास ट्यूमर को रोकता है, जबकि IGFBP7 के नीचे विनियमन, स्तन कैंसर 5 में गरीब पूर्वानुमान के साथ सहसंबद्ध किया जाता है. IGFPB7 के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, एक IGFBP7 अशक्त माउस 5 (अप्रकाशित डेटा) बनाया गया था. इन चूहों के ट्यूमर विकसित नहीं करते हैं, वे अंडाशय, मांसपेशियों और जिगर की ऊतक विज्ञान में परिवर्तन के साथ ही स्तन ग्रंथि विकास patterning (अप्रकाशित डेटा) में दोष दिखा. अशक्त चूहों छोटे कूड़े के आकार की है और कई बड़े litters (अप्रकाशित डेटा) को बनाए रखने में असमर्थ हैं के रूप में दोषपूर्ण phenotype के पहले संकेत दिया गया था.
3 डी ऊतक विज्ञान संस्करणों उपयोगी informat प्रदान करने की क्षमता हैबड़ा चिकित्सा छवियों में वैकृत निष्कर्षों की मात्रात्मक और तुलनात्मक विश्लेषण और मूल्यांकन के लिए आयन. तीन आयामी confocal, दो photon माइक्रोस्कोपी स्थानीय हद 14 में ग्रंथि के उच्च संकल्प सेल रूपात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं, लेकिन यह देखने और गहराई का एक सीमित क्षेत्र है. प्रोटोकॉल मात्रा पुनर्निर्माण एक बहुत बड़ा स्थानिक हद पर अधिक जानकारी प्रदान करता है. कुछ विरूपण ऐसे संकोचन, विस्तार, आँसू, और परतों के रूप में ऊतकीय वर्गों, की तैयारी के दौरान अनुमान है पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर. इन विकृतियों यह मुश्किल एक 3 डी की मात्रा के पुनर्निर्माण के लिए एक 3 डी ढेर में सीरियल ऊतकीय छवियों रजिस्टर करने के लिए बनाते हैं. दोष के साथ लगातार वर्गों की संख्या बरकरार वर्गों के बीच समानता बढ़ जाती है के रूप में कम और फलस्वरूप पंजीकरण प्रक्रिया को और अधिक जटिल बना देता है.
विभिन्न तरीकों ऊतकीय वर्गों रजिस्टर करने के लिए और एक निरंतर ऊतक विज्ञान Vo बनाने के लिए प्रस्तावित किया गया हैlume. कुछ तकनीकों तीव्रता विविधताओं 8 पर निर्भर करती है, और दूसरों के धारा 9 के आकार के आधार पर कर रहे हैं. कुछ नमूनों के लिए संरचनात्मक ढांचे मील का पत्थर आधारित पंजीकरण तरीकों 12,13 के साथ स्थलों 10,11 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. लेकिन इन आंतरिक संरचना पूरी मात्रा में और कोई विश्वसनीय संरचनात्मक ढांचे पहचाना जा सकता है कुछ नमूनों के लिए detectable नहीं हो सकता है. कुछ समूह एक जोड़ी वार पंजीकरण दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया और लगातार ऊतक विज्ञान छवियों आकृति या संरचनात्मक ढांचे 16-18 का उपयोग कर एक दूसरे के लिए पंजीकृत किया है. संदर्भ छवियों के उपयोग के बिना एक दूसरे को धारावाहिक ऊतक विज्ञान वर्गों का पंजीयन पंजीकरण त्रुटि प्रचार और ऊतक विज्ञान मात्रा के वास्तविक आकार को बदल सकता है. जोड़ी वार पंजीकरण दृष्टिकोण छवियों के ढेर भर में ऊतक विज्ञान वर्गों और आंतरिक संरचना के आकार की स्थिरता पर निर्भर करता है; इसलिए यह नमूना के घने नमूने, जो आवश्यकतानैदानिक नमूनों के लिए, उदाहरण के लिए, हो सकता है हमेशा संभव नहीं.
इस पाइपलाइन में हम ऊतक विज्ञान मात्रा पुनर्निर्माण 19 के लिए संदर्भ छवियों का एक सेट के रूप में blockface छवियों का उपयोग करें. Blockface छवियों सूक्ष्म पर बढ़ते के बाद आयल ऊतक ब्लॉक का लिया जाता है और प्रत्येक अनुभाग में कटौती होने से पहले. इस प्रकार, व्यक्तिगत धारावाहिक वर्गों में कटौती करने के लिए क्षति धारावाहिक वर्गों 8,11,15 के पंजीकरण के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. हम अन्य समूहों से एक अलग तरीके से blockface छवियों पर कब्जा. ऑप्टिकल ब्लॉक अंकित छवियों प्रकाशिकी में नियमित लेंस का उपयोग करते समय आमतौर पर तब होता है, जो प्रति बैरल और परिप्रेक्ष्य विरूपण, समाप्त करने या कम करने के लिए एक telecentric लेंस से प्राप्त कर रहे हैं. यह नियमित रूप से लेंस का उपयोग blockface इमेजिंग प्रदर्शन जो अन्य प्रकाशित तरीकों, पर प्रस्तावित दृष्टिकोण के लाभ में से एक है. छवियों Tiss के बीच विपरीत वृद्धि के लिए ब्लॉक की सतह का प्रतिबिंब का उपयोग करने के लिए एक मामूली तिरछा कोण पर लिया जाता हैUE और आयल सतह और आयल सतह के नीचे गहराई में ऊतक की छाया को समाप्त करने के लिए. एक फोटो फिल्टर भी ब्लॉक सतह और इसके विपरीत 19 संतुलन के लिए ऊतक से आने वाले प्रकाश फूट डालना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है. रोटरी सूक्ष्म तक्षणी पर ब्लॉक के विस्थापन के लिए ठीक करने के लिए दो से तीन छेद blockface छवियों में आसानी से detectable हैं जो ब्लॉक के कोनों में ड्रिल किए जाते हैं. इन छेद के centroids blockface छवियों के लिए पंक्ति में मील का पत्थर आधारित कठोर पंजीकरण के साथ किया जाता है.
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Protocol
1. नमूना
- तीन दिनों स्तनपान की शुरुआत पोस्ट जंगली प्रकार CDH1 से शल्य चिकित्सा स्तन ग्रंथियों के साथ ही IGFBP7-अशक्त चूहों आबकारी.
- देशी स्तन ग्रंथि आकारिकी हासिल करने में मदद करने के लिए गिलास स्लाइड पर ग्रंथियों बिखरा हुआ है.
2. फिक्सेशन और ऊतक प्रसंस्करण
- 4 ओ सी में तटस्थ बफर 4% पीएफए हे / एन में स्तन ग्रंथियों फिक्स
- पूर्व ऊतक प्रसंस्करण के लिए 70% इथेनॉल में ग्रंथियों स्टोर.
- छोटे ऊतक प्रसंस्करण कैसेट के ग्रंथियों स्थानांतरण.
- एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर का उपयोग ऊतकों को संसाधित
- 45 मिनट के लिए xylene में 1 घंटा और 2 बार के लिए 100% इथेनॉल में, 45 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में 45 मिनट, 2 बार के लिए 3 बार 70% इथेनॉल इथेनॉल और xylene स्नान बढ़ाने में ऊतकों निर्जलीकरण.
- लागू दबाव के साथ एक निर्वात में 1 घंटा प्रत्येक के लिए आयल 3 बार के साथ ऊतकों तर.
- ब्लॉकों के लिए फार्म आयल में ऊतकों शामिल करें, सेक्शनिंग के लिए.
3. प्रोटोकॉल और Blockface इमेजिंग
- अतिरिक्त तेल निकाल दिया जाता है जब तक एक रोटरी सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग कर तेल ब्लॉकों ट्रिम.
- कैसेट सीधा करने के लिए तेल ब्लॉक के कम से कम दो कोनों में 1 मिमी छेद ड्रिल करने के लिए एक ऊर्ध्वाधर मिलिंग मशीन का प्रयोग करें.
- रोटरी सूक्ष्म तक्षणी पर ऊतक ब्लॉक माउंट.
- सूक्ष्म तक्षणी के सामने blockface इमेजिंग प्रणाली 19 की स्थापना की.
- पूर्व सेक्शनिंग करने के लिए ऑप्टिकल blockface छवि पर कब्जा.
- सूक्ष्म पर 5 माइक्रोन मोटाई से कम चार वर्गों का रिबन काट दिया.
- ठंडे पानी से स्नान करने के लिए रिबन स्थानांतरण.
- रिबन के दूसरे और चौथे वर्गों के लिए अलग और खुर्दबीन स्लाइड पर उन्हें माउंट. दूसरे और चौथे वर्गों का चयन वर्गों के बीच एक 5 माइक्रोन अंतराल प्रदान करता है.
- यह खुर्दबीन स्लाइड पर फिर से माउंट तो, यह unwrinkle को एक गर्म पानी से स्नान (48 ओ सी) में प्रत्येक अनुभाग का विस्तार करें.
नोट: सीutting, बढ़ते वर्गों ऐसे आंसू, गुना, संकोचन, और विस्तार के रूप में खंड पर कुछ विकृतियों का कारण unwrinkling. इन कलाकृतियों ऊतक विज्ञान वर्गों के पंजीकरण उलझा. - एक स्वचालित बदनाम करने वाला का उपयोग एच ई के साथ वर्गों दाग.
- एक स्वत: coverslipper का उपयोग कर स्लाइड coverslip.
- ब्याज के प्रस्ताव पर एक डिजिटल ऊतक विज्ञान स्लाइड स्कैनर का उपयोग कर स्लाइड digitize. इस प्रोटोकॉल के लिए बढ़ाई 20x है और संकल्प 0.47 मीटर है.
- Blockface छवियों, 18 माइक्रोन का समाधान करने के लिए ऊतक विज्ञान छवियों नीचे नमूना.
4. छवि पंजीकरण
- छवि विभाजन और बिंदु चयन
- Blockface में छवियों पंजीकरण छेद के पिक्सेल मूल्यों को मापने और खंड आयल ब्लॉक के कोनों में पंजीकरण छेद करने के लिए एक निश्चित सीमा के रूप में औसत मूल्य का उपयोग करें.
- कुछ अतिरिक्त भागों में भी खंडों से किया जा सकता है के बाद सेतय सीमा का उपयोग कर, घेरा और छेद खोजने के लिए और अतिरिक्त वस्तुओं त्यागने के लिए खंडों वस्तुओं के क्षेत्र का उपयोग करें. ऐसा करने के लिए एक छोटे से कोड लिखने और खंडों वस्तुओं के लिए (4π एक्स क्षेत्र) / (परिधि) 2 के अनुपात को खोजने के लिए. दौर वस्तुओं के लिए यह अनुपात 1 है.
- प्रत्येक स्तन ग्रंथि के लिए, संदर्भ के रूप में एक blockface छवि का चयन और पंजीकरण छेद और मील का पत्थर आधारित पंजीकरण तकनीक के केंद्र का उपयोग करके संदर्भ के लिए blockface छवियों के बाकी संरेखित.
- गठबंधन blockface छवियों के लिए, मैन्युअल रूप से खंड या पृष्ठभूमि से ऊतक निकालने. प्रोटोकॉल के आराम के लिए नकाब में सबसे बड़े आकार का वस्तु का प्रयोग करें.
- एच एंड ई के लिए वर्गों स्वचालित विभाजन के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें.
- पृष्ठभूमि से खंड छवियों Otsu thresholding तकनीक 20 का प्रयोग करें और ऊतक विज्ञान छवियों के द्विआधारी मास्क बनाने.
- पहचानें और ज का उपयोग कर एक मुखौटा में सबसे बड़े आकार का ऑब्जेक्ट का चयनलेबल वस्तुओं की istogram.
- ऊतक विज्ञान और blockface मास्क दोनों से एक पिक्सेल व्यापक सीमा अंक निकालें.
- Piecewise रैखिक के एक दृश्य से सीमा अंक का प्रतिनिधित्व करने के लिए, चैन कोड एल्गोरिथ्म 21 का प्रयोग फिट बैठता है.
- प्रारंभिक कठोर पंजीकरण
- प्रारंभिक कठोर ऊतक विज्ञान की सीमा अंक और उनके इसी blockface छवियों के बीच बदलना लगता है, फूरियर Descriptors एल्गोरिथ्म 22 का प्रयोग करें. यह प्रारंभिक बदलना अनुवाद, रोटेशन और पैमाने कारकों में शामिल हैं.
- प्रारंभिक पिछले चरण से प्राप्त हस्तांतरण के साथ प्रत्येक ऊतक विज्ञान छवि बदल.
- कठोर पंजीकरण के शोधन
- एक रोलिंग गेंद फिल्टर 23 का उपयोग ऊतक विज्ञान समोच्च से उच्च वक्रता बढ़त वर्गों निकालें.
- बेतरतीब ढंग से समान वितरण का उपयोग कर शेष ऊतक विज्ञान सीमा अंक से 500 अंक का चयन करें.
- रूपांतरणफूरियर वर्णनकर्ता से प्राप्त प्रारंभिक परिवर्तन के साथ ऊतक विज्ञान यादृच्छिक सीमा अंक.
- Blockface सीमा अंक के पूरे सेट का चयन करें और blockface सीमा अंक, गंतव्य, और ऊतक विज्ञान यादृच्छिक सीमा बिंदुओं के बीच कठोर परिवर्तन को खोजने के लिए चलने का निकटतम बिंदु (आईसीपी) एल्गोरिथ्म 24 का उपयोग करें.
- गठबंधन ऊतक विज्ञान पिछले चरण से प्राप्त छवियों और गठबंधन ऊतक विज्ञान छवियों के ढेर ऊतक विज्ञान मात्रा बनाता है रूपांतरण.
- ऊतक विज्ञान मात्रा के एक दृश्य की छवि बनाने के लिए एक 3 डी दृश्य सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
- 5x बढ़ाई छवियाँ का ढेर देखना
- बढ़ाई 5x को मूल ऊतक विज्ञान छवियों नीचे नमूना.
- ऊतक विज्ञान छवियों में से एक में रुचि के क्षेत्र फसल.
- पंजीकरण के दो चरणों से कठोर परिवर्तनों के संयोजन का उपयोग अन्य 5x ऊतक विज्ञान छवियों में उस क्षेत्र के स्थान की गणना.
- Regi फसलअन्य सभी ऊतक विज्ञान छवियों में एक ही आकार के क्षेत्र के लिए ब्याज की ons.
- अंत में मैन्युअल रूप से क्षेत्रों के बीच संरेखण को निखारने. दो छवियों ओवरले और रोटेशन और एक दूसरे से अधिक छवियों में से एक के अनुवाद के लिए मूल्यों को चुनने के लिए अनुमति देता है और फिर संरेखण स्वीकार किया जाता है जब तब्दील छवि बचाता है कि एक कार्यक्रम लिखें.
- एक 3 डी दृश्य सॉफ्टवेयर का उपयोग गठबंधन 5x ऊतक विज्ञान क्षेत्रों के ढेर देखें.
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Representative Results
पारंपरिक माइक्रोस्कोपी तकनीक की एक ख़तरा सूक्ष्म स्तर पर एक अंग की समझ एक समय में एक क्षेत्र के दृश्य करने के लिए सीमित है. यहां तक कि पूरे स्लाइड वर्गों प्रदान जो "कुल प्रकटीकरण" स्लाइड्स, तीन आयामी जानकारी प्रदान करने में विफल. पूरे स्लाइड, गतिशील स्कैनिंग तकनीक, अपनी संपूर्णता में एक खंड को देखने के लिए हमारी क्षमता में वृद्धि हुई है, के विकास के साथ हालांकि संरचनाओं extrapolating 3D ऊतक विज्ञान मात्रा पुनर्निर्माण की आवश्यकता है.
बेहतर IGFBP7 अशक्त माउस की कमी को चिह्नित करने के लिए, स्तन ग्रंथियों की 3 डी पुनर्निर्माण स्तनपान के 3 दिनों के बाद प्रारंभ excised ग्रंथियों पर प्रदर्शन किया गया. चित्रा 1 3D ऊतक विज्ञान पुनर्निर्माण के लिए प्रस्तावित दृष्टिकोण की पाइप लाइन से पता चलता है. blockface छवियों पहली आयल ब्लॉक के कोनों में छेद का उपयोग जुड़ रहे हैं. 2A बी जंगली प्रकार और IGFBP7 अशक्त mamm की blockface मात्रा दिखाने के आंकड़ेआरे ग्रंथियों क्रमशः. ऊतक विज्ञान छवियों तो ऊतक विज्ञान संस्करणों के पुनर्निर्माण के लिए उनके इसी गठबंधन blockface छवियों पंजीकृत हैं. 3 ए बी जंगली प्रकार और IGFBP7 अशक्त स्तन ग्रंथियों की खंगाला ऊतक विज्ञान संस्करणों को दिखाने के आंकड़े. समग्र संरचनाओं (वीडियो ए और बी) को देख कर हम उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार ग्रंथियों के बीच आकार में अंतर देख सकते हैं. हालांकि, इस के साथ साथ वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर, यह इस आकार अंतर लंबाई और चौड़ाई लेकिन दिलचस्प नहीं गहराई में है कि स्पष्ट हो जाता है. IGFBP7 अशक्त ग्रंथि गहरी 1.02 मिमी था, जबकि इस पायलट प्रयोग में इस्तेमाल ग्रंथियों के लिए, जंगली प्रकार ग्रंथि, 1.06 मिमी गहरी थी. तुरंत ध्यान देने योग्य अन्य फेनोटाइप eosin धुंधला (गुलाबी क्षेत्रों) द्वारा चिह्नित के रूप में, दो ग्रंथियों की स्ट्रोमल घटकों में अंतर है. अशक्त ग्रंथियों मुख्य रूप से stromal ऊतकों होना दिखाई देते हैं, जबकि जंगली प्रकार ग्रंथियों, छोटी stromal ऊतक है. वीडियो सी और डी को देखते समय इस अंतर को विशेष रूप से स्पष्ट हैवीडियो (hematoxylin साथ धुंधला) केवल nucleated कोशिकाओं होते हैं, इन वीडियो से हम जंगली प्रकार ग्रंथि मुख्य रूप से ग्रंथियों संरचनाओं ऐसा प्रतीत होता है, जबकि अशक्त ग्रंथि, इसकी घनत्व का कहना है कि देख सकते हैं. विकास के लिए वीडियो में वर्गों के बीच अंतर रखने के दृश्य के साथ सहायता करने के लिए दो बार मूल अंतर रखने के लिए बढ़ा दी गई है. इसकी जांच करने के लिए, छवियों उच्च संकल्प में लिम्फ नोड के पास गठबंधन किया गया, यह हमें ग्रंथियों धारावाहिक वर्गों में बदल रहे हैं देखने के लिए कैसे अनुमति देता है. जंगली प्रकार ग्रंथि में हम दूध (वीडियो ई और एफ) के साथ भर दिया गया होता जिसमें बड़ी संरचनाएं, देख सकते हैं. इसके विपरीत IGFBP7 अशक्त ग्रंथि कुछ अच्छी तरह से विकसित संरचनाओं है. इसके अलावा, इन संरचनाओं fibroblast कोशिकाओं की तरह साथ भीड़ थे.
IGFBP7 अशक्त माउस के साथ एक प्रमुख दोष बड़े litters बनाए रखने की क्षमता है, यह जंगली प्रकार और अशक्त ग्रंथियों के बीच संरचनात्मक अंतर योगदान कर सकता है कि प्रस्तुत तुलना के माध्यम से स्पष्ट हैमनाया phenotype 25 को. वायुकोशीय मात्रा बहुत बड़े litters खिलाने के लिए अपर्याप्त दूध की मात्रा का संकेत नल ग्रंथियों के भीतर कम है. हम अशक्त ग्रंथि केवल 19.6291 3 मिमी मापा जबकि जंगली प्रकार ग्रंथि की कुल मात्रा 82.8879 3 मिमी था कि निर्धारित.
चित्रा 1. 3D पुनर्निर्माण प्रक्रिया में शामिल कदम चित्रण योजनाबद्ध. चौथे वंक्षण माउस स्तन ग्रंथियों उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया. स्तन ग्रंथियों तो संसाधित और आयल एम्बेडेड, सामान्य और अशक्त चूहों से काटा गया. पंजीकरण छेद ब्लॉक चेहरा इमेजिंग और ग्रंथियों के धारावाहिक सेक्शनिंग द्वारा पीछा तेल ब्लॉकों में drilled थे. धारा चार वर्गों के रिबन में लिया गया. प्रथम खंड खंड सामना करना पड़ा था प्रायर (बैंगनी outl सेक्शनिंग लिए imagedINE), 2 और 4 वें वर्गों (लाल रूपरेखा) एच एंड ई धुंधला और स्कैनिंग के लिए चुना गया है. ब्लॉक अंकित छवियों (पंजीकरण छेद का उपयोग) गठबंधन और मैन्युअल खंडों थे. एच ई वर्गों नीचे नमूना तो 20x संकल्प में डिजीटल थे; इन छवियों को स्वचालित खंडों थे. खंडों छवियों के दोनों सेट सीमा बिंदु चयन और पंजीकरण के लिए किए गए थे. Outputs 3 डी ऊतकीय संस्करणों के साथ ही उच्च संकल्प क्षेत्र हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
प्रत्येक अनुभाग में कटौती किए जाने से पहले चित्रा 2. Blockface वॉल्यूम. सूक्ष्म पर घुड़सवार आयल ब्लॉक के ऑप्टिकल छवियों प्राप्त कर रहे हैं. पर drilled छेद के केन्द्रकतेल ब्लॉक के कोनों blockface छवियों को संरेखित और blockface मात्रा बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. छवि (एक) 3 दिनों में जंगली प्रकार स्तन ग्रंथि स्तनपान की प्रेरण पोस्ट से पता चलता है और (बी) IGFBP7 अशक्त स्तन ग्रंथि के लिए एक ही समय बिंदु से पता चलता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. प्रोटोकॉल मात्रा. ऊतक विज्ञान मात्रा को फिर से संगठित करने के लिए उनके इसी गठबंधन blockface छवियों पंजीकृत ऊतक विज्ञान छवियाँ. (ए) जंगली प्रकार ग्रंथि और (बी) IGFBP7 अशक्त स्तन ग्रंथि, 3 दिन स्तनपान प्रेरण पोस्ट. कृपयाइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
इस अध्ययन में, हम ऊतक विकृत हो सकता है जो ऊतक के भीतर आंतरिक बेतरतीब ढंग से चयनित स्थलों या प्रत्यारोपित मापकला मार्कर, की आवश्यकता नहीं है जो धारावाहिक 2D ऊतक विज्ञान छवियों, से एक 3 डी ऊतक विज्ञान मात्रा के पुनर्निर्माण के लिए एक छवि पंजीकरण कार्यप्रवाह विकसित किया है. वर्णित विधि द्वारा, ऑप्टिकल blockface चित्र खुद पूर्व सेक्शनिंग के संदर्भ छवियों के रूप में उपयोग किया जाता है. हम blockface छवियों aligning में सहायता करने के लिए और कैमरे के सामने तेल ब्लॉक की 2 डी आड़ा आंदोलन के लिए सही करने के लिए तेल ब्लॉक में drilled बाहरी छेद का उपयोग करें. दोषपूर्ण धारावाहिक वर्गों ब्लॉक से परिणाम भी जब 2 डी ऊतक विज्ञान छवियों, पंजीकरण त्रुटि के प्रसार को रोकने और एक सटीक ऊतक विज्ञान मात्रा को फिर से संगठित करने के लिए इसी 2D blockface छवियों गठबंधन कर रहे हैं. ऊतक के प्रकार और इस्तेमाल ऊतक विज्ञान दाग की कार्यप्रवाह स्वतंत्र बनाने के क्रम में, सीमा अंक पंजीकरण बाहर ले जाने के लिए उपयोग किया जाता है. इस बिंदु आधारडी दृष्टिकोण यह बहुत बड़ा डिजिटल विकृति छवियों से निपटने के लिए कम computationally मांग की है और इसलिए बेहतर करने में सक्षम है कि (तीव्रता आधारित दृष्टिकोण से अधिक) लाभ दिया है.
ऊतक विज्ञान छवियों के लिए पंक्ति में blockface छवियों का उपयोग करने का एक और लाभ ऊतक विज्ञान छवियों के बीच अंतर रखने के ऊतक विज्ञान मात्रा बनाने के लिए उनके संरेखण की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करता है. यह वर्गों के बीच अंतर रखने, व्यापक रूप से एक आधा सेंटीमीटर के रूप में अक्सर के रूप में महान भिन्न हो सकते हैं, जहां नैदानिक सेटिंग में महत्वपूर्ण है.
इस पत्र के दौरान हम दृष्टिकोण अलग संरचनाओं और तीव्रता बदलाव के साथ दो अलग अलग स्तन ग्रंथियों के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि पता चला है. दृष्टिकोण वर्गों की सीमा का उपयोग करता है, अलग ग्रंथियों के बीच भिन्नता की डिग्री छोटा है. पहले हम भी एक और पूर्व नैदानिक मॉडल 19 के लिए दृष्टिकोण की क्षमता दिखाई है. के रूप में विभिन्न प्रकार के ऊतकों अलग biomechanical पी हैroperties, पंजीकरण त्रुटि विभिन्न नमूनों के लिए बदलने की उम्मीद है. हम पाइप लाइन काफी ठोस नमूने, जैसे, मानव ट्यूमर xenografts पर लागू होता है कि लगता है. भविष्य में हम आगे इस तरह के मानव स्तन के ऊतकों के रूप में अन्य नमूनों का प्रयोग करके 3D पुनर्निर्माण पाइपलाइन की सटीकता की जांच करेंगे.
प्रस्तावित कार्यप्रवाह के अन्य सीमित कारकों में से एक blockface छवियों का मार्गदर्शन विभाजन है. इस सीमा (MRF) मॉडल खंड के लिए 26,27 blockface छवियों में पृष्ठभूमि से नमूना मार्कोव रैंडम फील्ड का उपयोग करके उदाहरण के लिए, एक स्वचालित बनावट विभाजन दृष्टिकोण विकसित करके हटाया जा सकता है.
जंगली प्रकार और IGFBP7 अशक्त स्तन ग्रंथियों की परीक्षा के माध्यम से, हम दोनों ग्रंथियों के अलग अलग वर्गों के लिए एक व्यापक समग्र के माध्यम से 3 डी में ग्रंथियों की संरचना और संरचना में अंतर की पहचान करने में सक्षम थे. आगे चरित्र में सहायता प्राप्त इस तकनीकसेलुलर स्तर पर IGFBP7 अशक्त फेनोटाइप terizing, और वायुकोशीय मात्रा में स्पष्ट मतभेद इस मॉडल 25 में देखा दोषों के कुछ योगदान कर सकते हैं कि पता चला है.
इस दृष्टिकोण से महत्वपूर्ण क्षमता यह ऊतक प्रकार और तीव्रता विविधताओं से स्वतंत्र है और इस तरह यह विभिन्न पूर्व नैदानिक और नैदानिक नमूनों के ऊतक विज्ञान मात्रा को फिर से संगठित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण के अन्य फायदों में से एक यह एक विशिष्ट दाग पर निर्भर नहीं है. इस समोच्च आधारित दृष्टिकोण इसलिए जब तक यह पूरी अनुभाग या ऊतक विज्ञान और blockface छवियों दोनों में detectable है जो एक संरचना, का एक स्पष्ट समोच्च का स्पष्ट समोच्च प्रदान करता है, के रूप में किसी भी दाग के साथ संगत है. ट्यूमर के आकार, मात्रा, और विविधता की जांच 3 डी ऊतक विज्ञान मात्रा के नैदानिक अनुप्रयोगों में से एक है. इस पत्र में हम प्रस्तावित दृष्टिकोण 3D ऊतक विज्ञान मात्रा का पुनर्निर्माण करने में सक्षम है और हमें आगे हो सकता है पता चला है कितुलना, दृश्य और अन्य नमूनों के विश्लेषण के लिए एड.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% PFA | VWR International | 15710 | 16% Paraformaldehyde solution |
| Small tissue processing cassettes | VWR International | CA95029-956 | |
| Leica ASP300 automated tissue processor | Leica | 14047643515 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | S25307B | |
| Xylene | VWR International | CA95057-822 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 39501006 | Paraplast tissue embedding medium |
| Leica EG 1160 embedding center | Leica | ||
| Leica rotary microtome | Leica | ||
| Milling machine | Argo | ||
| Microscope slides | VWR International | CA48312-015 | |
| H&E stain | VWR International | ||
| Automatic stainer | |||
| Coverslips | VWR International | 48404-452 | |
| MEDITE RCM 7000 glass coverslipper | MEDITE | ||
| Leica SCN400 slide scanner | Leica | ||
| MATLAB | MathWorks Inc | MATLAB 2007b | Development software |
| MeVisLab | MeVis Medical Solutions AG | MeVisLab 2.1 | 3D visualization software |
References
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