Abstract
Reconstrucción volumen Histología facilita el estudio de la forma 3D y el cambio de volumen de un órgano a nivel de macro-estructuras formadas por células. También se puede utilizar para investigar y validar nuevas técnicas y algoritmos en imágenes médicas volumétrica y terapias. La creación de los atlas 3D de alta resolución de los diferentes órganos 1,2,3 es otra aplicación de la reconstrucción del volumen histología. Esto proporciona un recurso para la investigación de las estructuras de tejido y la relación espacial entre diferentes características celulares. Presentamos un método de registro de imágenes para la reconstrucción del volumen histología, que utiliza un conjunto de imágenes blockface ópticos. El volumen histología reconstruida representa una forma fiable de la muestra procesada sin error de registro post-procesamiento propagado. Los hematoxilina y eosina (H & E) manchadas secciones de dos glándulas mamarias de ratón se registraron a sus imágenes blockface correspondientes utilizando puntos de los límites extraídos del edbios de la muestra en la histología y blockface imágenes. La precisión del registro se evaluó visualmente. La alineación de las macroestructuras de las glándulas mamarias también se evaluó visualmente en alta resolución.
Este estudio delinea las diferentes etapas de esta tubería de registro de imágenes, que van desde la escisión de la glándula mamaria a través de volumen histología reconstrucción 3D. Mientras que las imágenes de histología 2D revelan las diferencias estructurales entre pares de secciones, el volumen de la histología en 3D proporciona la capacidad de visualizar las diferencias en la forma y el volumen de las glándulas mamarias.
Introduction
IGFBP7 (la insulina como factor de crecimiento de la proteína de unión a 7) es un miembro de la familia de proteínas de unión de IGF-, y se ha demostrado que se unen al receptor de IGF1 4. Down-regulación de IGFBP7 se sabe que se correlaciona con mal pronóstico en cáncer de mama 5, mientras que la reintroducción de IGFBP7 en modelos de tumores de xenoinjertos inhibe en gran medida los tumores de crecimiento 6 a través de la inducción de la apoptosis y senescencia celular 7. Con el fin de estudiar los efectos de IGFPB7, un ratón-IGFBP7 nula fue creado 5 (datos no publicados). Mientras que estos ratones no desarrollan tumores, que muestran cambios en la histología del ovario, músculo y el hígado, así como defectos en los patrones de desarrollo de la glándula mamaria (datos no publicados). El fenotipo defectuoso fue indicado por primera vez como los ratones nulos tienen camadas más pequeñas y no son capaces de sostener múltiples camadas grandes (datos no publicados).
Volúmenes de histología en 3D tienen el potencial de proporcionar Informat útilion para los análisis cuantitativos y comparativos y la evaluación de los hallazgos patológicos en las imágenes médicas volumétricas. Confocal tridimensional, la microscopía de dos fotones puede proporcionar células de alta resolución información morfológica de la glándula en extensión local 14, pero tiene un campo de visión limitado y profundidad. Reconstrucción volumen Histología proporciona más información sobre un mucho mayor extensión espacial. El uso de los enfoques tradicionales se prevé cierta distorsión durante la preparación de los cortes histológicos, tales como contracción, expansión, las lágrimas, y los pliegues. Estas distorsiones hacen que sea difícil para registrar imágenes histológicas de serie en una pila 3D para reconstruir un volumen 3D. Como el número de secciones consecutivas con defectos aumenta las similitudes entre las secciones intactas se reduce y por lo tanto hace que el proceso de registro más complicado.
Se han propuesto diferentes métodos para registrar las secciones histológicas y para crear un VO histología continuolume. Algunas técnicas dependen de variaciones de intensidad 8, y otros se basan en la forma de las secciones 9. Para algunas muestras de las estructuras anatómicas se pueden utilizar como puntos de referencia 10,11, junto con métodos de registro basado-hito 12,13. Pero estas estructuras internas podrían no ser detectables a través de todo el volumen y para algunos especímenes no hay estructuras anatómicas confiables pueden ser identificados. Algunos grupos han utilizado un enfoque de registro de pares y registrado histología imágenes consecutivas de uno a otro utilizando contornos o estructuras anatómicas 16-18. Registro de secciones histológicas de serie el uno al otro sin el uso de imágenes de referencia puede propagar error de registro y cambiar la forma real del volumen de la histología. Enfoque de registro por pares se basa en la consistencia de la forma de las secciones de histología y las estructuras internas a lo largo de la pila de las imágenes; por lo tanto, requiere densa de muestreo de la muestra, la cualno siempre es posible, por ejemplo, para las muestras clínicas.
En este gasoducto utilizamos imágenes blockface como un conjunto de imágenes de referencia para la reconstrucción del volumen histología 19. Imágenes Blockface se toman de los bloques de parafina de tejidos después de su montaje en el microtomo y antes se corta cada sección. Por lo tanto, el daño a individuo corte secciones en serie no interfiere con el registro de las secciones de serie 8,11,15. Capturamos las imágenes blockface de una manera diferente a los otros grupos. Las imágenes de la cara del bloque óptico se obtienen mediante un objetivo telecéntrico para eliminar o minimizar el cañón y la perspectiva de la distorsión, que generalmente ocurre cuando se utilizan objetivos regulares en la óptica. Esta es una de las ventajas del enfoque propuesto sobre los otros métodos publicados, que realizan de imágenes blockface usando lentes regulares. Las imágenes son tomadas en un ángulo oblicuo de leve a utilizar la reflexión de la superficie del bloque para el aumento del contraste entre el TISSsuperficie UE y de parafina y para eliminar la sombra del tejido en profundidad, bajo la superficie de parafina. Un filtro fotográfica también se utiliza para polarizar la luz procedente de la superficie del bloque y el tejido para equilibrar el contraste 19. Para corregir para el desplazamiento del bloque en el micrótomo rotatorio, de dos a tres agujeros son perforados en las esquinas del bloque, que son fácilmente detectables en las imágenes blockface. Los centroides de estos agujeros se utilizan junto con el registro rígido basado en hito para alinear las imágenes blockface.
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Protocol
1. Espécimen
- Impuestos especiales de las glándulas mamarias quirúrgicamente de tipo salvaje CDH1 así como los ratones IGFBP7 nulo tres días publican inicio de la lactancia.
- Separe las glándulas en portaobjetos de vidrio para ayudar a recuperar la morfología de la glándula mamaria nativo.
2. La fijación y procesamiento de tejidos
- Fijar las glándulas mamarias en neutro tamponado al 4% PFA O / N a 4 ° C.
- Guarde las glándulas en etanol al 70% antes de la elaboración de tejidos.
- Transferir las glándulas para pequeños casetes de procesamiento de tejidos.
- Procesar los tejidos usando un procesador automatizado de tejido
- Deshidratar los tejidos en el aumento de etanol y xileno baños de etanol al 70% durante 45 minutos, 2 veces en etanol al 95% durante 45 min, 3 veces en etanol al 100% durante 1 hora y 2 veces en xileno durante 45 min.
- Permear los tejidos con parafina 3 veces durante 1 hora cada uno en el vacío con la presión aplicada.
- Incrustar los tejidos en parafina para formar bloques, Para seccionar.
3. Histología y Blockface Imaging
- Recorte los bloques de parafina utilizando un micrótomo rotatorio hasta que se elimina el exceso de parafina.
- Use una máquina de fresado vertical para perforar agujeros de 1 mm en al menos dos esquinas del bloque de parafina perpendicular a la casete.
- Monte el bloque de tejido en el micrótomo rotatorio.
- Establecer el sistema de formación de imágenes 19 blockface delante del microtomo.
- Captura de imagen blockface óptica antes de seccionar.
- Cortar las cintas de cuatro secciones a las 5 micras de espesor en el microtomo.
- Transfiera las cintas para el baño de agua fría.
- Separar las segunda y cuarta secciones de la cinta y montarlos en portaobjetos de microscopio. La elección de las segunda y cuarta secciones proporciona una brecha de 5 m entre las secciones.
- Amplíe cada sección en un baño de agua caliente (48 º C) para desarrugar, luego volver a montarlo en el portaobjetos de un microscopio.
NOTA: CUtting, montaje, unwrinkling las secciones causan algunas distorsiones en la sección, como desgarro, doblez, la contracción y la expansión. Estos artefactos complican el registro de las secciones histológicas. - Teñir las secciones con H & E utilizando una tinción automática.
- Cubreobjetos las diapositivas usando un cubreobjetos automático.
- Digitalizar las diapositivas usando un escáner de diapositivas histología digital en la resolución de su interés. Para este protocolo el aumento es de 20x y una resolución de 0,47 micras.
- Down-muestra las imágenes de histología a la resolución de las imágenes blockface, 18 micras.
4. Registro de Imágenes
- Segmentación de imagen y el punto de selección
- En blockface imágenes miden los valores de píxeles de los orificios de registro y utilizar el valor medio como un umbral fijo al segmento de los orificios de registro en las esquinas del bloque de parafina.
- Dado que algunas partes adicionales también pueden ser segmentados porutilizando el umbral fijo, utilizar la circularidad y el área de los objetos segmentados para encontrar los agujeros y descartar los objetos adicionales. Para hacer esto, escriba un pequeño código y encontrar la relación de (4π x área) / (perímetro) 2 para los objetos segmentados. Esta relación de objetos redondos es de 1.
- Para cada glándula mamaria, seleccionar una imagen blockface como referencia y alinear el resto de las imágenes blockface a la referencia utilizando el centro de los orificios de registro y técnicas de registro basado en la señal.
- Para las imágenes blockface alineados, segmento manualmente o extraer el tejido del fondo. Utilice el objeto más importante en la máscara para el resto del protocolo.
- Para H & E secciones siguen los siguientes pasos para la segmentación automática.
- Utilice una técnica de umbralización Otsu 20 a las imágenes del segmento de los antecedentes y crear máscaras binarias de las imágenes de histología.
- Identificar y seleccionar el objeto más importante en cada máscara utilizando la histogram de los objetos etiquetados.
- Extraiga los puntos de los límites de ancho de un píxel, tanto de la histología y máscaras blockface.
- Utilice el algoritmo de código de cadena 21, para representar los puntos de los límites de una secuencia de tramos lineales se ajusta.
- Registro rígido inicial
- Utilice Fourier Descriptores algoritmo 22, para encontrar el rígido inicial transformada entre los puntos de los límites de la histología y sus imágenes blockface correspondientes. Esta inicial incluye transformar los factores de traslación, rotación y escala.
- Transformar cada imagen histología con la inicial transformada obtenido de la etapa anterior.
- Refinamiento del registro rígido
- Retire las secciones altas borde curvatura del contorno histología utilizando un filtro de balanceo de la bola 23.
- Seleccione 500 puntos de los puntos de los límites de histología restantes utilizando aleatoriamente distribución uniforme.
- Transformar el delhistología puntos limítrofes al azar con la transformación inicial obtenida a partir de los descriptores de Fourier.
- Seleccione el conjunto de blockface puntos de los límites y el uso iterativos puntos más cercanos (ICP) del algoritmo 24 para encontrar la transformación rígida entre los puntos de los límites blockface, el destino y la histología puntos limítrofes aleatorios.
- Transformar las imágenes de histología alineados obtenidos de la etapa anterior y la pila de imágenes de histología alineados crea el volumen histología.
- Utilice un software de visualización 3D para crear una imagen visual del volumen histología.
- Visualización de la Pila de imágenes con un aumento de 5x
- Down-muestrear las imágenes histológicas originales a 5x de aumento.
- Recortar la región de interés en una de las imágenes de histología.
- Calcular la ubicación de esa región en otras imágenes de histología 5x utilizando la combinación de las transformaciones rígidas de los dos pasos de registro.
- Recortar la regiComplementos de interés a la misma región de tamaño en todas las demás imágenes de histología.
- Finalmente refinar el alineamiento entre las regiones de forma manual. Escriba un programa que se superpone dos imágenes y permite la selección de los valores de rotación y traslación de una de las imágenes más de la otra y luego guarda la imagen transformada cuando se acepta la alineación.
- Ver las pilas de las regiones de histología 5x alineados utilizando un software de visualización 3D.
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Representative Results
Una trampa de técnicas de microscopía tradicionales es que la comprensión de un órgano a nivel microscópico se limita a un campo de visión a la vez. Incluso diapositivas "en total conformidad", que ofrecen secciones enteras de diapositivas, no proporcionan información tridimensional. Con el desarrollo de la diapositiva entera, tecnologías de análisis dinámicos, nuestra capacidad de ver una sección en su totalidad se ha incrementado, sin embargo la extrapolación de las estructuras requiere volumen histología reconstrucción 3D.
Para caracterizar mejor la deficiencia del ratón IGFBP7 nulo, reconstrucción 3D de las glándulas mamarias se realizaron en las glándulas extirpadas 3 días después del comienzo de la lactancia. Figura 1 muestra la tubería del enfoque propuesto para la reconstrucción 3D de histología. Las imágenes se blockface primero alineados utilizando los orificios de las esquinas del bloque de parafina. Figuras 2A-B muestran el volumen blockface de los de tipo salvaje y IGFBP7 nulo mammglándulas ary respectivamente. Las imágenes de histología son entonces registrados a sus correspondientes imágenes blockface alineados para reconstruir los volúmenes de histología. Figuras 3A-B muestran los volúmenes de histología reconstruidas de la de tipo salvaje y las glándulas mamarias IGFBP7-nulos. Al observar las estructuras generales (vídeos A y B) se puede ver la diferencia de tamaño entre las glándulas mutantes y de tipo salvaje. Sin embargo, usando el enfoque descrito en el presente documento, se hace evidente que esta diferencia de tamaño es de longitud y anchura, pero curiosamente no profundidad. Para las glándulas utilizados en este experimento piloto, la glándula de tipo salvaje era 1,06 mm de profundidad, mientras que la glándula-IGFBP7 nula fue 1,02 mm de profundidad. El otro fenotipo inmediatamente perceptible es la diferencia en los componentes del estroma de las dos glándulas, como marcado por tinción eosina (áreas de color rosa). Las glándulas de tipo natural tienen poco tejido estromal, mientras que los nulos glándulas parecen ser predominantemente tejido estromal. Esta diferencia es especialmente evidente cuando se ven vídeos C y D. Elvídeos contienen sólo las células nucleadas (tinción con hematoxilina), a partir de estos videos podemos ver que la glándula nula mantiene su densidad, mientras que la glándula de tipo salvaje parece contener estructuras principalmente glandulares. La separación entre las secciones en vídeos A a D se ha aumentado a dos veces la separación original para presentarlo en la visualización. Para investigar más a esto, las imágenes se alinearon cerca de los ganglios linfáticos en una resolución más alta, esto nos permite ver cómo las glándulas están cambiando en las secciones de serie. En la glándula de tipo salvaje que podemos ver las grandes estructuras, que han sido llenados con leche (vídeos E y F). A diferencia de la glándula-IGFBP7 nulo tiene pocas estructuras bien desarrolladas. Por otra parte, estas estructuras estaban llenas de células similares a fibroblastos.
Como un defecto importante con el ratón-IGFBP7 nula es la capacidad de mantener grandes camadas, es evidente a través de la comparación presentada que la diferencia estructural entre el tipo salvaje y las glándulas nulos podría contribuirpara el fenotipo observado 25. El volumen alveolar es muy reducido dentro de los nulos glándulas que indican el volumen de leche insuficiente para alimentar grandes camadas. Se determinó que el volumen total de la glándula de tipo salvaje fue 82,8879 mm 3, mientras que la glándula nula mide sólo 19.6291 mm 3.
Figura 1. Esquemático que representa los pasos implicados en el proceso de reconstrucción 3D. Cuarto glándulas mamarias de ratón inguinales se utilizaron como los ejemplos. Las glándulas mamarias se recogieron de los ratones normales y nulos, a continuación, procesa y embebidos en parafina. Orificios de registro fueron perforados en los bloques de parafina, seguido de cara del bloque de imágenes y seccionamiento de serie de las glándulas. Las secciones fueron recuperados en las cintas de cuatro secciones. En la primera sección se enfrentó bloque fotografiado antes de seccionar (outl púrpuraine), mientras que la 2 ª y 4 ª secciones (esquema rojo) fueron elegidos para la tinción y escaneado H & E. Imágenes de la cara del bloque estaban alineados (con orificios de registro) y segmentados manualmente. En H & E se digitalizaron a 20x resolución luego muestreado-down; estas imágenes fueron segmentados automáticamente. Ambos conjuntos de imágenes segmentadas fueron sometidas a selección y registro de punto límite. Los resultados son los volúmenes histológicos en 3D, así como zonas de alta resolución. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Volumen Blockface. Imágenes ópticas del bloque de parafina montado en el microtomo se obtienen antes de que se corte cada sección. El centroide de los agujeros perforados en laesquinas del bloque de parafina se utiliza para alinear las imágenes blockface y crear el volumen blockface. Imagen (A) muestra la glándula mamaria de tipo salvaje a los 3 días después de la inducción de la lactancia y (B) muestra el mismo punto de tiempo para que la glándula mamaria-IGFBP7 nulo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Volumen Histología. Las imágenes de histología registrados a sus correspondientes imágenes blockface alineadas para reconstruir el volumen de la histología. (A) de la glándula de tipo salvaje y (B) de la glándula mamaria-IGFBP7 nulo, 3 días después de la inducción de la lactancia. Por favor,haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, hemos desarrollado un flujo de trabajo de registro de imágenes para reconstruir un volumen histología en 3D a partir de imágenes de histología en 2D de serie, que no requieren puntos de referencia internos seleccionados al azar o marcadores fiduciales implantados dentro del tejido, que puedan distorsionar el tejido. Mediante el método descrito, imágenes blockface ópticos mismos se utilizan como imágenes de referencia antes de seccionar. Utilizamos orificios externos perforados en el bloque de parafina para ayudar en la alineación de las imágenes blockface y para corregir el movimiento transversal 2D del bloque de parafina en frente de la cámara. Las imágenes de histología 2D están alineados con las correspondientes imágenes blockface 2D para evitar la propagación del error de registro y reconstruir un volumen histología precisa, incluso cuando las secciones de serie defectuosos resultan de bloques. Con el fin de hacer que el flujo de trabajo independiente del tipo de tejido y la mancha histología utilizado, los puntos de contorno se utilizan para llevar a cabo el registro. Esta base de puntod enfoque tiene la ventaja (sobre enfoques basados en la intensidad) que es menos computacionalmente exigente y por lo tanto más capaces de lidiar con grandes imágenes digitales de la patología.
Otra ventaja de usar imágenes blockface para alinear las imágenes de histología es que la separación entre las imágenes de histología no afecta a la calidad de su alineación para crear el volumen histología. Esto es importante en el contexto clínico en el que el espaciado entre secciones puede variar ampliamente, a menudo tan grande como la mitad de un centímetro.
A lo largo de este trabajo hemos demostrado que el método es reproducible por dos glándulas mamarias diferentes, con diferentes estructuras y variaciones de intensidad. Dado que el enfoque utiliza el límite de las secciones, el grado de variación entre diferentes glándulas es pequeña. Anteriormente también hemos mostrado la capacidad del enfoque de otro modelo preclínico 19. Como los diferentes tipos de tejidos tienen diferentes p biomecánicoroperties, se espera que el error de registro para cambiar para diferentes muestras. Pensamos que el gasoducto es aplicable a especímenes bastante sólidos, por ejemplo, los xenoinjertos de tumores humanos. En el futuro vamos a seguir investigando la veracidad de la tubería de la reconstrucción 3D mediante otros ejemplares, como el tejido de mama humano.
Uno de los otros factores limitantes del flujo de trabajo propuesta es la segmentación manual de las imágenes blockface. Esta limitación puede ser eliminado mediante el desarrollo de un enfoque automático de la textura de segmentación, por ejemplo mediante el uso de Campo Aleatorio de Markov (MRF) modelos 26,27 segmentar la muestra de la experiencia en imágenes blockface.
A través del examen de los de tipo salvaje y las glándulas mamarias IGFBP7 nulos, hemos sido capaces de identificar las diferencias en la estructura y composición de las glándulas en 3D a través de un compuesto integral de las secciones individuales de ambas glándulas. Esta técnica asistida con mayor carácterterizing el fenotipo-IGFBP7 nula a nivel celular, y mostró que las diferencias distintas en volumen alveolar pueden contribuir a algunos de los defectos observados en este modelo 25.
La capacidad importante de este enfoque es que es independiente del tipo de tejido y variaciones de intensidad y por lo tanto se puede utilizar para reconstruir el volumen de la histología de diferentes muestras de pre-clínicos y clínicos. Una de las otras ventajas de este enfoque es que no es dependiente de un colorante específico. Este enfoque basado contorno es compatible con cualquier mancha, por lo que siempre que proporcione un contorno claro de toda la sección o un contorno claro de una estructura, que es detectable en la histología e imágenes blockface. La investigación de la forma del tumor, el volumen, y la heterogeneidad es una de las aplicaciones clínicas de la histología volumen 3D. En este trabajo hemos demostrado que el método propuesto es capaz de reconstrucción del volumen histología 3D y puede estar más lejos de nosotrosed para la comparación, la visualización y el análisis de otras muestras.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% PFA | VWR International | 15710 | 16% Paraformaldehyde solution |
| Small tissue processing cassettes | VWR International | CA95029-956 | |
| Leica ASP300 automated tissue processor | Leica | 14047643515 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | S25307B | |
| Xylene | VWR International | CA95057-822 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 39501006 | Paraplast tissue embedding medium |
| Leica EG 1160 embedding center | Leica | ||
| Leica rotary microtome | Leica | ||
| Milling machine | Argo | ||
| Microscope slides | VWR International | CA48312-015 | |
| H&E stain | VWR International | ||
| Automatic stainer | |||
| Coverslips | VWR International | 48404-452 | |
| MEDITE RCM 7000 glass coverslipper | MEDITE | ||
| Leica SCN400 slide scanner | Leica | ||
| MATLAB | MathWorks Inc | MATLAB 2007b | Development software |
| MeVisLab | MeVis Medical Solutions AG | MeVisLab 2.1 | 3D visualization software |
References
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