Summary
הנוכחות של HPV בסיכון גבוה ברקמת גידול ראש והצוואר קשורה בתוצאות טובות. RNA שפותח לאחרונה בטכניקת הכלאה באתר שנקרא RNAscope מאפשר הדמיה ישירה של HPV E6/E7 mRNA בסעיפי רקמות FFPE.
Abstract
"תקן הזהב" לגילוי HPV בשעור הוא ההפגנה של HPV בסיכון גבוה תעתיק הפעיל ברקמת גידול. עם זאת, זיהוי של E6/E7 mRNA על ידי תגובה כמותית הפוכה שעתוק פולימראז שרשרת (qRT-PCR) דורש מיצוי RNA שהורס את הקשר רקמת הגידול קריטי עבור מתאם מורפולוגיים וכבר קשה להיות מאומצים בפרקטיקה קלינית שגרתית. RNA שפותח לאחרונה שלנו בטכנולוגית הכלאה באתר, RNAscope, מאפשר הדמיה ישירה של RNA ב, רקמות קבועות פורמלין פרפין, מוטבע (FFPE) עם רגישות מולקולה בודדת ורזולוציה תא בודדת, המאפשרת רגיש מאוד וספציפי בניתוח באתרו של כל סמן ביולוגי RNA בדגימות קליניות שגרתיות. Assay RNAscope HPV נועד לזהות את ה-mRNA E6/E7 של שבעה גנוטיפים HPV בסיכון גבוה (HPV16, 18, 31 ב, 33, 35, 52, ו58) באמצעות בריכה של בדיקות גנוטיפ ספציפי. זה הוכיח רגישות מעולהוספציפיות נגד השיטה הנוכחית "תקן זהב" של גילוי E6/E7 mRNA ידי qRT-PCR. מצב HPV נקבע על ידי RNAscope הוא מאוד פרוגנוסטיים של תוצאה קלינית בחולי סרטן הלוע התחתון.
Introduction
חשבונות זיהום וירוס הפפילומה אנושי בסיכון גבוהה (HR-HPV) לכ 5% מכל מקרי הסרטן בעולם 1. השכיחות של סרטן הלוע התחתון הקשורים לנגיף גדלה בעשורים האחרונים, במיוחד בקרב גברים. קרצינומה חיובית ל-HPV הלוע התחתון של תאים קשקשיים (OPSCC) צפויה להוות רוב של כל סוגי סרטן הראש והצוואר בארצות הברית בשנים הבאות 20 2. קרצינומה של תאי קשקש הלוע התחתון הנגרמת על ידי HPV קשורה להישרדות נוחה, ומעמד HPV הגידול הוא גורם מנבא חזק ועצמאי להישרדות 3.
ראיות להפעלת תעתיק של אונקוגנים נגיפיים E6 ו E7 נחשבת את תקן הזהב לנוכחות של HPV הרלוונטי קליני 4. עם זאת, זיהוי של E6/E7 mRNA מרקמת גידול טרי על ידי טכניקת RT-PCR הוא לא מעשי בפרקטיקה קלינית שגרתית והיה מוגבל למעבדות המחקר. לאחרונה, אנו havהדואר פיתח טכנולוגיה חדשה ISH RNA נקראת RNAscope, המאפשרת זיהוי זמנית בתאי אדם עם רגישות מולקולת RNA בודדת בדגימות פרפין הקבוע פורמלין מוטבעים רקמות (FFPE) 5-10. אנחנו סיפקנו שלושה קווים של ראיות לזיהוי מולקולה בודדת 5. ראשית, מערכת ההגברה ועיצוב אות הבדיקה RNAscope אפשרה זיהוי של עותק יחיד מטרות הדנ"א הגנומי HER2 בהלה וSK-BR-3 שורות תאים. שנית, בהשוואה לאותות הדנ"א הגנומי HER2, חלוקת עוצמות הניאון של נקודות אות HER2-mRNA בתאי הלה הייתה בקנה אחד עם מולקולה אחת לכל נקודה. שלישית, מספר נקודות אות HER2-mRNA לכל תא מתאים מקרוב את עותק מספר HER2-mRNA שהוערך על ידי assay כימות מבוסס פתרון, התומך בזיהוי מולקולה בודד נוסף. יתר על כן, counterstaining של גרעינים עם DAPI במיקרוסקופ פלואורסצנטי או עם hematoxylin במיקרוסקופ שדה בהיר מאפשר הדמיה של גרעינים בודדים, WHich בתורו מאפשר איתור וכימות של מטרות RNA על בסיס תא בודד 10. היכולת לנתח ביטוי גנים באתר בדגימות קליניות שגרתיות הופכת RNAscope פלטפורמה מבטיחה לפתולוגיה אבחון, במיוחד אלה מבוססי מבחני קטע רקמת FFPE 10,11. פיתחנו assay HPV מבוסס RNAscope לזהות E6/E7 mRNA של שבעה גנוטיפים בסיכון גבוה של HPV (HPV16, 18, 31 ב, 33, 35, 52, ו58) באמצעות בריכה של בדיקות גנוטיפ ספציפי. המחקרים האחרונים שלנו בOPSCC הראו כי assay RNAscope HPV הוא רגיש מאוד וספציפי בקביעת מעמד HPV על רקמות FFPE 12-17, וגם מודיע הפרוגנוזה בOPSCC 12,16.
העיקרון של טכנולוגית RNAscope כבר תואר בעבר 5. כאן אנו מתארים פרוטוקול assay RNAscope המלא ולהדגים את השימוש בו בזיהוי של HR-HPV בסעיפי רקמת גידול FFPE.
Protocol
1. לדוגמא, ציוד, ומגיבים הכנה
- חותכים דגימת רקמה לגושים של 3-4 מ"מ בעובי, לתקן ב10% פורמלין שנאגרו ניטראלי הטרי ל16-32 שעות בטמפרטורת חדר (25 ° C) ולהטביע בפרפין. חותכים FFPE למקטעים בעובי מיקרומטר 5 ± 1 מלוקי FFPE, הר סעיפים בשקופיות ואוויר יבש. הערה: ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורת חדר מתחת להתייבשות לתקופה של עד 3 חודשים. שקופיות הרקמה הרכובים צריכים להיות אפויות ביבשה מעל ב60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 לפני assay RNAscope.
- להביא הכלאה תנור ל40 ° C. מניחים נייר humidifying בבקרת לחות מגש. הוסף 50 dH מיליליטר 2 O לנייר humidifying להרטיב אותו לחלוטין. הכנס את מגש המכוסה לתנור לprewarm לפחות 30 דקות לפני השימוש.
- הפוך 700 מיליליטר 1x Pretreat 2 פתרון (10 NL, חיץ ציטרט pH 6) על ידי דילול 10x Pretreatment פתרון בDH 2 O. מחממים את פתרון 1x Pretreat 2 לרתיחה ומייntain הטמפרטורה בין C ° 100-104 תוך מניעת יתר הרתיחה.
- לעשות 3 L 1x הצפת לשטוף (SSC 0.1x) על ידי דילול prewarmed 50x הצפת לשטוף ב DH 2 O.
- להכין 2 x 200 מיליליטר של קסילן ו2 x 200 מיליליטר של EtOH 100% לdeparaffinization מתחת למכסת מנוע קטר.
- הכן 50% פתרון מכתים Hematoxylin ומגיב bluing (0.01% מים אמוניה) להודעה הכתמה מתחת למכסה המנוע קטר.
- הכן 200 מיליליטר של קסילן, 200% מיליליטר של 70, ו -2 x 200 מיליליטר של EtOH 100% להתייבשות מתחת למכסת מנוע קטר.
- בדיקות Prewarm יעד ב40 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולהביא RTU איתור מגיב ערכה לטמפרטורת חדר, כוללים RTU Amp1, Amp2, AMP3, Amp4, Amp 5, בראון, וAmp6-בראון, למעט DAB אב הצבע בראון ובראון-B .
2. RNAscope Assay
Deparaffinization והתייבשות
לאחר אפייה, deparaffinize סעיפי רקמות בקסילן במשך דקות 2 x 5 עם תסיסה מתמדת, ומייבשבEtOH 100% עבור 2 x 3 דקות עם תסיסה תכופה. אוויר יבש למשך 5 דקות ולצייר מחסום הידרופובי סביב קטע הרקמה עם הידרופובי מכשול פן.
Pretreatments
- דגירה סעיפי רקמות עם 1 Pretreat 10 דקות ב RT למרווית פעילות peroxidase אנדוגני, לשטוף ב DH 2 O.
- דגירה סעיפי רקמות עם Pretreat 2 לשמור על טמפרטורת רתיחה במשך 15 דקות לאחזור RNA, לשטוף פעמיים ב DH 2 O.
- דגירה סעיפי רקמות עם Pretreat 3 ל30 דקות ב40 ° C לעיכול חלבון בתנור HybEZ, לשטוף פעמיים ב DH 2 O.
יעד Probe הכלאה
בדיקות יעד בריכת 7 HPV-HR כוללות: HPV16, 18, 31 ב, 33, 35, 52, ו58. הוספת בדיקות HPV, יוביקוויטין C (UBC) ובדיקות dapB גן חיידקים בנפרד על שלושה סעיפי רקמות adjacently. להכליא ב40 מעלות צלזיוס בתנור במשך 2שעה, ואז לשטוף במאגר 1x לשטוף עבור 2 x 2 דקות ב RT.
אות הגברה
- דגירה סעיפי רקמות עם Amp1 (מגבר) ל30 דקות ב40 ° C, Amp2 (מפחית רקע) ל15 דקות ב 40 ° C, AMP3 (מגבר) ל30 דקות ב40 מעלות צלזיוס, וAmp4 (בדיקה תווית) ל15 דקות ב40 מעלות צלזיוס בתנור HybEZ. לאחר כל שלב הכלאה, יש לשטוף במאגר 1x לשטוף עבור 2 x 2 דקות ב RT.
- דגירה סעיפי רקמות עם Amp5 ל30 דקות וAmp6 15 דקות ב RT. לאחר כל שלב דגירה, לשטוף במאגר 1x לשטוף עבור 2 x 2 דקות ב RT.
זיהוי אות
דגירה סעיפי רקמות עם 1:01 תערובת DAB על ידי ערבוב נפח שווה של בראון, ובראון-B עבור 10 דקות ב RT, לשטוף פעמיים ב DH 2 O.
Counterstaining
השמה Slide
מייבש את חלקי רקמות ב70%, 100%, וEtOH 100% עבור 2 דקות כל אחד, קסילן במשך 5 דקות, לעלות עם תקשורת הרכבה מבוססת קסילן.
Representative Results
זרימת העבודה assay RNAscope HPV
יש assay RNAscope זרימת עבודה יעילה מאוד, כי הוא דומה לIHC (איור 1). היא מורכבת מארבעה שלבים עיקריים: pretreatments, הכלאה, amplifications אות, וזיהוי. היא מעסיקה אסטרטגיית עיצוב חללית ייחודית המבטיחה הגברה אות באיכות גבוהה 5. ב assay RNAscope HPV, שבעה סטי הבדיקה HR-HPV הם אספו, כל מוכרים על ידי אותה מערכת ההגברה האות קשורה לחזרה peroxidase (HRP). אותות הכלאה ספציפיים מזוהים כמו משקעים חומים שהוקמו על ידי HRP זרז תגובת chromogenic באמצעות DAB כמצע, אשר ניתן דמיינו בקלות על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר הסטנדרטי.
מכתים נציג לאיתור HPV
איור 2 מראה תמונות דוגמא מסעיפי FFPE מוכתמים של ראש וצוואר קרצינומה של תאי קשקש. במקרה חיובי ל-HPV (איור2A יור), בדיקות HR-HPV זוהו אותות punctate חזקים במיוחד בתאים הסרטניים. הבדיקה UBC זוהתה אותות cytoplasmic punctate רבים בשני תאים סרטניים ותאים סטרומה (איור 2). הבדיקה dapB גן החיידקים הפגינה רקע נקי (איור 2 ג). במקרה של HPV שלילי, שניהם הבדיקה HR-HPV ובדיקת dapB זוהו שום אותות (2D דמויות ו2F), ואילו אותות חזקים התגלו באמצעות הבדיקה UBC (2E איור). ב assay זה, UBC משמש בקרה חיובית כלהעריך איכות RNA רקמות וdapB כביקורת שלילית לאותות מרקע. הניקוד לקביעת מעמד HPV כרוך לבחון את כל שלוש שקופיות לכל מקרה ומקרה. רמת הצביעה בשקופית הביקורת השלילית שקופיות (dapB) משמשת כרף קבלה: חיוביות HPV מוגדרת על ידי הנוכחות של cytoplasmic punctate ו / או כתמים גרעיניים שהיו מעל לאות בשקופית dabpB.
איור 1. תרשים זרימה של assay RNAscope. איור של זרימת העבודה assay RNAscope. Assay RNAscope מכיל 4 שלבים עיקריים, pretreatments, הכלאת בדיקה היעד, הגברה אות וזיהוי אותות. הליך assay כולו יכול להסתיים ב8 שעות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. תמונות דוגמא של שקופיות צבעוניות RNAscope. (בקרה שלילית) סעיפי FFPE מוכתמים עם בדיקות לHR-HPV, UBC (בקרה חיובית) וdapBמשני מקרי HNSCC. AC. מקרה חיובי ל-HPV. , ביטוי HR-HPV E6/E7 mRNA בתאי גידול. הבלעה, הגדלה 40X להראות אותות punctate. B ו-C) סעיפי רקמות סמוכים מראים מכתים חיובי UBC (B) ושלילי לdapB (C), בהתאמה. מקרה HPV שלילי) DF. ד) לא מכתים עבור HPV E6/E7 mRNA בדומה לביקורת השלילית dapB (F). E) UBC מכתים חיובי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Discussion
Assay RNAscope HPV אפשר להדמיה ישירה של E6/E7 mRNA באתרו בראש הקשורים לנגיף וקרצינומה של תאי קשקש בצוואר. Assay RNAscope תואם באופן מלא עם רקמת גידול קבוע באופן שיגרתי ומשמר את מורפולוגיה רקמות למתאמי histopathological (איור 2). יתרון מפתח של assay RNAscope על פני שיטות קונבנציונליות CISH הוא שזה דווקא מגביר את אותות ההכלאה (2B דמויות ו2E) ללא הגברת רעשי הרקע (2C דמויות ו2F).
בפועל, הליך assay RNAscope HPV יכול להסתיים בתוך 8 שעות או בנוחות חילק במשך יומיים. Assay RNAscope HPV כבר בשימוש כדי לקבוע את מצב HPV בראש וקרצינומה של תאי קשקש צוואר 12-16, הוכחת רגישות 97% וסגוליות 93% באמצעות qRT-PCR כשיטת התייחסות 16. Chr הקונבנציונליISH omogenic לHR-HPV DNA הוא מאוד ספציפי, אבל יש לו רגישות של ~ 80% 12. מכתים immunohistochemical (IHC) לp16 הסמן הפונדקאי הסלולרי מדגים רגישות מעולה, אך עשוי להפיק תוצאות חיוביות כוזבות 15,18, במיוחד בסרטן הראש וצוואר nonoropharyngeal 15. השיטה הנוכחית "תקן זהב" של qRT-PCR לHPV E6/E7 mRNA זיהוי דורשת רקמות קפואים לתוצאות אופטימליות, והוא מורכב מבחינה טכנית, אשר מגבילה את השימוש בו למעבדת המחקר בלבד. בנוסף, הוא דורש מיצוי RNA שהופך אותו בלתי אפשרי, כדי לקשר בין ביטוי HR-HPV E6/E7 mRNA עם histopathology.
ישנם מספר גורמים קריטיים להצלחה של assay RNAscope. ראשית, לקבלת התוצאות הטובות ביותר, צריכה להיות קבועות ברקמות 10% פורמלין שנאגרו ניטראלי הטרי בטמפרטורת חדר למשך שעה 16-32 פי הנחיות ASCO / CAP 19. שנית, תנור HybEZ מומלץ מאוד שכן הוא מאפשרזה שליטה אופטימלית של טמפרטורה ולחות להכלאת בדיקה וצעדי הגברה אות. שלישית, חשוב להסיר את מאגרי שיורי עודפים לפני כל צעד, אבל עדיין לשמור על קטע הרקמה מההתייבשות במהלך כל אחד מהשלבים הבאים.
הליך RNAscope הידני שתואר כאן כבר אוטומטי לחלוטין על מערכת אוטומטית מכתים מסחרית שקופיות 10. זה אמור להקל מאוד סטנדרטיזציה של תנאי assay ועבודת כפות יקרות חיסכון במעבדות פתולוגיה קליניות. בנוסף, תוכנת ניתוח תמונה ייעודית פותחה 10 לזהות באופן אוטומטי את התאים ואותות מכתים בשקופית דיגיטלית, שאמורה לעזור לחסל את הסובייקטיביות ולשפר את שחזור בשערו.
לסיכום, assay RNAscope HPV מזהה הנוכחות של תעתיקי HR-HPV E6/E7 mRNA באתרו ברקמות FFPE. יש לו עבודה כי הוא מכיר את labora פתולוגיה הקליניטורים על ידי התרת ההדמיה ישירות אלה בסעיפי רקמות. היא מציעה פלטפורמה אידיאלית לבחינה (FFPE) דגימות רקמה, ויכולה להיות מאומצת בקלות על ידי מעבדות פתולוגיה אבחון.
Disclosures
כל המחברים הם מועסקים על ידי ושל המניה באבחון מתקדם Cell, Inc
Acknowledgments
נתמך בחלקו על ידי מענק NIH (R43/44CA122444) ומענק DOD BRCP (W81XWH-06-1-0682) לי.ל..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill's Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Cover Glass 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| Drying Oven | Capable of holding temperature at 60±1 °C | ||
| Water Bath | Capable of holding temperature at 40±1 °C |
References
- Parkin, D. M. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002. Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).
- Chaturvedi, A. K., et al. Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States. J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).
- Smeets, S. J., et al. A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen. Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Liu, X., et al. Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity. J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Payne, R. E., et al. Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients. Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).
- Bordeaux, J. M., et al. Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen. PLoS One. 7 (5), (2012).
- Wang, Z., et al. Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma. J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).
- Tubbs, R. R., et al. Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders. Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).
- Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. Jr. High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma. Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization. Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status. Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).
- Bishop, J. A., et al. Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method. Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Schache AG,, et al. Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma. Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).
- Mehrad, M., et al. Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus. Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).
- Jordan, R. C., et al. Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials. Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).
