Abstract
组织学容积重建有利于三维造型和器官在由细胞组成的宏观水平体积变化的研究。它也可以用于研究和验证在容积医学成像和治疗的新技术和算法。创建不同器官1,2,3的3D高解析度地图集是组织学容积重建的另一种应用。这提供了用于研究组织结构和各种细胞特征之间的空间关系的资源。我们提出了组织学容积重建，它使用一组光学blockface图像的图像配准方法。重构的组织学量表示已处理标本无殉后处理配准误差的可靠的形状。苏木精和曙红（H＆E）染色的两种小鼠乳腺切片使用从海关提取边界点登记到相应的blockface图片在组织学和blockface图像试样的GES。登记的准确性目视评价。乳腺的宏观结构的取向也被肉眼评价在高的分辨率。
本研究界定的不同步骤这个图像配准的管道，从乳腺切除术，通过对三维组织学容积重建。虽然2D组织学图像显示对部分之间的结构差异，组织学三维体积提供了可视化的形状和乳腺的体积差异的能力。
Introduction
IGFBP7（胰岛素样生长因子结合蛋白7）是胰岛素样生长因子结合蛋白家族的一个成员，并且已经显示出结合的IGF-1受体4。下调的IGFBP7已知与不良预后乳腺癌5相关联，而IGFBP7在异种移植肿瘤模型中重新引入大大抑制生长6的肿瘤通过诱导细胞凋亡和细胞衰老7。为了研究IGFPB7的影响，一个IGFBP7空小鼠建立5（未发表资料）。虽然这些小鼠不发展的肿瘤，它们显示在卵巢，肌肉和肝脏的组织学变化，以及在乳腺发育模式（未发表数据）的缺陷。有缺陷的表型是首次显示为空的小鼠具有较小的窝产仔数和都无法维持多个大型窝（未发表资料）。
三维组织学卷有潜力提供有用了信息离子进行定量和比较分析病理结果在体积医学图像和评估。三维共聚焦，双光子显微镜可以在本地范围14提供的腺体高分辨率细胞形态的信息，但它具有的视图和深度的有限字段。组织学容积重建提供了更大的空间范围的更多信息。使用传统方法的组织切片，如收缩，膨胀，眼泪和褶皱的制备过程中的一些失真是始料不及的。这些扭曲使得很难寄存器串行组织学图像转换成3D堆叠来重构一个三维体积。作为连续部分与缺陷的数量增加了完整的部分之间的相似性被降低，从而使登记过程更加复杂。
不同的方法已经被提出来注册的组织切片，并建立一个连续的组织学沃lume明。一些技术依赖强度变化8，和其他人是根据第9的形状。对于一些样本的解剖结构，可作为地标10,11沿着与基于地标的登记方法12,13。但这些内部结构可能不会在整个体积和一些标本没有可靠的解剖结构可以识别被检测出。有些团体已经使用成对的注册方法，并连续登记的组织学图像一个到另一个使用轮廓或解剖结构16-18。注册序列组织切片彼此不使用参考图像可以传播准误差和改变组织学量的实际形状。成对登记方法依赖于对组织学切片和内部结构在整个图像的堆叠的形状的一致性;因此，它需要密集采样的标本，其可能并不总是可能的， 例如，对临床标本。
在这条管线，我们使用blockface图像作为一组用于组织学容积重建19参考图像。 Blockface图像被安装在切片机后采取的石蜡组织块，并且每个部分被切断之前。因而，损害个体的连续切片切不干扰的连续切片8,11,15登记。我们捕捉blockface图像与其他群体不同的方式。光学块面部图像是由一个远心透镜光学以消除或尽量减少桶和透视失真，这通常是使用在光学透镜经常发生时获得的。这是在其他公布的方式，使用常规镜头的执行blockface成像所提出的方法的优势之一。的图像被拍摄时的轻微倾斜的角度要使用该块的表面的反射的做卷烟之间的对比度增强UE和石蜡表面并消除深度的组织的阴影中，石蜡的表面之下。一种照相过滤器还用于偏振来自块表面与组织平衡对比度19的光。为了校正在旋转切片机块的位移，二至三孔加工成块的角上，这是很容易检测的blockface图像。这些孔的形心连同基于地标的刚性配准用于对齐blockface图像。
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Protocol
1。标本
- 切除乳腺手术从野生型CDH1以及IGFBP7缺失小鼠3天发病后泌乳。
- 传播腺体到玻片上，以帮助恢复本地乳腺形态。
2，固定和组织处理
- 修正了在中性缓冲4％PFA O / N的乳腺在4℃。
- 存储腺体在70％乙醇前，组织处理。
- 转让腺体小组织处理磁带。
- 使用自动组织脱水处理的组织
- 脱水组织中增加70％乙醇的乙醇和二甲苯浴45分钟，2次95％乙醇45分钟，3次，在100％乙醇中1小时，2倍于二甲苯中45分钟。
- 渗透到组织中与施加压力的真空石蜡3次，每次1小时。
- 嵌入在石蜡中的组织以形成块为切片。
3，组织学和Blockface成像
- 用旋转切片机，直到多余的石蜡除去修剪的石蜡块。
- 使用立式铣床钻1毫米孔的石蜡块中的至少两个角垂直于盒中。
- 安装在所述旋转切片机将组织块。
- 设置在切片前的blockface成像系统19。
- 切片前拍摄的光blockface形象。
- 切四节丝带在在切片机5微米的厚度。
- 传输带的凉水澡。
- 分隔功能区的第二和第四部分，并挂载它们在显微镜玻片上。选择第二和第四部分提供部分之间有5微米的间隙。
- 展开每个部分在一个温水浴（48℃）来流露它，然后重新将其安装在显微镜幻灯片。
注：Cutting，安装，unwrinkling的章节会导致一些扭曲的部分，如撕裂，褶皱，收缩和扩张。这些文物复杂的组织切片进行登记。 - 使用自动染色机染色用H＆E的章节。
- 使用自动盖片盖玻片的幻灯片。
- 使用数字病理幻灯片扫描仪在感兴趣的分辨率数字化幻灯片。对于这个协议的放大倍数是20倍，分辨率为0.47微米。
- 下采样组织学图像blockface图像，18微米的分辨率。
4，图像配准
- 图像分割和点的选择
- 在blockface图像测量的定位孔的像素值，并使用平均值作为固定阈值来分割在石蜡块的角上的定位孔。
- 由于一些额外的部分可能也被分割使用固定阈值，则使用圆形和分段对象找到孔和丢弃多余的物体的面积。要做到这一点，写一个小代码，并找到（4πX面积）/（周长）2的分割对象的比例。该比率为圆形物体是1。
- 对于每个乳腺中，选择一个blockface图像作为参考，并通过使用定位孔和基于地标的配准技术的中心对齐blockface图像到参考的其余部分。
- 用于对准blockface图象手动段或从背景中提取组织。用最庞大的物体在遮罩协议的其余部分。
- 对于H＆E部分按照下面的步骤进行自动分割。
- 利用大津阈值技术20分割图像从背景中并创建组织学图像的二值掩码。
- 识别和使用h每个掩码中选择最可观的对象istogram标记的对象。
- 提取这两种组织学和blockface掩盖了一个像素宽的边界点。
- 利用链码算法21，通过分段线性序列来表示边界点拟合。
- 最初的刚性配准
- 使用傅立叶描述算法22，找到组织学的边界点及其相应的blockface图像之间的初始刚性变换。这最初的变换包括平移，旋转和缩放因子。
- 变换的各组织学图像与初始变换来自之前的步骤获得的。
- 刚性注册的细化
- 使用一个滚动的球过滤器23的组织学轮廓去除高曲率边缘部分。
- 选择使用随机均匀分布，其余组织学边界点500点。
- 变换的组织学随机边界点与傅立叶描述所获得的初始转化。
- 选择整套blockface边界点，并使用迭代最近点（ICP）算法24找到blockface边界点，目的地和组织学随机边界点之间的刚体变换。
- 变换来自前面步骤中获得的组织学对准的图像和对齐的组织学图像的堆叠产生的组织学量。
- 使用三维可视化软件创建的组织学卷的视觉形象。
- 在5倍的放大倍率观看图像的堆栈
- 下试样原始组织学图像放大5倍。
- 裁剪所述感兴趣区域中的组织学图像中的一个。
- 计算该区域的位置，在使用来自两个步骤登记的刚性变换的组合其他5倍的组织学图像。
- 裁剪的regi感兴趣的所有其他组织学图像大小相同区域的元件。
- 最后细化手动区域之间的对准。编写一个程序，覆盖两幅图像，并允许选择的旋转和在另一个图像中的一个翻译的值，然后保存，当对准被接受的变换后的图像。
- 查看对准5X组织学区的堆栈使用三维可视化软件。
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Representative Results
传统的显微镜技术的缺陷是一个器官在微观层面的理解是在一个时间限制在一个现场的视图。即使是“完全披露”的幻灯片，它提供了整个滑动部分，不能提供三维信息。随着整个幻灯片，动态扫描技术，我们看到它的一个整体部分的能力有所提高，发展却推断结构需要组织学3D容积重建。
为了更好地表征IGFBP7空鼠标的不足，对腺体切除泌乳期后3天开始进行了三维重建乳腺增生病。 图1显示了该方法的三维组织学重构的管道。该blockface图像使用在石蜡块的角上的孔第一对准。 图2A-B示出了野生型和IGFBP7空MAMM的blockface体积分别进制腺体。组织学图像，然后登记到其相应的对齐blockface图像来重构组织学卷。 图3A-B示出了野生型和IGFBP7空乳腺重构的组织学卷。通过查看整体结构（视频A和B），我们可以看到突变体和野生型腺之间的大小差异。然而，使用本文所述的方法中，很明显，这个尺寸差异是在长度和宽度，但有趣的是没有深度。在这个试验实验中使用的腺体，野生型腺为1.06毫米深，而IGFBP7空腺为1.02毫米深。其他表现型立刻引人注目的是在这两个腺体间质成分的差异，作为标记伊红染色（粉红色区域）。野生型腺很少基质组织，而空腺似乎是主要基质组织。观看视频C和D时，这种差异尤为明显视频仅包含核细胞（用苏木素染色），从这些视频可以看出，空腺维持其密度，而野生型腺似乎包含主要腺体结构。视频中A至D的部分之间的间距已增加至原来的两倍间距，以协助与可视化。为了进一步调查这个，图像，接近更高分辨率的淋巴结对齐，这让我们看到了怎样的腺体改变连续切片。在野生型腺，我们可以看到大的结构，这会已经充满牛奶（视频E和F）。与此相反的IGFBP7空腺有几个发达的结构。此外，这些结构都挤满了成纤维细胞样细胞。
由于与IGFBP7空鼠标的一个主要缺陷是维持大窝的能力，这是显而易见的，通过介绍，野生型和空腺体之间的结构差异可能有助于比较所观察到的表型25。肺泡体积大大的空腺指示不足量的牛奶喂养大窝内减少。我们确定野生型腺的总体积为82.8879毫米3而仅19.6291毫米3测得的空腺。
图1示意图示出涉及在三维重建过程中的步骤。第四腹股沟小鼠乳腺中被用作例子。乳腺增生病是正常和缺失小鼠收获，然后进行处理和石蜡包埋。注册洞钻入石蜡块，后面再跟块面成像和腺体的连续切片。切片检索四节丝带。第一部分是块切片面对（紫色OUTL前成像INE），而2 及第 4 个部分（红色轮廓）被选为H＆E染色和扫描。块的人脸图像进行比对（使用注册洞）和手动分割。 H＆E切片进行数字化在20倍的分辨率，然后向下采样;这些图像被自动分割。两组分段图象经受边界点的选择和注册。输出是3D的组织学卷以及高解析度的地区。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图2。Blockface体积。安装在切片机的石蜡块的光学图像获得的各部分被切断之前。在所钻的孔的重心的石蜡块的角被用于对齐blockface图像并创建blockface体积。图像（A）显示了野生型乳腺的后3天诱导泌乳及（B）显示了相同的时间点为IGFBP7空的乳腺。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3。组织学卷。登记到其相应的对齐blockface图像重建组织学卷的组织学图像。（A）野生型腺和（B）IGFBP7空乳腺，后3天泌乳感应。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
在这项研究中，我们开发了一种图像配准工作流程，从串行2D组织学图像，它不要求在组织内的内部随机选择的地标或植入的基准标记，这可能会扭曲组织重建三维组织学量。通过所描述的方法，光学blockface图像本身被用作前切片的参考图像。我们用钻在石蜡块外部孔，以帮助对齐blockface图像和纠正在镜头前的石蜡块的2D横向运动。二维组织学图像是相一致的相应的二维图像blockface防止配准误差的传播与重建精确的组织学量，即使当缺陷的连续切片从块产生。为了使独立的组织的类型和所使用的组织学染色的工作流程中，边界点被用来进行登记。这点基ð方式的优点（在强度为基础的方法），它是少计算要求，因此能够更好地应付非常大的数字病理图像。
使用blockface图像对齐的组织学图像的另一个优点在于，组织学图像之间的间距不影响其取向来创建组织学体积的质量。这是重要的临床设置，其中的部分之间的间距可以广泛地变化，通常一样大，半厘米。
在整个本文中，我们已经表明，该方法是可重复的两个不同的乳腺具有不同结构和强度的变化。由于该方法使用了部分的边界，不同腺之间的变化程度较小。以前我们也显示了另一个临床前模型19的方法的能力。因为不同的组织类型具有不同的生物力学properties，预计配准误差改变为不同的试样。我们认为，该管道适用于相当雄厚的标本， 如人类肿瘤异种移植。在未来，我们将进一步调查使用其他的标本，如人体乳腺组织的三维重建管道的准确性。
一个建议的工作流的另一限制因素是blockface图像的手工分割。这种限制可以通过使用马尔可夫随机场（MRF）模型26,27分割从blockface图像背景中的样品开发一个自动纹理分割方法，例如被删除。
通过对野生型和IGFBP7空乳腺的检查，我们可以通过这两个腺体的各个部分进行了全面综合，以确定在3D腺体的结构和成分的差异。该技术援助在进一步字符terizing的IGFBP7空表型在细胞水平上，并表明在肺泡体积有明显的差异可能导致一些看到在这个模型25的缺陷。
这种方法的重要功能是，它是独立于组织类型和强度的变化，因此它可以被用来重建不同的临床前和临床标本的组织学量。一个这种方法的另一优点是，它不依赖于特定的污垢。这种基于轮廓的方法是与任何兼容的污渍，只要它提供了全段或结构，这是在检测到这两个组织学和blockface图像的清晰轮廓的清晰轮廓。肿瘤的形状，体积和异质性的调查的三维组织学量的临床应用之一。在本文中，我们已经表明，该方法能够重建三维组织学量，并可以进一步我们编作比较，可视化和其他标本分析。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% PFA | VWR International | 15710 | 16% Paraformaldehyde solution |
| Small tissue processing cassettes | VWR International | CA95029-956 | |
| Leica ASP300 automated tissue processor | Leica | 14047643515 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | S25307B | |
| Xylene | VWR International | CA95057-822 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 39501006 | Paraplast tissue embedding medium |
| Leica EG 1160 embedding center | Leica | ||
| Leica rotary microtome | Leica | ||
| Milling machine | Argo | ||
| Microscope slides | VWR International | CA48312-015 | |
| H&E stain | VWR International | ||
| Automatic stainer | |||
| Coverslips | VWR International | 48404-452 | |
| MEDITE RCM 7000 glass coverslipper | MEDITE | ||
| Leica SCN400 slide scanner | Leica | ||
| MATLAB | MathWorks Inc | MATLAB 2007b | Development software |
| MeVisLab | MeVis Medical Solutions AG | MeVisLab 2.1 | 3D visualization software |
References
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