Summary
Baş ve boyun tümör dokusunda yüksek riskli HPV varlığı olumlu sonuçlar ile ilişkilidir. RNAscope denilen in situ hibridizasyon tekniği son zamanlarda geliştirilen RNA FFPE doku kesitlerinde HPV E6/E7 mRNA doğrudan görselleştirme sağlar.
Abstract
Onkojenik HPV tespiti için 'altın standart' tümör dokusunda transkripsiyonel aktif yüksek riskli HPV gösteri. Bununla birlikte, sayısal ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile E6/E7 mRNA'nın tespiti morfolojik korelasyon için tümör dokusu bağlam kritik yok eder ve rutin klinik pratikte kabul edilmesi zor olmuştur RNA ekstraksiyonu gerektirir. In situ melezleme teknolojisi RNAscope bizim yeni geliştirilmiş bir RNA, tek bir molekül duyarlılık ve herhangi bir biyomarker RNA in situ analizi, son derece hassas ve spesifik sağlayan tek bir hücre çözünürlük, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) dokuda RNA doğrudan görselleştirme izin verir rutin klinik örneklerde. RNAscope HPV deney genotip özgü problar bir havuz kullanılarak E6/E7 yedi yüksek riskli HPV genotiplerinin mRNA'nın (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, ve 58) tespit etmek için tasarlanmıştır. Bu mükemmel hassasiyet göstermiştirve Mah-PCR ile E6/E7 mRNA tespit geçerli 'altın standart' yöntemiyle karşı seçicilik. RNAscope tarafından belirlenen HPV durumu orofaringeal kanser hastalarında klinik sonucun güçlü prognostik olduğunu.
Introduction
Dünya çapında 1 tüm kanserlerin yaklaşık% 5 için yüksek riskli insan papilloma virüsü (HR-HPV) enfeksiyonu hesaplar. HPV-ilişkili orofarengeal kanser insidansı, özellikle erkekler arasında, son yıllarda artmıştır. HPV-pozitif orofaringeal skuamöz hücreli karsinom (OPSCC) muhtemelen önümüzdeki 20 yılda 2 Amerika Birleşik Devletleri'nde tüm baş ve boyun kanserlerinin çoğunluğu teşkil edecektir. HPV neden Orofarengeal skuamöz hücreli karsinom olumlu sağkalım ile ilişkili, ve tümör HPV durum hayatta kalma 3 için güçlü ve bağımsız bir prognostik faktör olduğunu vardır.
Viral onkojenler E6 ve E7 transkripsiyonel aktivasyonu için kanıt klinik olarak ilgili HPV 4 varlığı için altın standardı olarak düşünülmektedir. Bununla birlikte, RT-PCR tekniği ile taze tümör dokusundan E6/E7 mRNA'nın tespiti rutin klinik uygulamada pratik değildir ve araştırma laboratuarlarında ile sınırlı olmuştur. Son zamanlarda, biz havE formalin fikse parafine gömülü doku örneklerinden (FFPE) 5-10 tek RNA molekülü duyarlılık ile bireysel hücrelerin multipleks algılamayı sağlayan RNAscope adında yeni bir RNA ISH teknolojisini geliştirdi. Biz tek bir molekül tespiti 5 delil üç satır sağladı. İlk olarak, RNAscope prob tasarımı ve sinyal yükseltme sistemi HeLa ve SK-BR-3 hücre hatlarında tek kopya HER2 genomik DNA hedeflerinin tespiti izin verdi. HER2 genomik DNA sinyalleri ile karşılaştırıldığında İkincisi, HeLa hücrelerinde mRNA HER2 sinyal noktaların floresan yoğunluklarının dağıtım nokta başına bir molekülü ile tutarlıdır. Üçüncü olarak, hücre başına HER2 mRNA sinyali noktaların sayısı daha tek bir molekülün tespitini destekleyen, yakından bir çözüm-tabanlı ölçüm testiyle tahmin HER2 mRNA kopya sayısını eşleşti. Ayrıca, floresan mikroskopi veya aydınlık alan mikroskobu hematoksilen ile DAPI ile çekirdeklerin counterstaining WH, bireysel çekirdeklerin görselleştirme sağlarich da bir tek hücre bazında 10 tespiti ve RNA hedeflerin ölçümü sağlar. Rutin klinik örneklerinde in situ gen ifadesini analiz yeteneği, özellikle de FFPE doku bölümünde dayalı tahliller 10,11, RNAscope tanısal patoloji için umut verici bir platform yapar. Bu genotip özgü sondaların bir havuzu kullanılarak yedi yüksek riskli HPV genotipi (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, ve 58) bir E6/E7 mRNA'yı tespit etmek için bir RNAscope tabanlı bir HPV analiz geliştirdik. OPSCC Bizim son çalışmalar RNAscope HPV tahlil FFPE dokularda 12-17 HPV statüsünün belirlenmesinde son derece duyarlı ve özgül olduğunu ve aynı zamanda OPSCC 12,16 prognozu bilgilendirir göstermiştir.
RNAscope teknolojinin ilkesi, daha önce 5 tarif edilmiştir. Burada, tam RNAscope deney protokolü tarif ve FFPE tümör doku kesitlerinde in HR-HPV saptanmasında kullanımını göstermektedir.
Protocol
1.. Örnek, Ekipman ve Reaktif Hazırlama
- Oda sıcaklığında (25 ° C) 'de 16-32 saat boyunca taze,% 10 nötr tamponlu formalin içinde çözmek ve parafin içine gömmek, 3-4 mm kalınlığında bloklar halinde doku numune kesin. FFPE bloklardan 5 ± 1 mikron kalınlığında bölüme FFPE kesilmiş, slaytlar ve kuru hava ile ilgili bölümleri monte. Not: Slaytlar kadar 3 ay boyunca kurutulması altında oda sıcaklığında saklanabilir. Monte edilmiş doku slaytlar önce RNAscope tahlile 1 saat boyunca 60 ° C 'de fazla bir kuru pişmiş olmalıdır.
- 40 ° C hibridizasyon Fırın getirmek Nem Kontrol Tepsi bir nemlendirme Kağıt yerleştirin. Tamamen ıslak Nemlendirme Kağıt 50 ml dH 2 O ekleyin. Kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca prewarm için Fırın içine kapalı Kaset yerleştirin.
- Kazanmak 700 ml 1x önceden işleyin dH 2 O. 10x Tedavi öncesi Çözüm sulandırarak 2 Çözüm (10 nl, pH 6 sitrat tamponu) 1x önceden işleyin 2 kaynamaya Çözüm ve mai ısıtınaşırı kaynama engellerken, 100-104 ° C arasındaki sıcaklık ntain.
- DH 2 O'da prewarmed 50x Wash Buffer seyreltilmesi ile 3 L 1x Yıkama Tamponu (0.1x SSC) Yap
- Bir davlumbaz altında Parafinden arındırmadan boyunca 2 x 200 ml iksilen ve% 100 EtOH 'ın 2 x 200 ml hazırlayın.
- Davlumbaz altında post-boyama için% 50 Hematoksilen boyama çözüm ve bluing reaktifi (0.01% amonyaklı su) hazırlayın.
- Bir davlumbaz altında dehidrasyon için ksilen ve 200 ml, 200 ml% 70 ve 2 x 200 ml% 100 EtOH hazırlayın.
- 10 dakika boyunca 40 ° C'de ve DAB Kromojen Brown ve-A-B Brown dışında, RTU Amp1, Amp2, AMP3, Amp4, Amp 5-Brown ve Amp6-Brown da dahil olmak üzere, oda sıcaklığına kadar RTU Algılama Kit reaktif getirmek ön ısıtılması Hedef probları .
2. RNAscope Deneyi
Parafinden arındırma lamların ve Dehidrasyon
Pişirmeden sonra, sık çalkalama ile 2 x 5 dakika boyunca ksilen içinde doku bölümleri deparaffinize ve kurutmaksık çalkalama ile 2 x 3 dakika boyunca% 100 EtOH içinde. Hava 5 dakika boyunca, kuru ve hidrofobik bir bariyer kalem ile doku bölümü etrafında bir hidrofobik bariyer çizin.
Önmuameleler
- Ön muamele 1 ile doku bölümleri inkübe endojen peroksidaz aktivitesi söndürülmesi, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile, dH 2 O. durulama
- DH 2 O. iki kere yıkayın, RNA alma için 15 dakika süre ile, kaynama sıcaklığında muhafaza edilen bir ön işlem 2 ile doku bölümleri inkübe
- DH 2 O. iki kere yıkayın, HybEZ fırında protein sindirimi için 40 ° C'de 30 dakika boyunca ön-işleme tabi 3 ile doku bölümleri inkübe
Hedef Probe Hibridizasyon
Hedef prob HPV-HR 7 pool şunlardır: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, ve 58,. Ayrı olarak, üç bitişik doku bölümleri üzerine HPV sondalar, Ubiquitin C (UBC) ve bakteriyel gen probları dapB ekleyin. 2 için fırın içinde 40 ° C'de hibridizasyonhr, daha sonra oda sıcaklığında 2 x 2 dk için 1x Yıkama tampon maddesi içinde yıkayın.
Sinyal Amplifikasyon
- 40 ° C'de 30 dakika boyunca 40 ° C, AMP3 (amplifikatör) ile 15 dakika boyunca 40 ° C, Amp2 (arka plan azaltıcı), 30 dakika boyunca Amp1 (amplifikatör) ile doku bölümleri inkübe ve Amp4 (etiket prob), 15 dakika boyunca HybEZ bir fırında 40 ° C'de. Her bir hibridizasyon aşamasından sonra, oda sıcaklığında 2 x 2 dk için 1x Yıkama tampon maddesi içinde yıkayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, 30 dakika ve Amp6 için Amp5 doku bölümleri ile inkübe edin. Her inkubasyon aşamasından sonra, oda sıcaklığında 2 x 2 dk için 1x Yıkama tampon maddesi içinde yıkayın.
Sinyal Algılama
Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca Brown ve-A-B Brown eşit hacim karıştırılarak 01:01 DAB karışımı ile inkübe doku bölümleri, dH 2 O. içinde iki kez yıkayın
Counterstaining
Slayt Montaj
2 dakika her biri için,% 70,% 100 ve% 100 EtOH içinde doku bölümleri dihidrat, ksilen, 5 dakika için, ksilen bazlı montaj ortamı ile monte edilir.
Representative Results
RNAscope HPV tahlil akışı
RNAscope deneyi (Şekil 1) IHC benzer bir yüksek iş akışı vardır. Önmuameleler, melezleme, sinyal büyütmesi, ve algılama: Bu dört ana adımdan oluşur. Bu yüksek sadakat sinyal büyütmeye 5 sağlayan benzersiz bir prob tasarım stratejisini kullanır. RNAscope HPV tahlilde, yedi HR-HPV prob setleri her yaban turbu peroksidazı (HRP) bağlanmış olan aynı sinyal amplifikasyon sistemi tarafından tanınan, bir araya getirilmiştir. HRP ile oluşturulan kahverengi çökeltiler, hali hazırda standart parlak alan mikroskopi ile görüntülenmiştir olabilir alt-tabaka olarak DAB kullanılarak kromojenik reaksiyon katalize gibi özel hibridizasyon sinyalleri tespit edilir.
HPV saptanması için Örnek lekeleme
Şekil 2 baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom lekeli FFPE kesimlerinden örnek görüntüleri gösterir. HPV-pozitif halinde (Şekil l'deure 2A), HR-HPV problar, spesifik olarak tümör hücrelerinin güçlü noktalı sinyalleri tespit edildi. UBC prob tümör hücreleri ve stromal hücreleri (Şekil 2B) hem de çok noktalı sitoplazmik sinyal tespit edildi. Bakteriyel gen probu dapB temiz bir arka plan (Şekil 2C) gösterdi. Güçlü sinyaller UBC probu (Şekil 2E) kullanılarak tespit edilmiştir, oysa HPV-negatif durumda, HR-HPV prob ve dapB prob, hem herhangi bir sinyal (Şekil 2 ve 2F) tespit edildi. Bu deneyde, UBC arka plan sinyalleri için negatif kontrol olarak RNA, doku ve kalite dapB değerlendirmek için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir. HPV statüsünün belirlenmesi için puanlama, her durum için her üç slayt incelenmesini gerektirir. Negatif kontrol slayt (dapB) slayt üzerinde boyama düzeyi kesim olarak kullanılır: HPV pozitif noktalı sitoplazmik ve / veya dabpB slaytta sinyal üzerinde olan nükleer boyama varlığı ile tanımlanır.
Şekil 1. RNAscope tahlil iş akışı RNAscope testinin Akış Şeması. İllüstrasyon. RNAscope tahlil 4 büyük adım, ön terbiye, hedef prob hibridizasyon, sinyal amplifikasyon ve sinyal algılama içerir. Tüm tahlil işlemi 8 saat içinde tamamlanabilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. RNAscope lekeli slaytlar Örnek görüntüler. HR-HPV, UBC (pozitif kontrol) ve dapB için sondalar ile boyandı FFPE bölümler (negatif kontrol)İki HNSCC olgulardan. ac. HPV-pozitif vaka. Tümör hücrelerinde A, HR-HPV E6/E7 mRNA ifadesi. Ankastre, noktasal sinyalleri göstermek için 40X büyütme. B ve C). DF) HPV-negatif durumda. D) sırasıyla, HPV E6/E7 mRNA için hiçbir boyama pozitif UBC boyanma (B) ve dapB (C için negatif) gösteren komşu doku kesitleri , dapB negatif kontrol (F) benzer. E) UBC pozitif boyanma. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Discussion
RNAscope HPV tahlil HPV-ilişkili baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom in situ E6/E7 mRNA doğrudan görselleştirme izin verdi. RNAscope tahlil rutin sabit tümör dokusu ile tamamen uyumludur ve histopatolojik korelasyon için doku morfolojisi (Şekil 2) korur. Geleneksel yöntemlere göre CISH RNAscope deneyinin önemli bir avantajı, özel olarak arka plan gürültüsünü (Şekiller 2C ve 2F) amplifiye olmayan hibridizasyon sinyalleri (Şekil 2B ve 2E) kuvvetlendirir olmasıdır.
Uygulamada, RNAscope HPV deney prosedürü 8 saat içinde tamamlanabilir ya da uygun bir iki gün boyunca bölünmüş. RNAscope HPV tahlil referans yöntem olarak 16 Mah-PCR kullanarak% 97 duyarlılık ve% 93 özgüllük göstererek, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom 12-16 HPV durumunu belirlemek için kullanılır olmuştur. Konvansiyonel chrHR-HPV DNA omogenic ISH yüksek düzeyde spesifik olduğunu fakat% 80 ~ 12 bir hassasiyete sahiptir. Hücresel vekil işaretleyici p16 immünhistokimyasal (İHK) boyama mükemmel hassasiyet gösterir ama özellikle nonoropharyngeal baş ve boyun kanserlerinde 15 yanlış pozitif sonuçlar 15,18 oluşturabilir. HPV E6/E7 mRNA tespiti için Mah-PCR mevcut "altın standart" yöntem, yalnızca araştırma laboratuvarında kendi kullanımını sınırlar, en iyi sonuçlar için taze dondurulmuş doku gerektirir ve teknik olarak karmaşık. Buna ek olarak, bu imkansız histopatoloji ile HR-HPV E6/E7 mRNA ifadesini ilişkili kolaylaştırır RNA ekstraksiyonu gerektirir.
RNAscope tahlil başarısı için çok önemli bir faktör vardır. İlk olarak, en iyi sonuçlar için, dokular ASCO / CAP kılavuzlar 19 göre 16-32 saat boyunca oda sıcaklığında, taze,% 10 nötr tamponlu formalin içine sabitlenmiş olmalıdır. O etkinleştirmek beri İkincisi, HybEZ fırın tavsiye edilirprob hibridizasyon ve sinyal amplifikasyon adımlar için sıcaklık ve nem kontrol optimal s. Üçüncü olarak, her adımda daha önce fazla kalıntı tamponlar çıkaracaklardır, fakat yine de bu adımların sırasında herhangi bir kurutma bölümü doku tutmak önemlidir.
Burada anlatılan manuel RNAscope prosedür tamamen ticari bir slayt oto boyama sisteminde 10 otomatik olmuştur. Bu büyük ölçüde deney koşulları ve klinik patoloji laboratuvarlarında tasarrufu değerli el emeği standardizasyon kolaylaştırmak gerekir. Buna ek olarak, özel bir görüntü analiz yazılımı otomatik olarak öznelliği ortadan kaldırmak ve puanlama üretilebilirliğe geliştirmek için yardımcı olmalıdır dijitalize slayt üzerinde hücreleri ve boyama sinyalleri belirlemek için 10 geliştirilmiştir.
Özet olarak, RNAscope HPV deney FFPE dokularda in situ HR-HPV E6/E7 mRNA varlığını algılar. Klinik patoloji laborant tanıdık bir iş akışı vardoku bölümlerinde bu doğrudan görselleştirme izin vererek Tories. Bu (FFPE) doku örneklerini inceleyerek için ideal bir platform sunuyor ve kolayca teşhis patoloji laboratuarları tarafından kabul edilebilir.
Disclosures
Tüm yazarlar İleri Hücre Tanı, Inc stoklar tarafından ve kendi istihdam edilmektedir
Acknowledgments
YL NIH hibe (R43/44CA122444) ve DOD BRCP hibe (W81XWH-06-1-0682) tarafından kısmen destekleniyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill's Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Cover Glass 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| Drying Oven | Capable of holding temperature at 60±1 °C | ||
| Water Bath | Capable of holding temperature at 40±1 °C |
References
- Parkin, D. M. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002. Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).
- Chaturvedi, A. K., et al. Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States. J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).
- Smeets, S. J., et al. A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen. Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Liu, X., et al. Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity. J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Payne, R. E., et al. Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients. Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).
- Bordeaux, J. M., et al. Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen. PLoS One. 7 (5), (2012).
- Wang, Z., et al. Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma. J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).
- Tubbs, R. R., et al. Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders. Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).
- Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. Jr. High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma. Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization. Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).
- Lewis, J. S. Jr., et al. Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status. Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).
- Bishop, J. A., et al. Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method. Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Schache AG,, et al. Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma. Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).
- Mehrad, M., et al. Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus. Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).
- Jordan, R. C., et al. Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials. Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).
