Abstract
使用荧光显微镜的生物样品的成像已经与新技术，以克服光使超分辨率活样品的衍射的分辨率屏障高级基本上。目前的超分辨率技术主要分为三类 - 受激发射损耗（STED），单分子定位显微术（包括如掌，困了，GDSIM技术），以及结构照明显微镜（SIM卡）。虽然受激发射损耗和单分子定位技术显示分辨率的增幅最大，他们一直较慢，提供图像采集速度提高。三维SIM（3D-SIM）是宽视场荧光显微镜技术，它提供了大量的超过两个单分子定位和受激发射损耗的优点。提高分辨率，具有典型的横向和轴向的110和分别高达30微米采样的深度从盖玻片第280纳米，并且允许成像整个细胞。最近的技术增加原始图像的捕获率的进步（快速3D-SIM），可在几秒钟内发生的生物过程中的快速捕获，而显著降低光毒性和光漂白。在这里，我们描述了使用一种这样的方法，将图像的细菌细胞携带荧光标记cytokinetic FtsZ的蛋白质，以显示如何细胞进行分析和特有信息，该技术可提供的类型。
Introduction
许多不同的成像技术已被使用多年研究的细菌包括各种电子和光学显微镜技术。虽然电子显微镜提供极高的分辨率，下至纳米，需要一种用于真空和造影剂的使用限制了这种技术来固定和包埋的标本。神器也可以样品制备漫长和熟练的工作人员，需要准备的样品，分析和解释所产生的图像，由于出台。光学显微术提供了更简单的样品制备和多个标签相对容易的应用程序与电子显微镜相比的优点。使用荧光蛋白质和染料结合物，以研究活细胞用荧光显微镜的能力也是可能的。以改善荧光基团的稳定性和荧光蛋白大小/结构导致降低细胞毒性，以及进展照相机检测技术部历史易学，采用宽视场显微镜和共聚焦成像系统，荧光显微镜已经显著扩大了我们的细胞的空间动态的理解。使用这些技术，我们在过去的20年中细菌细胞的知识已经进展大大到，揭示了细菌细胞1内的高层次结构和蛋白质组织的一个更详细的视图。
然而，光学显微镜的常规方法是衍射受限的，这意味着固有分辨率大约一半所用的激发光的波长的光。因此，即使在最优化的以往的光学显微镜系统，最好的横向分辨率为约220-250纳米，轴向分辨率为约500纳米（对于综述，参见Schermelleh 等2）。特别是对于细菌的细胞生物学家，这仍然严重地限制了我们这些微小的细胞的空间组织的认识;暂时只有1-2微米直径ETER和1-10微米的长度。也有需要，可以在活细胞中，其中的蛋白质的动态空间行为可以被分析体外数据来补充进行更高分辨率的技术。
在过去的十年中，一些超分辨率荧光成像技术已经开发出来。超高分辨率显微镜描述成像技术，至少有两倍的横向分辨率与传统光学显微镜获得的，从而克服衍射障碍。这些技术的操作所发出的光的照射和/或分析，以建立实际增加的表观分辨率。目前有三种主要类型的超分辨率技术- I）的受激发射损耗显微镜3（STED）; II）单分子定位显微技术，包括如光敏定位显微镜4,5（PALM），随机光学重建显微技术
三维结构照明显微镜（3D-SIM）是一种能够提高导致的大约110和280nm处分别决议横向和轴向分辨率的宽视场技术。采样的深度为从盖玻片为30μm，从而允许整个细胞的成像。 3D-SIM的光学显微镜实验（OMX）平台上开发的塞达特，阿加德和Gustaffsson的变化涉及到与移动到15个不同的已知的格子图案照射样本在每个z平面9-11立场。在那些中的可观察到的区域的外侧频率空间中创建的所得莫尔条纹的条纹被测量。从频率空间中的信息在计算上是重构，以产生可见的超分辨率图像10,11。在这原始图像可以使用这种技术来获得的相对速度使活细胞成像。然而，值得注意的是，用于在时间尺度的秒发生的生物过程中，原始图像的采集速率仍然太慢捕捉动态变化是很重要的。对于时间序列有几秒钟的捕获率，重复购买没有足够的恢复时间可能会导致光毒性和光漂白，特别是在小的细菌细胞实时成像。
为了克服这些问题，已经开发了最新进展为快速的3D-SIM（F3D-SIM）。在这里，我们描述一个被称为OMX大火16这就是我在2011年年底ntroduced该技术构建，无需使用一个物理网格，在早期的系统使用的图案照明。利用干涉光的光束和新快门技术允许在非常迅速的方式将样品在创建图案化的光。随着引进科学的互补金属氧化物半导体（SCMOS）相机相比，现有的EMCCD相机的图像采集的速度被进一步提高，特别是。这些改变导致了1微米（512×512个像素，9的z切片）的取样深度为每秒1帧的一个可能的图像采集速率，允许秒16内发生的细胞内监测的动态变化。在表观曝光（激发）倍的降低生活使用这种方法允许使用较长的时间序列被捕获或增加的捕获率的细胞。
这里我们描述的F3D-SIM显微镜应用到考试系统E中的结构和cytokineticŽ环两种细菌物种的细胞的动态运动：棒状模型生物体枯草杆菌和球菌的人类病原体金黄色葡萄球菌 。 FtsZ的是，起着17,18细菌在细胞分裂的关键作用，微管蛋白样细胞骨架蛋白。它定位于师现场招聘至少20个其他分裂蛋白，形成分工设备17,18，和被认为是为细胞收缩19-23力。该方法揭示了FtsZ的分布不均匀围绕在两种生物体中的珠状排列在Z环;解决的Z轴环是否是该小区的周围连续均匀带，所建议的低温电子断层扫描（ECT）24作为可视化用传统的宽视场荧光显微镜，或者不连续的结构，长期持有的问题。我们展示了如何3D-SIM卡的能力可以大大提高微小空间检查（1微米直径）的圆形细胞样学金黄色葡萄球菌是划分在三个连续的垂直平面（X，Y，Z）。使用这些技术的时间推移研究显示，在Z环的结构是动态的，以移入和移出一个固定支架24的环内毛组织的变化，而 不是FtsZ的分子。
Protocol
1，样品制备
- B的制备方法枯草芽孢杆菌细胞成像
- 接种10毫升Penassay肉汤（平安银行，也被称为抗生素中3）与B的单菌落枯草芽孢杆菌菌株SU570（168 杆菌trpC2的FtsZ :: FtsZ的-GFP-SPEC）16。在低速（100转）摇动生长过夜，在30℃。
- 稀释过夜培养至0.05 A 600（吸光度在600nm处测量）在淡水平安银行在30°C的高速（215转）抖动和成长，直到指数中期阶段（A 600〜0.4）。
- 加入2克电泳级琼脂糖在100毫升1X生长培养基（PAB）的螺旋盖的玻璃瓶。琼脂糖溶解在高压灭菌器。这可以被储存在4℃下进行几个月的时间，并且微波加热在需要时以熔化琼脂糖。允许设定为室温。
- 附加的粘合剂帧（65微升的容量; 见表材料 ）上，以一个标准的GLASS显微镜载玻片。要做到这一点，除去薄的聚酯片材（各粘合剂帧定位在两个聚酯薄片，一层薄一厚之间，并具有中心方移除）以及该帧的暴露的粘合剂表面施加到显微镜载片的表面上。这有效地在幻灯片的顶部创建一个正方形好。离开安装到框架，因为这会防止盖玻片粘到它在后续步骤中的厚的聚酯片材。
- 融化在微波琼脂糖溶液，直至沸腾，吸管67微升到粘合剂框架。立即放置于顶部盖玻片以创建一个平坦的表面，在室温下离开5-10分钟。取出盖玻片为1-2分钟，而样品被收集。
- 收获1毫升等分样品和离心机在5900 XG为30秒。弃去上清液，重悬在200μl沉淀新鲜的PAB。
- 取2.5μl的浓缩试样和吸管到预准备相红色的琼脂糖凝胶垫。均匀分布的样本沿琼脂糖垫的平坦表面。删除使用镊子，而不是触摸的琼脂糖凝胶垫的显微镜载玻片的粘合框架。
- 从显微镜载玻片转移琼脂糖垫直径35 mm的培养皿盖玻片底部。倒置琼脂糖垫，以使细胞悬浮液的培养皿与盖玻片处于彼此直接接触。陪替氏培养皿的底部，具有1.525的高分辨率成像的折射率。
- 现场学的制备金黄色葡萄球菌细胞成像
- 接种10毫升L-肉汤与S的单菌落金黄色葡萄球菌菌株SA94（含犁的FtsZ-GFP和pGL485 SH1000，呃R，厘米R）25。在低转速（100转）旋转摇床上一夜长大，在37℃。
- 稀释过夜培养至0.05 A 600（600nm处吸光度测定）在新鲜的L-肉汤中含0.05 mM的IPTG（异丙丙基β-D-1-硫代半乳糖苷），诱导产生的融合蛋白。
- 在37℃下用高速（215转）抖动和成长，直到指数中期阶段（A 600〜0.4）。
- 所描述的B. 1.1.8 -按照步骤1.1.3 枯草芽孢杆菌活细胞制剂。
注意：加入诱导剂的适当浓度的琼脂糖溶液中的步骤1.1.3对于下表达诱导控制的荧光融合蛋白的菌株。
2，准备显微镜
此方法使用配备了火焰模块DeltaVision OMX集团（光学显微镜，实验）3D-SIM成像系统。对于实验所述，仅一个激光器和一个照相机被使用。的照明和光路在图1中进行了描述。这种方法假定在显微镜具有适当的校准，光学传递函数（OTF）文件和准直光进行维修。
- 活细胞成像的实验，确保加热台附着到陶瓷级和目标加热套环附着到物镜（60X 1.42 NA油浸物镜）。
- 打开目标和阶段加热器至少4小时前成像和缓慢上升的温度到所需要的设定在5℃/小时的最大速率。建议先启动这个进程，晚上成像和坡道以3℃/ 4小时。对于活细胞实验二枯草芽孢杆菌 ，大多数实验是在30℃下进行。对于S。葡萄球菌 ，所有实验均在37℃下进行。
- 在实验当天，打开系统至少1小时前成像，以允许系统和激光器完全稳定。装入小碟阶段插入到加热阶段预热。
- 打开主控制器工作站上。
- 打开所述图像处理workstat离子。
- 打开位于显微镜外壳外侧的地板相机冷却器。
- 打开所有的SCMOS相机（即使它们不是都可以使用）。
- 内部的激光和电子产品的外壳，打开：
- 仪表控制器机箱。
- Nanomotion底盘。
- 耶拿控制器用于Z压电式。
- 所有4振镜电机控制器。
- 主激光器控制模块。
- 二次激光控制模块。
- 所有摄像头的工作站。
- OMXIC工作站。
- 在主控制器工作站，通过点击图标打开OMX软件。设置数据保存到相应的数据文件夹中的文件路径。
- 初始化硬件，进入硬件菜单，选择硬件 ，然后单击重新启动硬件按钮。关闭窗口。
- 启动softWoRx software.Turn上所需的实验激光器（488纳米）。
- 转激光安全联锁钥匙开关上。
- 确保正确的分色滤光器抽屉插入下面的目的。对于GFP，它是标准的（或固定）的抽屉。
- 在OMX顺丰，转到文件菜单，选择设置 ，然后从抽屉下拉菜单中选择固定的抽屉里。关闭窗口。
- 从做软件的主界面，在光参数部分如下：
- 激活相应的摄像头从通道选择的激发激光器和发射滤光片（FITC）相机。
- 检查模式设置为连续的图像 。
- 检查光路设置为SI。
- 检查模式设置为95兆赫。
- 检查488激光在激励选择。
- 设置
- 在实验中选项卡上，确保类型从下拉菜单中设置为SI。
- 确保切片被激活，并且，该光学部的间隔被设置为0.125。
- 确保对焦点时，扫描开始的中间。
3，图像采集
- 应用一滴油客观的顶部。为37℃，推荐的起始油的1.518到用于安装的细菌细胞的凝胶垫的折射率最好的匹配，在37℃的折射率（参照步骤1.1.3）。
- 放置含有制备细胞样品的培养皿放入阶段插入并覆盖与圆形加热盖。降低阶段，待油触及底部样品培养皿。
- 让菜中暑的平衡在现阶段15分钟。采用5毫秒以内（位于光参数部分）低曝光设置，着眼于利用纳米定位平台控制（DZ，坐落在纳米定位部分）的样品。聚焦上下穿过样品，以确定该光被均匀地分布的上方和下方的样品焦平面。如果该点扩散函数是不连（球面像差），清洁样品盘的底部，并用氯仿目的。更换机油和，直到一个合适的匹配的石油和样品折射率之间发现，以减少球面像差重复此步骤。
- 使用0.5微米的DZ的步长大小，标记图像堆栈的顶部和底部。返回到样品的中间。单击试验选项卡中获取厚度按钮设置样品采集的厚度。记P上的纸堆高度为最小，同时小心不要切断的Z环的顶部和底部。典型的厚度为B.枯草芽孢杆菌样本2-3微米。
- 确定样本图像的最大强度值（ 最大值 ）与当前的曝光和％T设置。这个值被发现在图像窗口的下面。对于时间推移成像，调整曝光和％T获得1,100-1,400上述背景图像的最大强度。 1000高于背景的最低发光强度需要获得图像重建。对于一次性的形象，增加了最大强度为4000-5000。
- 激活的实验标签中的定时部分。设置所需的帧速率和总的时间。在数据文件中，输入适当的文件名 。点击Run按钮开始图像采集。
注：图像采集完成时，对G颖进度条结束，日志文件会出现在相应的数据文件夹中的数据集。
4，检查数据质量
- 在图像采集开始时，注意到图像的时间序列的第一帧的图像采集开始时的最大强度值。在采集的第一帧的结束时，检查是否有尚未完成以上的降低信号强度的10％通过的Z-堆栈，该第一帧。如果出现了比光致漂白中的第一时间点的这个水平是更，通过对时间序列的数据将是质量不够用于分析和时间系列采集可以被停止。
- 在采集的时间序列的末尾，打开与.DV后缀所得原始图像文件并从时间序列中的最后图像的开始确定在最大信号强度的降低。丢弃任何时间点那里有蜜蜂n多超过30％漂白。
5，重建3D-SIM卡图片
- 从处理菜单中，激活的SI重建窗口。使用预先存在的设置的所有参数。
- 激活使用渠道的具体OTF按钮，并设置为标准过滤集。激活使用特定频道正角按钮，并设置为标准过滤集。
- 拖放生（.DV）文件到输入文件空间。单击做到这一点 。输出文件将具有相同的名称与_SI输入文件加在最后。
注：此重建过程可以作为从处理菜单中使用任务生成器功能，如果多个文件要处理的任务。
6，数据导出和分析
- 使用了Imaris可视化的三维图像，超越模式和前端口的图像数据为TIFF（300 DPI）或AVI文件（无压缩）。在了Imaris尺寸测量可以使用测量工具在超越模式下进行。
- 生成3D强度图，从3D-SIM卡的图像数据在Z环：
- 检查的FtsZ的分布绕Z环和创建3D强度图
- 打开一个3D图像文件查看个人Z-切片。使用音量浏览器工具位于视图菜单选项卡下的作物感兴趣的区域。
- 输入窗口编号为这个3D图像到输入窗口，输入一个新的和未使用的窗口号到输出窗口。选择区域按钮将变为可用但从原来的40×40微米大田作物感兴趣的个人Ž环。
- 调整旋转选项卡所需的轴和旋转度。点击做按钮。滚动量，得到在Z环的所需的角度。
- 使用数据检查工具，调整吨他列/行维度创建新的感兴趣的区域周围一个人Ž环。单击该图像的中心来定位感兴趣的新区域。文字图像数据是自动生成的表，显示感兴趣的区域内的每个像素的荧光强度。
- 点击3D图形按钮，开始查看强度的情节。
- 另外的文字图像数据可以通过单击文件菜单中的保存表数据按钮导出。
- 从已保存的文本文件中的图像数据复制到一个新的试算表。在试算表中选择所有单元格，并创建一个新的三维曲面图。格式化3D强度图图出版。
- 对于延时数据重复步骤6.2.1.1 - 6.2.1.7对每个不同的时间点从3D图像文件。
- 检查的FtsZ的分布绕Z环和创建3D强度图
- 追踪平均荧光强度随时间变化
- 使用的文字图像数据跟踪fluorescenCE强度随着时间的推移在感兴趣的区域中。
- 选择对应于所述感兴趣区域的细胞。
- 计算平均荧光强度为感兴趣这个区域中的每个时间点。
- 使用平均荧光强度值来生成一个单独的线图。
Representative Results
在本研究中，我们可视化的细菌细胞分裂蛋白FtsZ的，表现在活细胞作为FtsZ的-GFP融合，以说明在普通荧光显微镜F3D-SIM的强大优势为研究细菌蛋白定位和动力学。 FtsZ的是，聚合成周围的小区的周边的动态环结构的微管蛋白等细胞骨架蛋白。 Z轴环在细胞分裂的一个重要功能：它标志着装配师的未来网站，募集的所有细胞分裂的蛋白质来这个网站，和Z环收缩的出现提供了动力，使外来的细胞膜的运动细胞分裂17时18。
当通过常规的宽视场荧光显微镜观察时，Z环显示为荧光在棒状细菌的单横带，包括最充分研究的生物，如二枯草芽孢杆菌 （ 图2A），<EM>电子邮件。大肠杆菌和C.新月 。重要的是，在整个频带中的荧光强度似乎或多或少均匀，并且定位图案具有非常小的洞察Z轴环内的结构组织和FtsZ的聚合物分布。当相同的细胞通过使用此处描述的F3D-SIM方法（ 图2B）检查，但是，这种技术的优点是显而易见的。首先，绕z轴的3D-SIM图像的旋转使Z轴环作为一个真正的环结构在三维空间中（ 图2C和图3A）的可视化。连同增加的分辨率，这表明的FtsZ的Z环的分布是实际上高度异质性（ 图3）。在分辨率的提高也使我们可以看到，已经开始收缩的过程中，以形成分裂隔膜（由细胞膜的内陷表示Ž环<强>图2C和2D）。
B.另外的实施例通过这种技术可视化枯草 Ž圈示于图3Bi - 3Biv并说明了如何围绕Z环中的荧光强度是永不相同。此外，非常低的荧光强度的区域常常观察到。我们称这些区域为空白（白色箭头）。我们观察到在审查所有的Z环（N = 84）的15％，主要是在一个直径为800Ž环这些差距 - 900纳米（93％）。为了量化这些观察，3D亮度曲线创建Z轴环，并用图3Biii和3Biv显示Z轴环如图3 Cl和3Cii。强度曲线表明，通常荧光的Z环的数量可以变化多达3 - 4倍，在B的不同区域枯草 ž环。此外，3D亮度曲线表明，GA荧光Z轴环内的PS几乎读的背景荧光（黑色箭头， 如图3 Cl）基线水平。上面这些例子描述了在Z环的好重建和依赖于充足的光线从外面显著漂白样品被发射。这是通过GFP的荧光团稠合的FtsZ和其在这些条件下，细胞丰度（高信噪比）的亮度来实现的。在其它细胞中，其中所述信号的信噪比是低的图像的重建是很差。为了模拟这种情况的发生与FtsZ的-GFP，发射信号从B.收取的金额枯草芽孢杆菌细胞减少通过降低励磁能量。 如图3D中的Z环具有显著工件的图像的100倍减少的激发能量的结果。出现这种情况作为的FtsZ-GFP信号，并导致便便背景之间的局部对比度不足的后果ř重建图像。
有趣的是，B。枯草 Ž环显示在该环的顶部和底部区域，但尚未在该环（ 图3B）的侧面更明显的差距和异质性。这是因为在由该变化的3D-SIM的横向平面相对于轴向平面实现的分辨率的差。这导致在Z环（横面）的顶部和底部区域被成像以最佳分辨率。在Z环的间隙太小，在Z环的两侧，以被检测为可视化在轴向平面上，其具有横向平面的大约一半的分辨率。细菌有球菌的形态，如S。金黄色葡萄球菌 ，具有其定位在所有平面Ž环。所以成像在Z环，当它出在横向平面内（或接近）提供的能力，以图像中的环上所有区域具有最佳的分辨率。利用这一点，我们研究的结构活学 Z轴环金黄色葡萄球菌细胞，利用含有质粒轴承的FtsZ的-GFP融合菌株。生产这种融合是P SPAC诱导型启动子的控制下（ 步骤1.2.1）。当用在轴向平面，S成像金黄色葡萄球菌 ž环出现相同B.枯草 Ž环是存在于同一平面上（ 图4AI）。但是，在横向平面成像Ž环确认整个Ž环出现两个珠状和不均匀的。大约26％的这些环也显示出荧光的至少一个可见的“间隙”（ 图4Aii，4B）。类似于二枯草芽孢杆菌的FtsZ，荧光强度曲线表明，荧光在Z环的强度变化多达4 - 6倍于S的不同区域葡萄球菌 Ž环（ 图4C）。
珠的长度和宽度可以被测量（请参考图4D原理图）。这表明，80％的Z轴环组（n = 43）进行了检查了的具有200nm的胎圈长度，达到400nm的最大长度。珠子的宽度，另一方面，测量到200纳米。有每Ž环平均12±2（SEM）的FtsZ的珠子。观察到类似的定位数据时，本地的FtsZ没有可视化这些方法用免疫荧光显微镜（IFM），这表明该异构和珠状的定位模式是真实的，而不是神器，除了原生的FtsZ造成的FtsZ-GFP的表达（数据示出）。 3D-SIM卡的此改进是能够显示的Z环显示为多相结构，且是在自然界中可能不连续。
解决如何此异质Z-环结构发生收缩，并促进细胞分裂的问题，能够进行Ž环动态特性的时间推移分析。一个与主要挑战荧光显微镜的时间推移的研究是在样品的光漂白和光毒性的成像过程中的最小化。 3D-SIM要求来获得，这意味着光漂白的样品随着时间的推移会导致较差的信号 - 噪声比，导致不足的信号，以允许相应的图象再现大量原始图像。该新技术的应用最小激发能用于每个曝光，从而降低了能量进入活细胞的数量。它通过光束干涉的组合，以形成样品经结构化图案和使用科学的CMOS摄像机的增加灵敏度和量子效率。这种组合的结果在Z堆叠采集每秒1微米（512×512像素×8的z片）相比，每与我们先前的迭代得到5-8秒（512×512像素×8的z切片）为1μm 3D-SIM卡（在Riglar 等人 26所述）。降低图像采集时间和曝光设置也可以帮助减少活细胞是在时间推移的研究特别重要的光毒性。这里介绍的新技术也解决了活细胞成像的另一个问题是，我们所说的“运动模糊”，在这种情况下指的是蛋白质图像采集过程中改变了国产化。通过降低图像采集时间的“运动模糊”量最小，从而创造一个更精确的图像重建。
已解决怎样的FtsZ是Z环内组织以前的研究一直没能说明如何Ž环结构随时间变化。为了研究这方面我们进行了使用F3D-SIM卡延时。这使收购B. Z轴环的3D-SIM卡的图像枯草每5-10秒的时间内为50秒，这在以前是不可能在此时间尺度。 如图 5a 所示为为例在Z环内的FtsZ分布的快速变化E的时间（890纳米直径）。其他Ž环那是明显的收缩的过程中也被示出为具有影响的FtsZ的绕Z环的分布相似动力学（未示出）。也可以为每个时间点所产生的三维强度曲线来量化和理解的不断荧光强度的变化和的FtsZ的Z环的不同区域从而相对丰度在几秒钟的时间尺度（ 图5B）。感兴趣的区域可以从这些强度曲线来确定跟踪的荧光强度（ 图5C）的波动。跟踪这些条件下这些变化在Z的环结构将是几乎不可能的，没有先进F3D-SIM技术。此外，这项工作表明，在S。金黄色葡萄球菌的FtsZ的动态运动是类似于B.观察枯草芽孢杆菌S。金黄色葡萄球菌 RN4220细胞PRoducing的FtsZ-GFP进行成像为50秒，在10秒的时间间隔。变化在S与Z环的异质金黄色葡萄球菌与F3D-SIM卡也同样为B枯草芽孢杆菌 （参见箭头和箭头在图6）。这些时间的推移研究支持Ž环收缩（迭代捏模型），这是通过检查固定C的预测模型新月柄细胞，但不能表现出由于需要研究在活细胞27 Z-环动力学。
图1示意了F3D-SIM卡的从激光表这项研究。激光使用的光学结构是通过SIM卡光纤准直透镜定向和固定光栅，然后进入创建两个特定的波长，相位控制模块最佳间距Øf起的零阶中央光束的±1级光束的相位的步骤为SIM集合。光束再进入角控制模块，其中光束被反射到3个不同的聚类来创建3个角度的照明。梁再进入显微镜的光路如图所示（由保罗·古德温修改许可，API）。
常规的宽视场荧光B的和3D-SIM成像的图2的比较枯草芽孢杆菌细胞表达的FtsZ-GFP。 （一）B的传统的宽视场荧光成像枯草芽孢杆菌细胞表达的FtsZ-GFP（SU570;绿色）作为一个单一的副本也沾满了膜染料FM4-64（红色）。比例尺=5μm以下。使用一个堂堂正正的荧光显微镜获得的图像。（二）同一B的3D-SIM成像枯草芽孢杆菌菌株表达的FtsZ-GFP，沾上FM4-64。从图像中的感兴趣区域可以被选择（虚线框）进行放大的图像，也可以绕z轴，以查看三维的FtsZ环在轴向平面内旋转（C，D）的除去外OF-聚焦光及由3D-SIM提供改进的图像分辨率可清楚Ž环的可视化（包括那些收缩）和分裂过程中的内细胞膜（白箭头）。需要注意的是该协议的文本描述了单个荧光基团的可视化。但是，该过程可以适于同时获取多达四个不同波长的光。这一数字已重印从施特劳斯等人 16。
图3。 Z轴环在活棒状细菌细胞（ 枯草芽孢杆菌 ）表达的FtsZ-GFP使用3D-SIM卡的代表性图像。 （AI）的Z环是随着观察荧光垂直于它是在xy平面内的小区的长轴线的频带（AII）的图像已被旋转绕 z a轴采用了Imaris 3D可视化软件（参照协议步骤6.1），这样一个翻翻环结构清楚地看到FtsZ的是Z环内分布。这个形象，如今在ZX平面显示，环具有的FtsZ的异构分布的地区没有或很少的荧光（白色箭头）。图像必须旋转，观察荧光，这些“缺口”地区。双BIV显示，现在躺在ZX平面旋转Ž环进一步例子。 Ž环中（BI-III）有一个直径为0.9微米〜（BIV）显示为Z环直径的ONLÝ0.65微米发生收缩（次）这典型三维强度分布示出的荧光强度（ 即浓度）左右的直径为0.85微米的Z轴环中的FtsZ-GFP的差异（参见方案步骤6.1-6.3）。荧光在这些间隙的电平为低，并接近背景荧光水平（黑箭头）。（CII）在收缩的过程中为Z环的类似的三维强度分布。的FtsZ-GFP的浓度也无统一的;直径0.65微米。图A，B，CI和CII纷纷转载自施特劳斯等[16]。
图S的代表性的3D-SIM卡图片金黄色葡萄球菌细胞产生的FtsZ-GFP。由于这些细胞是圆形的（球菌），Z轴环将甲肝ê不同的方向。这表明荧光的正常观看方向的频带的细胞（即，在xy平面内），如图中的（AI）中，当围绕Z轴旋转，如对于图1AI看起来非常类似于在杆状细胞。在（AII）与Z环是已经在xy平面内;横向方向和分辨率是最大的，在整个环现在给人的珠状结构（B）（C）的FtsZ-GFP在Z轴环的相对丰度的3D强度图（D） 在 S的示意图。金黄色葡萄球菌 ž环。红色箭头表示胎圈长度和宽度尺寸（参照协议步骤6.1）。这个数字已经被修改施特劳斯等[16]。
<STRONG>图5 F3D-SIM卡允许FtsZ的本地化随着时间的推移3D-SIM卡的快速分析。 （a）在杆状B. Z轴环内变化的FtsZ-GFP分布枯草芽孢杆菌细胞可以被可视化，以指示该环的动力学。时间（秒）表示在每个图像的左上角（B）3D荧光强度的图显示了非均匀的和的FtsZ的Z环的动态分配（C）的FtsZ动力学（FtsZ的-GFP荧光的变化环）还可以通过在感兴趣的两个区域进行定量荧光强度随时间的检测的更多细节。这一数字已重印从施特劳斯等人 16。
图6 F3D-SIM卡的时间推移图像显示环内变化FtsZ的本地化随着时间的推移在S áureus。白色箭头指示的差距时，它最初在Z振铃检测。间隙在相同位置上的出现和消失（如标注的白色箭头）随着时间的推移示出了如何FtsZ的是绕Z-环重新分配。白色箭头指示的间隙在Z轴环的形成在稍后的时间点。时间（秒）被显示在图像的上部左手侧。这个数字已经被修改施特劳斯等[16]。
Discussion
荧光活细胞成像是一个强大的工具，可观察一段时间细胞内的动态变化。细菌细胞生物学的实时成像一直因为小细胞大小挑战性和降低了细菌细胞的可承受反复暴露于激发光的能力。 F3D-SIM卡已经扩展可用来查询所有的细胞生物学的工具，但它是要认真执行这一技术，因为神器可以推出，如果执行不力。有一些重要的考虑因素，成功地利用这种技术。因为它是依赖于使用所发射的光，折射率不匹配和发射的光的球面像差的点扩散函数的，必须避免使精确的图像重建中的宽视场荧光成像方法。使用0.17毫米的厚度的高品质的盖玻片，以避免由于在盖玻璃厚度变化的信号强度的变化唇强烈推荐。这是极为重要的，以仔细评估所发射的光的球面像差中的所有实验的初始阶段，并根据需要进行调整的浸油的折射率。这可以从一天到一天的变化，因为它是依赖于两者的温度和样品的安装媒体/衬底。使用不正确的油会导致低劣重建伪影，例如光晕和回波信号的图像。
在图像重建过程结束时，各相的重建质量的度量可以通过对照明的各相位/角度的“最佳拟合为kΩ的角度”获得。如果这个值低于1的每个角，然后对重构的质量很可能是高的。如果这个值是大于6，这是最有可能的重建图像将包含伪影。常见的工件包括：i）条的相对应的图像中的外观到网格的角之一。这可能是由于从该格角下的信号; II）晕圈围绕结构。这可能是由于信号从相对于周围结构明亮的结构非常不均匀的水平时，油的折射率的不匹配和样品，或者可以是由于在结构中的图像过于无定形的和不含有足够的“结构”是由算法识别; ⅲ）“蜂窝”，它是由一个低信噪比的图像中，通常由于高背景信号; iv）对被拉伸的结构/细长在XY这可能是由于石油和样品的折射率不匹配。这神器是难以辨别的一个没有经验的用户。我们建议新用户开始使用这项技术时，可以向有经验的SIM研究员图像判读和分析意见。
如同所有的荧光活细胞成像实验，这是进口蚂蚁仔细权衡，以减少光漂白和细胞，以用最少的伪像重构图像所需的足够的发射信号的光毒性的程度的激发能量输入。过度漂白（在单个Z堆栈收购超过30％）将导致重建图像的条纹图案。随着使用SCMOS相机，超高分辨率的图像可以被成功地从原始图像与发射信号低至千计数上述背景重建。这可以允许非常短的曝光时间，从而降低了光漂白和实现快速捕获每个帧。它也增加了帧之间的时间为细胞从激发态能量输入恢复量。此外，作为捕捉时间为每个单独的帧可以是非常短的，工件的个体捕获期间由“运动模糊”引入的程度被降低与使用该方法的。
这VARI3D-SIM卡的通报BULLETIN提供了许多其他的优势细菌细胞生物学家其他可用的和超高分辨率成像技术，实时成像。 2倍的分辨率在所有3个维度和能力，图像高达30微米到样品使整个细菌（和哺乳动物）细胞成像实验过程中。这是在渐逝波通常进行的技术，如单分子定位不能达到渗透深度成一个样本，并且不提供对整个小区的信息。这允许更高的采样深度为这种技术的最新进展，可能会导致整个细胞的更好的轴向分辨率。此外，需要数千被收购也仅限于可以被捕捉，并且可能需要捕获帧速率和最终实现空间分辨率之间的折衷，因为空间分辨率帧速率的原始图像的单分子定位技术依赖于夏娃的数量定义的空间内记录NTS。减小捕获的帧的数目将导致一个较低的空间分辨率，但可足以实现所需的感兴趣的生物过程的时间分辨率。的帧之间的恢复时间的量也可以根据需要增加，以减少光毒性在活细胞中，从而限制在一个能得到时间序列的持续时间和频率。如电子显微镜（EM）或电子cryotomography（ECT）提供高分辨率的技术更高的分辨率比3D-SIM（和其他超分辨率光学显微技术），但必须在固定的样品进行的。在固定和处理可能引入文物和缺乏标签可能使很难解释。无标记的ECT具有较差的对比度，并且可以达到约500-200毫微米24样品的穿透深度，因此，即使感兴趣的蛋白质可以被识别，不能观察到该蛋白在整个细菌细胞的结构。即使当标签可以在EM，如与免疫中使用，仅在二维执行成像。 3D是唯一可以实现的薄切片和部分计算重建。薄切片需要一个有经验的技术人员，但可能会产生问题，导致神器。用活的或固定细胞，3D-SIM不需要被嵌入在一个特定的方式和细胞可用于成像的近天然状态迅速制备。
这种方法是比较容易的研究人员在荧光显微镜最小的经验来实现。实验所用，只要它不发荧光或产生不必要的背景信号支持健康细胞的功能的介质中进行。对于细菌细胞，这可以允许使用多种类型的复杂和基本培养基或使用固体或半固体培养基中，以控制细菌细胞运动的。谁已经设计荧光蛋白（FP）的融合和测试的功能，许多生物学家这些融合可能需要这项技术很快没有进一步设计和验证新的光活化的FP融合。我们发现，作为一般的观察，发现S。金黄色葡萄球菌是成像与计划生育融合比 B中更容易受到光漂白枯草芽孢杆菌 。用我们的原创3D-SIM卡的方法，其中由物理光栅产生的格子图案，我们无法与一些学进行活细胞成像金黄色葡萄球菌的FP融合。然而，利用这种先进F3D-SIM方法，我们能够将图像的这些FP的融合，并执行短的时间序列来捕获这些标记的蛋白质的动态。这最有可能是由于需要用于成像和增加的帧之间的时间为细胞恢复减少的曝光时间。
OMX大火3D-SIM是可以相对容易地在一个单一的实验室或核心成像设备实现商用的技术。必须小心，以执行该技术，以避免阿尔季事实是由于样品制备差或图像捕获差。一旦该技术被掌握，蛋白质结构的小生物研究和动力学如细菌可以在单一或多色荧光来进行。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose I (Biotecnology grade) | AMRESCO | 0710-500G | Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media. |
| N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 4-64) | Life Technologies | T-13320 | Lipophylic dye used for staining cell membranes. |
| 1.5 ml microtube, graduated Natural | Scientific specialties Inc. | 1210-00 | Made from Homopolymer polypropylene, used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization. |
| Luria broth base, Miller | BD | 241420 | Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2% agarose after autoclaving. |
| BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3 | BD | 210932 | Prepared according to manufacturer's instructions. |
| Adhesive frame | Thermo-Fisher Scientific | ABGAB-0577 | Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15 x 16 mm). |
| Microscope cover glass | Thermo-Fisher Scientific | 111512-9 | 22 x 22 No. 1 Thickness |
| 35 mm diameter Petri dish with a glass coverslip bottom | World precision instruments | FD35-100 | Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35 mm, Glass: Ø 23 mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol. |
| Lincomycin hydrochloride | Sigma | L6004-5MU | Make a 25 mg/ml stock in 50% ethanol. |
| Erythromycin | Boehringer Mannheim GmbH | 12390120-14 | Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol. |
| Combined orbital/linear shaking waterbath | Grant scientific Instruments | OLS-200 | Shaking speed used for cultures: 215 rpm |
| UV visible spectrophotometer | Shimadzu | UV-1601 | 600 nm wavelength was used for measuring optical density of bacterial cultures. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Pellets of bacterial culture were obtained by spinning down mid exponentially growing cultures at 8,000 rpm for 30 sec. |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | 15502-10G | Prepare 1 M stock and filter sterilize prior to use. |
| softWoRx software | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | version 5.0 | |
| Imaris data analysis software | Bitplane Scientific Software, Bitplane AG | version 7.0.0 | Matlab XTensions included |
| DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module. | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | Blaze module fitted on OMX V3 | |
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axioplan 2 |
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