Summary
A presença de HPV de alto risco no tecido do tumor de cabeça e pescoço está associada a resultados favoráveis. O RNA recentemente desenvolvido na técnica de hibridização in situ chamado RNAscope permite a visualização direta de HPV E6/E7 mRNA em cortes de tecido FFPE.
Abstract
O "padrão ouro" para detecção de HPV oncogênico é a demonstração de HPV de alto risco transcricionalmente ativo no tecido tumoral. No entanto, a detecção de E6/E7 mRNA por transcrição Polymerase Chain Reaction reversa quantitativa (qRT-PCR) requer a extração de RNA que destrói o tecido tumoral contexto crítico para a correlação morfológica e tem sido difícil de ser adotada na prática clínica rotineira. Nosso RNA recentemente desenvolvido em tecnologia de hibridização in situ, RNAscope, permite a visualização direta de RNA em, (FFPE) tecido embebido em parafina fixado em formalina com sensibilidade única molécula e resolução de uma única célula, o que permite altamente sensível e específico na análise in situ de qualquer biomarcador RNA em amostras clínicas de rotina. O ensaio RNAscope HPV foi concebido para detectar o ARNm de E6/E7 de genótipos de HPV de alto risco (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58), utilizando um conjunto de sondas específicas de genótipo. Ela demonstrou excelente sensibilidadee especificidade em relação ao método atual "padrão ouro" de detectar E6/E7 mRNA por qRT-PCR. Estado HPV determinado pela RNAscope é fortemente prognóstico do resultado clínico em pacientes com câncer de orofaringe.
Introduction
Contas de infecção pelo papilomavírus humano de alto risco (HR-HPV) para cerca de 5% de todos os cânceres em todo o mundo 1. A incidência de câncer de orofaringe associadas ao HPV tem aumentado nas últimas décadas, especialmente entre os homens. Carcinoma HPV-positivos orofaríngeo de células escamosas (OPSCC) provavelmente constituem a maioria de todos os cânceres de cabeça e pescoço, nos Estados Unidos nos próximos 20 anos 2. Carcinomas de células escamosas da orofaringe causados pelo HPV estão associados com a sobrevivência favorável e status HPV tumor é um fator prognóstico forte e independente para a sobrevivência 3.
Evidência para a ativação da transcrição dos oncogenes virais E6 e E7 é considerada o padrão ouro para a presença de HPV clinicamente relevante 4. No entanto, a detecção de ARNm de E6/E7 de tecido de tumor fresco pela técnica de RT-PCR não é prático na prática clínica de rotina e tem sido limitada aos laboratórios de investigação. Recentemente, nós have desenvolveu uma tecnologia de RNA ISH romance chamado RNAscope, que permite a detecção multiplex em células individuais com uma única molécula de RNA sensibilidade em formalina parafina fixo amostras de tecido incorporados (FFPE) 5-10. Nós fornecemos três linhas de evidência para uma única molécula de detecção 5. Primeiro, o design e sistema de amplificação de sinal de sonda RNAscope permitiu a detecção de uma única cópia HER2 alvos de DNA genômico em HeLa e SK-BR-3 linhas celulares. Em segundo lugar, quando comparado com os sinais de ADN genómico de HER2, a distribuição das intensidades de fluorescência do sinal HER2 mRNA pontos em células HeLa era consistente com uma molécula por ponto. Em terceiro lugar, o número de sinais de HER2 de mRNA por célula pontos combinados intimamente o número de cópias de mRNA HER2 estimado por um ensaio de quantificação baseado em solução, apoiando ainda mais a detecção de uma única molécula. Além disso, a coloração de contraste de núcleos com DAPI em microscopia fluorescente ou com hematoxilina em microscopia de campo claro permite a visualização de núcleos individuais, which por sua vez, permite a detecção e quantificação de alvos de ARN sobre uma base de uma única célula 10. A capacidade de analisar a expressão do gene in situ em amostras clínicas de rotina faz RNAscope uma plataforma promissora para o diagnóstico da patologia, especialmente os ensaios baseados em secção de tecido FFPE 10,11. Nós desenvolvemos um ensaio de HPV baseada em RNAscope para detectar ARNm de E6/E7 de genótipos de HPV de alto risco (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58), utilizando um conjunto de sondas específicas de genótipo. Nossos estudos recentes em OPSCC têm mostrado que o ensaio RNAscope HPV é altamente sensível e específico para determinar o status do HPV em tecidos FFPE 12-17, e também informa o prognóstico em OPSCC 12,16.
O princípio da tecnologia RNAscope foi anteriormente descrito 5. Aqui, nós descrevemos o protocolo de ensaio RNAscope completa e demonstrar a sua utilização na detecção de HR-HPV em secções de tecidos tumorais FFPE.
Protocol
1. Sample, Equipamento e Preparação do reagente
- Corte amostra de tecido em blocos de 3-4 mm de espessura, fixar em fresco formalina a 10% neutra tamponada por 16-32 horas à temperatura ambiente (25 º C) e inserir em parafina. Corte FFPE em seções de 5 ± 1 mM espessura dos blocos FFPE, montar seções em slides e ar seco. Nota: Os slides podem ser armazenados à temperatura ambiente sob dessecação por até 3 meses. As lâminas de tecido montadas deve ser cozido numa seco durante a 60 ° C durante 1 hora antes do ensaio RNAscope.
- Traga Hibridização forno a 40 ° C. Coloque um papel umidificação no Tabuleiro do controle de umidade. Adicionar 50 ml de dH 2 O para o Livro umidificação de molhá-lo completamente. Insira a bandeja coberta para o forno para pré-aquecimento por pelo menos 30 minutos antes de usar.
- Adicione 700 ml de 1x Solução Pretreat 2 (10 nl, pH 6, tampão de citrato) por diluição 10x Solução de pré-tratamento em dH2O Aqueça o 1x Pretreat 2 Solução para ferver e maintain a temperatura entre 100-104 ° C enquanto prevenindo sobre-ebulição.
- Faça 3 L 1x Wash Buffer (0,1 x SSC), diluindo pré-aquecido 50x Wash Buffer em dH 2 O.
- Preparar 2 x 200 ml de xileno e 2 x 200 ml de EtOH a 100% para desparafinização sob um exaustor.
- Preparar a solução de coloração Hematoxilina 50% e reagente bluing (0,01% de amônia da água) para o pós-coloração sob uma coifa.
- Preparar 200 ml de xileno, a 200 ml de 70%, e 2 x 200 ml de EtOH a 100% para a desidratação sob um exaustor.
- Pré-aquecer as sondas alvo a 40 ° C por 10 min e trazer Detecção RTU reagente Kit à temperatura ambiente, incluindo RTU AMP1, Amp2, AMP3, AMP4, Amp 5-Brown, e Amp6-Brown, exceto DAB Chromogen Brown-A e Brown-B .
2. RNAscope Assay
Desparafinização e desidratação
Após o cozimento, Retire a parafina cortes de tecido em xileno para 2 x 5 minutos com agitação freqüente, e desidratarem EtOH a 100% durante 2 x 3 min, com agitação frequente. Secar ao ar durante 5 minutos e extrair uma barreira hidrofóbica em torno da secção de tecido com uma barreira hidrofóbica Pen.
Pré-tratamentos
- Incubar as secções de tecido com Pretreat 1 durante 10 minutos a RT para extinção da actividade de peroxidase endógena, enxaguar em dH2O
- Incubar as secções de tecido com Pretreat 2 mantidos à temperatura de ebulição durante 15 minutos para a recuperação de ARN, lavar duas vezes em dH2O
- Incubar as secções de tecido com Pretreat 3 durante 30 min a 40 ° C durante a digestão da proteína no forno HybEZ, lavar duas vezes em dH2O
Alvo sonda de hibridação
Sondas alvo HPV-HR 7 piscina incluem: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58. Adicionar sondas de HPV, ubiquitina C (UBC) e bacterianas sondas dapB gene separadamente em três seções do tecido adjacente. A hibridização a 40 ° C no forno durante 2hr, depois enxaguar em tampão 1x Wash por 2 x 2 min à temperatura ambiente.
A amplificação de sinal
- Incubar as secções de tecido com AMP1 (pré-amplificador) durante 30 min a 40 ° C, Amp2 (fundo redutor) durante 15 min a 40 ° C, AMP3 (amplificador) durante 30 min a 40 ° C, e AMP4 (sonda de marcação) durante 15 min a 40 ° C no forno HybEZ. Depois de cada passo de hibridação, lavagem em tampão 1x de lavagem para 2 x 2 min à temperatura ambiente.
- Incubar as secções de tecido com AMP5 durante 30 min e Amp6 durante 15 min a RT. Depois de cada passo de incubação, lavagem em tampão 1x de lavagem para 2 x 2 min à temperatura ambiente.
Detecção de Sinal
Incubar as secções de tecido com DAB 01:01 Mistura misturando igual volume de castanho e castanho-A-B por 10 min à temperatura ambiente, lavar duas vezes em dH2O
Contracoloração
Deslize de montagem
Desidratar as secções de tecido em 70%, 100%, e 100% de EtOH, durante 2 min cada, xileno, durante 5 minutos, montagem com meios de montagem baseada em xileno.
Representative Results
Fluxo de trabalho de ensaio RNAscope HPV
O ensaio RNAscope tem um fluxo de trabalho altamente simplificada, que é semelhante à de IHC (Figura 1). Ele consiste em quatro etapas principais: pré-tratamentos, hibridação, amplificações de sinal e de detecção. Ele emprega uma estratégia de design da sonda única que garante sinal de alta fidelidade amplificação 5. No ensaio RNAscope HPV, os sete conjuntos de sonda HR-HPV são reunidas, todos reconhecidos pelo mesmo sistema de amplificação de sinal ligado a peroxidase de rábano (HRP). Sinais de hibridação específicos são detectados como precipitados castanhos formados por reacção catalisada por HRP cromogénico utilizando DAB como substrato, o qual pode ser facilmente visualizadas por microscopia de campo brilhante standard.
Coloração Representante para detecção do HPV
A Figura 2 mostra exemplos de imagens de cortes corados FFPE de cabeça e carcinoma de células escamosas pescoço. No caso de HPV-positivos (Fig.ure 2A), as sondas de HR-HPV detectado sinais puntiformes fortes especificamente nas células tumorais. A sonda detectada UBC numerosos sinais citoplasmáticos puntiformes em ambas as células tumorais e as células do estroma (figura 2B). A sonda dapB gene bacteriano demonstrou um fundo limpo (Figura 2C). No caso de HPV-negativo, tanto a sonda HR-HPV e a sonda dapB detectado nenhum sinal (Figuras 2D e 2F), enquanto que os sinais fortes foram detectados utilizando a sonda de UBC (Figura 2E). Neste ensaio, UBC serve como controlo positivo para avaliar a qualidade do RNA de tecido e dapB como controlo negativo para os sinais espontâneos. A pontuação para determinação do estatuto de HPV envolve examinar todas as três lâminas para cada caso. O nível de coloração no controlo deslizante negativo (dapB) corrediça é utilizada como ponto de corte: positividade HPV é definida pela presença de citoplasmática punctata e / ou coloração nuclear que era anteriormente o sinal no slide dabpB.
Figura 1. Fluxograma de ensaio RNAscope. Ilustração de fluxo de trabalho de ensaio RNAscope. O ensaio RNAscope contém quatro etapas principais, pré-tratamentos, a hibridação sonda alvo, amplificação de sinal e detecção do sinal. O procedimento de ensaio completo pode ser concluído em 8 horas. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Imagens exemplo de lâminas RNAscope coradas seções FFPE corados com sondas para HR-HPV, UBC (controle positivo) e dapB (controle negativo).a partir de dois casos HNSCC. AC. Caso de HPV positivo. A, expressão de E6/E7 do HPV HR-mRNA nas células tumorais. Inset, aumento de 40 vezes para mostrar sinais puntiformes. B e C) cortes de tecidos adjacentes que apresentam coloração positiva UBC (B) e negativo para dapB (C), respectivamente DF) HPV-negativos caso. D). Nenhuma coloração para HPV E6/E7 mRNA , similar ao controle negativo dapB (F). E) UBC coloração positiva. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Discussion
O ensaio RNAscope HPV permitiu a visualização direta de E6/E7 mRNA in situ na cabeça associada ao HPV e carcinoma de células escamosas pescoço. O ensaio RNAscope é totalmente compatível com o tecido do tumor rotineiramente fixo e preserva a morfologia do tecido para as correlações histopatológicas (Figura 2). Uma vantagem chave do ensaio em relação aos métodos RNAscope CISH convencionais é que especificamente amplifica os sinais de hibridação (Figuras 2B e 2E) sem amplificação do ruído de fundo (Figuras 2C e 2F).
Na prática, o procedimento de ensaio RNAscope HPV pode ser concluída dentro de 8 horas ou convenientemente dividido em dois dias. O ensaio RNAscope HPV tem sido usado para determinar a infecção por HPV na cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas 12-16, que demonstra a sensibilidade 97% e especificidade de 93% utilizando qRT-PCR, como o método de referência 16. Chr convencionalISH omogenic para HR-HPV DNA é altamente específico, mas tem uma sensibilidade de 80% ~ 12. Imuno-histoquímica (IHQ) coloração para o celular substituto marcador p16 demonstra excelente sensibilidade, mas podem gerar resultados falsos positivos 15,18, especialmente na cabeça e pescoço nonoropharyngeal 15. O atual método "padrão ouro" de qRT-PCR para HPV E6/E7 detecção do RNAm requer tecido fresco congelado para melhores resultados e é tecnicamente complexo, o que limita seu uso apenas para o laboratório de pesquisa. Além disso, requer a extração de RNA que torna impossível correlacionar expressão HR-HPV E6/E7 mRNA com a histopatologia.
Há vários fatores críticos para o sucesso do ensaio RNAscope. Primeiro, para obter melhores resultados, os tecidos devem ser fixados em formalina a 10% fresco neutro tamponado à temperatura ambiente durante 16-32 horas de acordo com as diretrizes da ASCO / CAP 19. Em segundo lugar, o forno HybEZ é altamente recomendado, uma vez que permitemé um óptimo controlo de temperatura e umidade para a hibridização da sonda e as etapas de amplificação de sinal. Em terceiro lugar, é importante para remover o excesso de buffers residuais antes de cada passo, mas ainda manter a secção de tecido de secagem durante qualquer uma dessas etapas.
O procedimento RNAscope manual descrita aqui tem sido completamente automatizada em um sistema de corrediça-coloração automóvel comercial 10. Isso deve facilitar muito a normalização das condições de ensaio e salvar o trabalho manual precioso em laboratórios de patologia clínica. Além disso, o software de análise de imagem dedicado foi desenvolvido 10 para identificar automaticamente as células e sinais de coloração em um slide digitalizado, o que deve ajudar a eliminar a subjetividade e melhorar a reprodutibilidade na pontuação.
Em resumo, o ensaio RNAscope HPV detecta a presença de transcritos de E6/E7 de HPV-RH in situ de mRNA em tecidos FFPE. Tem um fluxo de trabalho que é familiar para labora patologia clínicatories por permitir a visualização direta destes em cortes de tecido. Ele oferece uma plataforma ideal para o exame (FFPE) amostras de tecido, e pode ser facilmente adotado por laboratórios de patologia de diagnóstico.
Disclosures
Todos os autores são empregados pelo próprio estoque e em diagnósticos avançados celulares, Inc.
Acknowledgments
Apoiado em parte pelo NIH conceder (R43/44CA122444) e DOD BRCP concessão (W81XWH-06-1-0682) para YL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill's Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Cover Glass 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| Drying Oven | Capable of holding temperature at 60±1 °C | ||
| Water Bath | Capable of holding temperature at 40±1 °C |
References
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