Abstract
Ricostruzione del volume Istologia facilita lo studio della forma 3D e variazione di volume di un organo a livello di macrostrutture costituiti di cellule. Può anche essere usato per studiare e validare nuove tecniche e algoritmi di imaging medico volumetrico e terapie. Creazione di atlanti 3D ad alta risoluzione di diversi organi 1,2,3 è un'altra applicazione di ricostruzione del volume istologia. Ciò fornisce una risorsa per indagare strutture tissutali e la relazione spaziale tra le varie funzioni cellulari. Vi presentiamo un metodo di registrazione di immagini per la ricostruzione del volume istologia, che utilizza una serie di immagini blockface ottiche. Il volume istologia ricostruito rappresenta una forma affidabile del campione trasformati senza propagate errore di registrazione post-processing. I ematossilina eosina (H & E) sezioni colorate di due ghiandole mammarie topo sono stati registrati per le loro immagini blockface corrispondenti utilizzando punti di confine estratti dal ndrges del campione nelle immagini di istologia e blockface. La precisione della registrazione è stata valutata visivamente. L'allineamento delle macrostrutture delle ghiandole mammarie stata anche valutata visivamente ad alta risoluzione.
Questo studio delinea le diverse fasi di questa immagine registrazione conduttura, che vanno dalla escissione della ghiandola mammaria fino alla ricostruzione 3D del volume istologia. Mentre le immagini di istologia 2D rivelano le differenze strutturali tra coppie di sezioni, il volume istologia 3D offre la possibilità di visualizzare le differenze di forma e di volume delle ghiandole mammarie.
Introduction
IGFBP7 (insulina come la proteina legante il fattore di crescita 7) è un membro della famiglia delle proteine IGF-binding, e ha dimostrato di legarsi al recettore IGF1 4. Down-regolazione di IGFBP7 è noto essere correlata con la prognosi nel cancro al seno 5, mentre la reintroduzione del IGFBP7 in modelli di tumore dello xenotrapianto inibisce notevolmente la crescita dei tumori 6 attraverso l'induzione di apoptosi e senescenza cellulare 7. Al fine di studiare gli effetti di IGFPB7, un mouse IGFBP7-null è stato creato 5 (dati non pubblicati). Mentre questi topi non sviluppano tumori, mostrano cambiamenti nella istologia delle ovaie, muscoli e nel fegato, nonché difetti di sviluppo della ghiandola mammaria patterning (dati non pubblicati). Il fenotipo difettoso è stato indicato come i topi nulli hanno dimensioni dei cuccioli più piccoli e sono in grado di sostenere più cucciolate di grandi dimensioni (dati non pubblicati).
Volumi di istologia 3D hanno il potenziale di fornire informat utiliion per le analisi quantitative e comparative e la valutazione di risultati patologici in immagini mediche volumetriche. Confocale tridimensionale, microscopia a due fotoni può fornire cellule di alta risoluzione informazioni morfologica della ghiandola alla misura locale 14, ma ha un limitato campo di vista e profondità. Ricostruzione del volume Istologia fornisce ulteriori informazioni su una maggiore estensione spaziale. Utilizzando approcci tradizionali certa distorsione è anticipata durante la preparazione di sezioni istologiche, come il restringimento, espansione, lacrime e pieghe. Queste distorsioni rendono difficile registrare immagini istologiche seriali in una pila 3D per ricostruire un volume 3D. Poiché il numero di sezioni consecutive con difetti aumenta le somiglianze tra sezioni intatte ridotta e conseguentemente rende il processo di registrazione più complicato.
Diversi metodi sono stati proposti per registrare sezioni istologiche e per creare un istologia vo continualume. Alcune tecniche dipendono da variazioni di intensità 8, e altri sono basati sulla forma delle sezioni 9. Per alcuni esemplari le strutture anatomiche possono essere utilizzate come punti di riferimento 10,11 insieme basato limite-metodi di registrazione 12,13. Ma queste strutture interne potrebbero non essere rilevabile durante l'intero volume e per alcuni esemplari presenti strutture anatomiche affidabili possono essere identificati. Alcuni gruppi hanno utilizzato un approccio di registrazione pair-wise e registrato le immagini istologia consecutive una all'altra utilizzando profili o strutture anatomiche 16-18. Registrazione sezioni istologiche seriali l'un l'altro senza l'uso di immagini di riferimento può propagare errore di registrazione e cambiare la forma reale del volume istologia. Approccio registrazione Pair-saggio si basa sulla coerenza della forma delle sezioni istologici e le strutture interne per tutta la pila di immagini; quindi richiede denso campionamento del campione, chepotrebbe non sempre è possibile, ad esempio, per i campioni clinici.
In questo gasdotto usiamo immagini blockface come un insieme di immagini di riferimento per il volume istologia ricostruzione 19. Blockface immagini sono prese dei blocchi di tessuto paraffina dopo il montaggio sul microtomo e prima di ogni sezione viene tagliata. Così, danni a individuo sezioni seriali taglio non interferisca con la registrazione di sezioni seriali 8,11,15. Catturiamo le immagini blockface in modo diverso dagli altri gruppi. Le immagini dei volti blocco ottico vengono raggiunti con un telecentrico per eliminare o minimizzare la canna e prospettiva distorsione, che di solito si verifica quando si utilizzano lenti regolari in ottica. Questo è uno dei vantaggi del metodo proposto rispetto agli altri metodi pubblicati, che eseguono l'imaging blockface utilizzando lenti regolare. Le immagini sono riprese con una leggera angolazione obliqua di utilizzare la riflessione della superficie del blocco per migliorare il contrasto tra il TISSsuperficie ue e paraffina e di eliminare l'ombra del tessuto in profondità sotto la superficie paraffina. Un filtro fotografico è anche usato per polarizzare la luce proveniente dalla superficie del blocco e il tessuto per bilanciare il contrasto 19. Per correggere lo spostamento del blocco sul microtomo rotativo da due a tre fori sono realizzati negli angoli del blocco, che sono facilmente rilevabili nelle immagini blockface. I centroidi di questi fori sono usati insieme con la registrazione rigida a base di riferimento-per allineare le immagini blockface.
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Protocol
1. Specimen
- Accise le ghiandole mammarie chirurgicamente da wild-type CDH1 nonché IGFBP7-null mice tre giorni dopo l'instaurarsi della lattazione.
- Stendere le ghiandole su vetrini per contribuire a recuperare nativo della ghiandola mammaria morfologia.
2. Fissazione e Tissue Processing
- Fissare le ghiandole mammarie in folle tamponata 4% PFA O / N a 4 ° C.
- Conservare le ghiandole in etanolo al 70% prima del trattamento del tessuto.
- Trasferire le ghiandole a piccole cassette di trasformazione del tessuto.
- Elaborare i tessuti utilizzando un processore tessuto automatizzato
- Disidratare tessuti ascendente etanolo e xilene bagni di etanolo al 70% per 45 minuti, 2 volte in etanolo al 95% per 45 minuti, 3 volte in 100% di etanolo per 1 ora e 2 volte in xilene per 45 min.
- Permeare i tessuti con paraffina 3 volte per 1 ora ogni sotto vuoto con pressione applicata.
- Incorporare i tessuti in paraffina per formare blocchi, Per il sezionamento.
3. Istologia ed Blockface Imaging
- Tagliare i blocchi di paraffina utilizzando un microtomo rotativo fino a quando la paraffina in eccesso viene rimosso.
- Utilizzare una fresatrice verticale per perforare fori di 1 mm in almeno due angoli del blocco di paraffina perpendicolare alla cassetta.
- Montare il blocco tessuto sul microtomo rotativo.
- Impostare il sistema di imaging blockface 19 davanti al microtomo.
- Immagine blockface ottica catturare prima del sezionamento.
- Tagliare i nastri di quattro sezioni a 5 micron di spessore sul microtomo.
- Trasferire i nastri al bagno di acqua fredda.
- Separare la seconda e la quarta sezione del nastro e montarli su vetrini da microscopio. Scegliendo la seconda e la quarta sezione fornisce un divario tra 5 micron sezioni.
- Espandere ciascuna sezione in un bagno di acqua calda (48 ° C) per unwrinkle esso, poi ri-montarlo sul vetrino da microscopio.
NOTA: CUtting, montaggio, unwrinkling sezioni causare alcune distorsioni della sezione, come la lacrima, piega, restringimento e l'espansione. Questi manufatti complicano la registrazione delle sezioni istologici. - Macchiare le sezioni con H & E con un Stainer automatico.
- I vetrini coprioggetto utilizzando un montavetrini automatico.
- Digitalizzare le diapositive utilizzando uno scanner diapositiva istologia digitale alla risoluzione di interesse. Per questo protocollo è l'ingrandimento 20x e la risoluzione è 0.47 micron.
- Down-campionare le immagini istologici per la risoluzione delle immagini blockface, 18 micron.
4. Immagine registrazione
- Immagine Segmentazione e punto di selezione
- In blockface immagini misurano i valori di pixel dei fori di registrazione e usa il valore medio come una soglia fissa per segmentare i fori di registrazione negli angoli del blocco di paraffina.
- Da alcune parti aggiuntive potrebbero anche essere segmentati dacon il limite fissato, utilizzare la circolarità e l'area degli oggetti segmentati per trovare i buchi ed eliminare gli oggetti extra. Per fare questo, scrivere un piccolo codice e trovare il rapporto di (4π x area) / (perimetro) 2 per gli oggetti segmentati. Questo rapporto per oggetti rotondi è 1.
- Per ogni ghiandola mammaria, selezionare un'immagine blockface come riferimento e allineare il resto delle immagini blockface al riferimento utilizzando il centro dei fori di registrazione e tecniche di registrazione basato limite.
- Per le immagini blockface allineate, segmento manualmente o estrarre il tessuto dallo sfondo. Utilizzare l'oggetto più consistente nella maschera per il resto del protocollo.
- Per H & E sezioni seguire le istruzioni riportate di seguito per la segmentazione automatica.
- Utilizzare Otsu soglia tecnica 20 alle immagini segmento dallo sfondo e creare maschere binari delle immagini istologici.
- Individuare e selezionare l'oggetto più consistente in ogni maschera usando l'histogram degli oggetti etichettati.
- Estrarre i un pixel di larghezza punti di confine sia da istologia e maschere blockface.
- Utilizzare algoritmo codice catena 21, per rappresentare i punti di confine da una sequenza di lineare a tratti adatta.
- Registrazione rigida iniziale
- Utilizzare Fourier descrittori algoritmo 22, per trovare la rigida iniziale trasformazione tra i punti di confine di istologia e le loro immagini blockface corrispondenti. Questo iniziale di trasformare comprende i fattori di conversione, rotazione e scala.
- Trasformare ogni immagine istologia con l'iniziale di trasformazione ottenuto dal passaggio precedente.
- Affinamento della registrazione rigido
- Rimuovere le sezioni ad alta curvatura del bordo dal profilo istologico usando un filtro palla che rotola 23.
- Selezionare 500 punti dei restanti istologici punti di confine in modo casuale con distribuzione uniforme.
- Trasformare il laistologia punti di confine casuali con la trasformazione iniziale ottenuto da descrittori di Fourier.
- Selezionare l'intero insieme di blockface punti di confine e utilizzare iterativi più vicini Points (ICP) 24 algoritmo per trovare la trasformazione rigida tra i punti blockface di confine, di destinazione e di istologia punti di confine casuali.
- Trasforma le immagini istologici allineate ottenuti dalla fase precedente e la pila di immagini di istologia allineate crea il volume istologia.
- Utilizzare un software di visualizzazione 3D per creare una immagine visiva del volume istologia.
- Visualizzazione della Pila di immagini a ingrandimento 5x
- Down-assaggiare le immagini istologici originali a 5x ingrandimento.
- Ritagliare la regione di interesse in una delle immagini istologici.
- Calcolare la posizione di tale regione in altre immagini istologici 5x utilizzando la combinazione delle trasformazioni rigide delle due fasi di registrazione.
- Ritagliare la regions di interesse per la stessa regione dimensioni in tutte le altre immagini di istologia.
- Infine definire l'allineamento tra le regioni manualmente. Scrivere un programma che sovrappone due immagini e permette di selezionare i valori di rotazione e traslazione di una delle immagini sopra l'altra e quindi salva l'immagine trasformata quando l'allineamento è accettata.
- Guarda le pile delle regioni istologici 5x allineati utilizzando un software di visualizzazione 3D.
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Representative Results
Un inconveniente di tradizionali tecniche di microscopia è che la comprensione di un organo a livello microscopico è limitata ad un campo di vista alla volta. Anche "totale informative" slides, che forniscono intere sezioni di scorrimento, non riescono a fornire informazioni tridimensionali. Con lo sviluppo di tutta la diapositiva, tecnologie di scansione dinamica, la nostra capacità di vedere una sezione nella sua interezza è aumentata, tuttavia estrapolando richiede strutture 3D ricostruzione del volume istologia.
Per meglio caratterizzare il deficit del mouse IGFBP7-null, 3D-ricostruzione delle ghiandole mammarie sono stati eseguiti sulle ghiandole asportati tre giorni dopo l'inizio della lattazione. Figura 1 mostra la pipeline dell'approccio proposto per la ricostruzione istologia 3D. Le immagini blockface sono state preliminarmente allineate con i fori negli angoli del blocco di paraffina. Figure 2A-B mostra il volume blockface del wild-type e IGFBP7-null mammghiandole ary rispettivamente. Le immagini istologici vengono quindi registrati ai loro corrispondenti immagini blockface allineate per ricostruire i volumi istologici. Figure 3A-B mostrano i volumi ricostruiti istologici della wild-type e le ghiandole mammarie IGFBP7 nulli. Osservando le strutture generali (video A e B) possiamo vedere la differenza di dimensioni tra tipo mutante e selvaggia ghiandole. Tuttavia, utilizzando il metodo qui descritto, risulta evidente che questa differenza di dimensioni è in lunghezza e larghezza ma non interessante profondità. Per le ghiandole utilizzati in questo esperimento pilota, la ghiandola wild-type era 1,06 millimetri di profondità, mentre la ghiandola IGFBP7-null era 1,02 millimetri di profondità. L'altro fenotipo immediatamente evidente è la differenza di componenti stromali delle due ghiandole, come indicato dalla eosina (aree rosa). Le ghiandole wild-type hanno poco tessuto stromale, mentre i nulli ghiandole sembrano essere prevalentemente tessuto stromale. Questa differenza è particolarmente evidente quando si guardano i video C e D.video contengono solo cellule nucleate (colorazione con ematossilina), da questi video possiamo vedere che la ghiandola nulla mantiene la sua densità, mentre la ghiandola wild-type sembra contenere strutture prevalentemente ghiandolari. La spaziatura tra le sezioni video A a D è stata aumentata a due volte la spaziatura originale per agevolare la visualizzazione. Per indagare ulteriormente questo, le immagini sono state allineate vicino al linfonodo in alta risoluzione, questo ci permette di vedere come le ghiandole stanno cambiando in sezioni seriali. Nella ghiandola wild-type possiamo vedere grandi strutture, che sarebbero state riempite con il latte (video E e F). In contrasto con la ghiandola IGFBP7-null ha poche strutture ben sviluppate. Inoltre, queste strutture erano affollate di cellule di fibroblasti-like.
Come un difetto importante con il mouse IGFBP7 nullo è la capacità di sostenere grandi cucciolate, è evidente attraverso il confronto presentato che la differenza strutturale tra wild-type e ghiandole nulli potrebbe contribuireal fenotipo osservato 25. Il volume alveolare è notevolmente ridotto entro i nulli ghiandole che indicano il volume del latte insufficiente per l'alimentazione di grandi dimensioni cucciolate. Abbiamo determinato che il volume totale della ghiandola wild-type era 82,8879 millimetri 3 mentre la ghiandola nullo misurata solo 19,6291 millimetri 3.
Figura 1. Schema raffigurante le fasi coinvolte nel processo di ricostruzione 3D. Quarto inguinali ghiandole mammarie di topo sono stati utilizzati come esempi. Ghiandole mammarie sono state raccolte da topi normali e nulli, poi processato e incluso in paraffina. Fori di registrazione sono stati perforati in blocchi di paraffina seguiti dal blocco faccia imaging e sezionamento seriale delle ghiandole. Le sezioni sono state recuperate in nastri di quattro sezioni. La prima sezione è stata block-affrontato ripreso prima del sezionamento (outl violaine), mentre il 2 e 4 sezioni ° (contorno rosso) sono stati scelti per la colorazione H & E e la scansione. Blocca immagini dei volti sono state allineate (con fori di registrazione), e segmentato manualmente. H & E sezioni sono state digitalizzate con risoluzione 20x poi giù nel campione; queste immagini sono state segmentate automaticamente. Entrambe le serie di immagini segmentate sono stati sottoposti a selezione del punto di confine e di registrazione. Le uscite sono volumi istologici 3D così come le zone ad alta risoluzione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Volume Blockface. Immagini ottiche del blocco di paraffina montato sul microtomo sono ottenuti prima di ogni sezione viene tagliato. Il baricentro dei fori delangoli del blocco di paraffina viene utilizzato per allineare le immagini blockface e creare il volume blockface. Immagine (A) mostra la wild-type ghiandola mammaria a 3 giorni dopo l'induzione della lattazione e (B) mostra lo stesso tempo punti per la ghiandola mammaria IGFBP7-null. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Volume di Istologia. Le immagini di istologia registrati ai loro corrispondenti immagini blockface allineate per ricostruire il volume istologia. (A) wild-type ghiandola e (B) ghiandola mammaria IGFBP7-null, 3 giorni dopo l'induzione allattamento. pregoclicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, abbiamo sviluppato una registrazione workflow un'immagine di ricostruire un volume istologia 3D da immagini seriali istologia 2D, che non richiede punti di riferimento interni scelti a caso o marcatori fiduciali impiantati all'interno del tessuto, che potrebbero distorcere il tessuto. Con il metodo descritto, immagini blockface ottici stessi vengono utilizzati come immagini di riferimento prima del sezionamento. Usiamo fori esterni praticati nel blocco di paraffina per aiutare ad allineare le immagini blockface e per correggere il movimento trasversale 2D del blocchetto di fronte alla telecamera. Le immagini istologia 2D sono allineate alle corrispondenti immagini 2D blockface per impedire la propagazione dell'errore registrazione e ricostruire un volume istologia accurata, anche quando sezioni seriali difettosi derivano da blocchi. Al fine di rendere il flusso di lavoro indipendente dal tipo di tessuto e la macchia istologia utilizzato, vengono utilizzati i punti di confine per effettuare la registrazione. Questo punto-based approccio ha il vantaggio (rispetto agli approcci basati sull'intensità), che è computazionalmente meno esigente e quindi maggiormente in grado di far fronte con immagini molto grandi patologia digitale.
Un altro vantaggio di utilizzare immagini blockface allineare le immagini istologici è che la spaziatura tra le immagini istologici non pregiudica la qualità del loro allineamento per creare il volume istologia. Questo è importante in ambito clinico in cui la spaziatura tra le sezioni può variare ampiamente, spesso grande come mezzo centimetro.
In questo documento abbiamo dimostrato che l'approccio è riproducibile per due differenti ghiandole mammarie con diverse strutture e variazioni di intensità. Poiché l'approccio utilizza il contorno delle sezioni, il grado di variazione tra diverse ghiandole è piccolo. In precedenza abbiamo anche dimostrato la capacità del metodo per un altro modello pre-clinico 19. Come diversi tipi di tessuto hanno differenti p biomeccanicoroprietà, l'errore di registrazione dovrebbe cambiare per i diversi campioni. Noi pensiamo che la pipeline è applicabile agli esemplari abbastanza solidi, ad esempio, xenotrapianti tumorali umani. In futuro studieremo ulteriormente la precisione del gasdotto ricostruzione 3D utilizzando altri campioni, come il tessuto mammario umano.
Uno degli altri fattori limitanti del flusso di lavoro proposto è la segmentazione manuale delle immagini blockface. Questa limitazione può essere rimossa sviluppando un'impostazione automatica trama segmentazione, per esempio utilizzando Markov casuale Field (MRF) modelli 26,27 per segmentare il campione dal fondo in immagini blockface.
Attraverso l'esame della wild-type e le ghiandole mammarie IGFBP7-null, siamo stati in grado di identificare le differenze nella struttura e la composizione delle ghiandole in 3D attraverso un composito globale delle singole sezioni di entrambe le ghiandole. Questa tecnica aiutato in ulteriore carattereterizing il fenotipo IGFBP7 nullo a livello cellulare, e ha dimostrato che chiare differenze di volume alveolare possono contribuire ad alcuni dei difetti osservati in questo modello 25.
La capacità importante di questo approccio è che esso è indipendente dal tipo di tessuto e variazioni di intensità e quindi può essere utilizzato per ricostruire il volume istologia di diversi campioni preclinici e clinici. Uno degli altri vantaggi di questo approccio è che non dipende da un colorante specifico. Questo approccio basato contorno è compatibile con qualsiasi macchia, purché fornisce una chiara contorno della sezione intera o una chiara contorno di una struttura, che è rilevabile sia istologia e immagini blockface. L'indagine della forma tumorale, il volume e eterogeneità è una delle applicazioni cliniche del volume di istologia 3D. In questo lavoro abbiamo dimostrato che l'approccio proposto è in grado di ricostruire il volume istologia 3D e può essere ulteriormente noiEd per il confronto, la visualizzazione e l'analisi di altri campioni.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% PFA | VWR International | 15710 | 16% Paraformaldehyde solution |
| Small tissue processing cassettes | VWR International | CA95029-956 | |
| Leica ASP300 automated tissue processor | Leica | 14047643515 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | S25307B | |
| Xylene | VWR International | CA95057-822 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 39501006 | Paraplast tissue embedding medium |
| Leica EG 1160 embedding center | Leica | ||
| Leica rotary microtome | Leica | ||
| Milling machine | Argo | ||
| Microscope slides | VWR International | CA48312-015 | |
| H&E stain | VWR International | ||
| Automatic stainer | |||
| Coverslips | VWR International | 48404-452 | |
| MEDITE RCM 7000 glass coverslipper | MEDITE | ||
| Leica SCN400 slide scanner | Leica | ||
| MATLAB | MathWorks Inc | MATLAB 2007b | Development software |
| MeVisLab | MeVis Medical Solutions AG | MeVisLab 2.1 | 3D visualization software |
References
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