Abstract
Imagem de amostras biológicas por meio de microscopia de fluorescência tem avançado substancialmente com as novas tecnologias para superar a barreira resolução da difração da luz permitindo super-resolução de amostras vivas. Atualmente, existem três tipos principais de técnicas de super-resolução - esgotamento emissão estimulada (STED), microscopia localização única molécula (incluindo técnicas como PALM, tempestade, e GDSIM) e microscopia de iluminação estruturada (SIM). Enquanto as técnicas de localização STED e única molécula mostrar os maiores aumentos na resolução, eles têm sido mais lento para oferecer maior velocidade de aquisição de imagem. Tridimensional SIM (SIM-3D) é um grande campo da técnica de microscopia de fluorescência, que oferece um número de vantagens sobre ambos molécula única localização e STED. A resolução é melhorada, com resoluções típicas laterais e axiais de 110 e 280 nm, respectivamente, e profundidade de amostragem de até 30 mm a partir da lamela, permitindoimagiologia de células inteiras. Os recentes avanços (rápido 3D-SIM) para a tecnologia de aumento da taxa de captura de imagens em bruto permite a captura rápida de processos biológicos que ocorrem em segundos, reduzindo significativamente foto-toxicidade e fotodegradação. Aqui descreve-se a utilização de um tal método de imagem de células bacterianas contendo a proteína cytokinetic fluorescentemente marcado FtsZ para mostrar como as células são analisadas e o tipo de informação única, que esta técnica pode fornecer.
Introduction
Um número de diferentes tecnologias de imagem têm sido utilizados ao longo dos anos para estudar bactérias, incluindo várias técnicas de microscopia de elétrons e ópticos. Embora microscopia electrónica oferece uma resolução extremamente alta, para baixo para o nanómetro, a necessidade de um vácuo e a utilização de agentes de contraste tem limitado a esta técnica para amostras fixadas e embutidos. Artefatos também podem ser introduzidas devido à preparação da amostra demorado e um profissional qualificado é necessário para preparar as amostras, e para analisar e interpretar as imagens resultantes. A microscopia óptica oferece os benefícios de simples preparação da amostra e aplicação de várias etiquetas com relativa facilidade em comparação com microscopia eletrônica. Usando proteínas fluorescentes e os conjugados de tintura, a capacidade de estudar células vivas com microscopia de fluorescência também é possível. Com melhorias na estabilidade fluoróforo e proteína fluorescente tamanho / estrutura que levem à diminuição toxicidade celular, bem como avanços na detecção de câmera tecnolologia, microscopia de fluorescência confocal usando sistemas de imagem de campo amplo e expandiu significativamente a nossa compreensão da dinâmica espacial de células. Utilizando estas técnicas, o nosso conhecimento sobre a célula bacteriana ao longo dos últimos 20 anos, tem progredido significativamente para uma visão mais detalhada revela que um elevado nível de organização estrutural e proteína dentro da célula bacteriana 1.
No entanto, os métodos convencionais de microscopia óptica são de difracção limitada, o que significa que a resolução inerente é cerca de metade do comprimento de onda da luz de excitação utilizado. Por conseguinte, mesmo com o sistema de microscopia óptica convencional mais ideal, o melhor resolução lateral é de cerca de 220-250 nm e a resolução axial é de cerca de 500 nm (para uma revisão ver Schermelleh et al. 2). Para os biólogos de células bacterianas, em particular, isso ainda limita muito o nosso entendimento da organização espacial dessas pequenas células; sendo apenas 1-2 uM em diameter e 1-10 um de comprimento. Há também a necessidade de técnicas de resolução mais altas que podem ser realizados em células vivas, onde o comportamento espacial dinâmica de uma proteína pode ser analisada para complementar os dados in vitro.
Na última década, foram desenvolvidas diversas técnicas de imagem de fluorescência de super-resolução. Microscopia de super-resolução descreve técnicas de imagem que, pelo menos, o dobro da resolução lateral obtidas com microscópio óptico convencional, ultrapassando assim a barreira de difração. Essas técnicas de manipular a iluminação e / ou análise da luz emitida para criar aumentos reais do aparente resolução. Atualmente, existem três tipos principais de técnicas de super-resolução - i) estimulada microscopia esgotamento emissão 3 (STED); ii) microscopia de uma única molécula de localização, incluindo técnicas como a microscopia fotoativação localização 4,5 (PALM), microscopia óptica reconstrução estocástica
Microscopia estruturada tridimensional iluminação (3D-SIM) é uma técnica de campo largo que melhora a resolução lateral e axial, resultando na resolução de cerca de 110 e 280 nm, respectivamente. Profundidade de amostragem é de até 30 um a partir da lamela, permitindo imagens de células inteiras. A variação de 3D-SIM desenvolvido por Sedat, Agard, e Gustaffsson na plataforma (OMX) microscópio óptico Experimental envolve iluminar a amostra com um padrão de grelha conhecida, que é movida para 15 diferentesposições em cada plano z 9-11. As franjas nos padrões moiré resultantes que são criadas no espaço de freqüência fora da região observável são medidos. A informação a partir do espectro de frequências é computacionalmente reconstruída para gerar uma imagem de super-resolução visível 10,11. A velocidade relativa no qual as imagens cruas podem ser obtidas com essa técnica permite que imagens de células vivas. No entanto, é importante notar que, para os processos biológicos que ocorrem numa escala de tempo de segundos, a velocidade de aquisição das imagens em bruto continua a ser demasiado lenta para capturar as alterações dinâmicas. Para séries temporais com uma taxa de captura de segundos, a aquisição repetida sem tempo de recuperação suficiente pode levar a fototoxicidade e fotodegradação, especialmente durante a imagem ao vivo de pequenas células bacterianas.
Para superar esses problemas, os avanços recentes para rápido 3D-SIM (F3D-SIM) têm sido desenvolvidos. Aqui nós descrevemos um conhecido como OMX chama 16 que foi introduced no final de 2011 Esta tecnologia da iluminação cria padronizada sem o uso de uma grade física como foi utilizado em sistemas anteriores. A utilização de feixes de luz interferente e nova tecnologia obturador permite a criação da luz modelada sobre a amostra de uma forma muito rápida. A velocidade de aquisição das imagens foi ainda mais reforçada com a introdução de complementar científico semicondutor de óxido metálico (scmos) câmeras, especialmente quando comparado com as câmeras EMCCD existentes. Essas mudanças resultaram em uma possível taxa de aquisição de imagem de um quadro por segundo para uma profundidade de amostragem de 1 mícron (512 x 512 pixels, 9 z fatias), permitindo o monitoramento de mudanças dinâmicas no interior das células que ocorrem dentro de segundos 16. A diminuição nos exposição (excitação) vezes aparente para células vivas, utilizando este método permite que tanto séries de tempo prolongado para serem capturados ou um aumento na taxa de captação.
Aqui nós descrevemos a aplicação de microscopia F3D-SIM para examine a estrutura e movimento dinâmico do anel cytokinetic Z nas células de duas espécies bacterianas: o Bacillus subtilis organismo modelo em forma de haste e o agente patogénico humano cocoides Staphylococcus aureus. FtsZ é uma proteína do citoesqueleto afim da tubulina, que desempenha um papel chave na divisão celular em bactérias 17,18. Ela se localiza no local de divisão para recrutar pelo menos 20 outras proteínas de divisão, formando o aparelho de divisão 17,18, e acredita-se proporcionar a força de constrição de células 19-23. Este método revela que FtsZ é homogeneamente distribuída ao redor do anel Z, em ambos os organismos em um arranjo talão-like; resolver o problema de longa data de o anel Z é uma correia contínua uniforme em torno da célula, tal como visualizado por microscopia de fluorescência de campo amplo convencional, ou uma estrutura descontínua, tal como sugerido por electrões crio-tomografia (ECT) 24. Mostramos como a capacidade de 3D-SIM pode melhorar muito exame espacial de pequena (1diâmetro mm): células redondas como S. aureus que divido em três planos perpendiculares consecutivos (x, y, z). Estudos de lapso de tempo usando essas técnicas mostram que a estrutura do anel Z é dinâmico, com alterações macroscópicas organização dentro do anel, em vez de moléculas FtsZ entrando e saindo de um andaime fixo 24.
Protocol
Preparação 1 Amostra
- Preparação de B. Células subtilis for Imaging
- Inocular 10 ml de caldo Penassay (PAB, também conhecida como Meio Antibiótico 3) com uma única colónia de B. subtilis SU570 tensão (168 trpC2 FtsZ :: FtsZ-GFP-spec) 16. Crescer durante a noite a uma baixa velocidade (100 rpm) agitador a 30 ° C.
- Dilui-se a cultura durante a noite a 0,05 A 600 (medida de absorvância a 600 nm) em PAB fresco a 30 ° C com alta velocidade (215 rpm), agitando e crescem até meio da fase exponencial (A 600 ~ 0,4).
- Adicionar 2 g de agarose de electroforese em série em 100 ml de 1x meio de crescimento (PAB) em um frasco de vidro com tampa de rosca. Dissolve-se a agarose por autoclavagem. Este pode ser armazenado a 4 ° C, durante alguns meses, e microondas para fundir a agarose, quando necessário. Deixa-se repousar à temperatura ambiente.
- Anexar uma estrutura adesiva (65 l de capacidade, consulte a Tabela de Materiais) para uma ABL padrãoss lâmina de microscópio. Para fazer isso, remover a folha de poliéster fina (cada quadro adesivo é posicionada entre duas folhas de poliéster, um fino e um de espessura, e tem o quadrado central removida) e aplicam-se a superfície adesiva exposta da estrutura da superfície da lâmina de microscópio. Isso efetivamente cria uma praça bem em cima do slide. Deixe a folha de poliéster de espessura fixado ao quadro, pois isso vai evitar que a lamela aderindo a ela em etapas subseqüentes.
- Derreter a solução de agarose, num forno de microondas até ferver e pipeta de 67 uL para dentro da moldura adesiva. Colocar imediatamente uma lamela sobre a criar uma superfície lisa e deixar à temperatura ambiente durante 5-10 min. Retirar as lamelas para 1-2 min, enquanto a amostra é recolhida.
- Colher uma alíquota de 1 ml da amostra e centrifugar a 5900 xg durante 30 seg. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 mL fresco PAB.
- Tirar 2,5 mL da amostra concentrada e pipeta para um pré-prepaalmofada de agarose vermelho. Espalhar a amostra uniformemente ao longo da superfície plana da almofada de agarose. Retire a armação adesivo da lâmina de microscópio, usando uma pinça sem tocar na almofada de agarose.
- Transferir a almofada de agarose da lâmina de microscópio de 35 mm de diâmetro prato de Petri com uma lamela de vidro de fundo. Inverta a almofada de agarose de modo que a suspensão de células e lamela da placa de Petri estão em contacto directo uns com os outros. O fundo da placa de Petri, tem um índice de refracção de 1,525 para a imagem de alta resolução.
- Preparação de S. Vivo Células aureus for Imaging
- Inocular 10 ml de caldo-L com uma única colónia de S. aureus estirpe SA94 (SH1000 contendo araras-FtsZ-GFP e pGL485; Erm r, Cm r) 25. Crescer durante a noite a uma baixa velocidade (100 rpm) agitador rotativo a 37 ° C.
- Dilui-se a cultura durante a noite a 0,05 A 600 (medida de absorvância a 600 nm) em caldo L fresco com IPTG 0,05 mM (isoβ propil-1-D-tiogalactopiranosido) para induzir a produção da proteína de fusão.
- Incubar a 37 ° C com alta velocidade (215 rpm), agitando e crescem até meio da fase exponencial (A 600 ~ 0,4).
- Siga os passos 1.1.3 - 1.1.8, como descrito para B. subtilis preparação-de células vivas.
Nota: adicionar a concentração apropriada de indutor para a solução de agarose no passo 1.1.3 para as estirpes que expressam uma proteína de fusão fluorescentes sob controlo induzível.
2 Preparação do Microscópio
Este método usa um DeltaVision OMX (microscópio óptico, experimental) sistema de imagem 3D-SIM equipado com um módulo chama. Para as experiências descritas, apenas um laser e uma câmara são utilizadas. O trajecto de luz e iluminação são descritas na Figura 1. Este método assume que o microscópio tem calibração adequada, a função de transferência óptica (OTF)arquivos e manutenção colimação luz realizada.
- Para experimentos com imagens de células vivas, certifique-se a fase de aquecimento está ligado à fase cerâmica eo colar objectivo de aquecimento está ligado ao objetivo (60X 1,42 objetivo petróleo NA).
- Ligue os aquecedores objetivas e de palco, pelo menos 4 horas antes da imagem e rampa lentamente a temperatura para o valor desejado a uma taxa máxima de 5 ° C / h. Recomenda-se iniciar este processo na noite anterior à imagem e rampa a 3 ° C / 4 horas. Para os experimentos de células vivas com B. subtilis, a maioria das experiências foram realizadas a 30 ° C. Para S. aureus, todas as experiências são realizadas a 37 ° C.
- No dia da experiência, ligar o sistema, pelo menos, 1 hora antes da imagem para permitir que o sistema e lasers para estabilizar totalmente. Carregue a inserção pequena fase prato para o palco aquecido para pré-aquecer.
- Ligue a estação de trabalho do controlador mestre.
- Ligue o workstat processamento de imagemião.
- Ligue o refrigerador câmera localizada no piso fora do recinto microscópio.
- Ligue todas as câmeras scmos (mesmo que eles não vão ser usados).
- Dentro do laser e eletrônica gabinete, ligue:
- Chassis instrumento controlador.
- Chassis Nanomotion.
- Jena controlador para Z piezo.
- Todos os controladores de motor 4 galvo.
- Módulo de controle do laser primário.
- Módulo de controle do laser secundário.
- Todas as estações de trabalho da câmara.
- Workstation OMXIC.
- Na estação de trabalho do controlador mestre, abra o software OMX, clicando no ícone. Defina o caminho do arquivo para o salvamento de dados em uma pasta de dados apropriado.
- Para inicializar o hardware, vá para o menu Hardware, selecione Hardware e clique no botão Restart Hardware. Fechar a janela.
- Iniciar o softWoRx software.Turn nos lasers necessários para as experiências (488 nm).
- Ligue a chave de ignição para a trava de segurança laser.
- Garantir a gaveta filtro dicróico correto está inserido abaixo do objetivo. Para GFP, que é o padrão (ou fixado) de gaveta.
- Em OMX SF, vá ao menu Arquivo, selecione Configurações e selecione a gaveta fixa no menu suspenso gaveta. Fechar a janela.
- Faça o seguinte na tela principal do software, na seção Parâmetros de luz:
- Ative a câmera adequada para o laser de excitação e filtro de emissão (ITCF) câmera da seleção Channel.
- Verifique o modo de imagem está definido para Seqüencial.
- Verifique o caminho óptico é definido para SI.
- Verifique o Modo está definido para 95 MHz.
- Confira o laser 488 é selecionado na excitação.
- Defina o
- Na guia Experiência, garantir Tipo está definido para SI a partir do menu drop-down.
- Certifique-se de corte é ativado e que o espaçamento seção óptica é definida como 0,125.
- Certifique-se de ponto de foco quando iniciar a análise é do meio.
3. Image Acquisition
- Aplicar uma gota de óleo para o início do objectivo. Para 37 ° C, o óleo inicial recomendada tem um índice de refracção de 1,518 para melhor corresponder ao índice de refracção da camada de gel utilizado para a montagem das células bacterianas, a 37 ° C (veja passo 1.1.3).
- Coloque o prato de amostra Petri contendo as células preparadas para a inserção palco e cubra com a tampa de aquecimento circular. Baixar a platina até que o óleo atinge a parte inferior doa placa de Petri amostra.
- Colocar a placa de aquecer-se equilibrar durante 15 min na fase. Usando uma definição baixa exposição de 5 ms ou menos (localizado na seção Parâmetros de luz), o foco na amostra, utilizando os controles de posicionamento nano estágio (DZ, localizado na seção Nano Posicionamento). Concentre-se para baixo e através da amostra para determinar se a luz é espalhada de maneira uniforme acima e abaixo do plano focal da amostra. Se a função de dispersão não é mesmo (aberração esférica), limpar o fundo do prato de amostras e o objectivo com clorofórmio. Troque o óleo e repita esta etapa até que seja encontrada uma correspondência adequada entre o índice de refração do óleo e da amostra para minimizar a aberração esférica.
- Usando 0,5 um dZ tamanhos de passo, marcar a parte superior e na parte inferior da pilha de imagem. Volte para o meio da amostra. Clique no botão Obter Espessura na aba Experimente definir a espessura de aquisição de amostra. Keep a altura da pilha a um mínimo e tendo o cuidado para não cortar a parte superior e inferior dos Z-rings. As espessuras típicas para B. subtilis são amostras 2-3 ^ m.
- Determine o valor de intensidade máxima (Max) a imagem de amostra de com a exposição e% T configurações atuais. Este valor encontra-se abaixo da janela de imagem. Para imagens de lapso de tempo, ajustar a exposição e% T para obter uma intensidade máxima de 1.100-1.400 acima do fundo para a imagem. A intensidade mínima de 1,000 acima do fundo é necessária para obter a reconstrução da imagem. Imagem de um one-off para, aumentar a intensidade máxima de 4.000-5.000.
- Ative a seção Time-lapse na guia Experiência. Defina a taxa de quadros necessários e tempo total. No arquivo de dados, digite um nome de arquivo apropriado. Clique no botão Executar para iniciar a aquisição de imagem.
Nota: A aquisição de imagens é completa quando o gbar reen Progress está terminado e um arquivo de log é exibido para o conjunto de dados na pasta de dados apropriado.
4 Verificação da Qualidade de Dados
- No início da aquisição da imagem, observe o valor máximo de intensidade da imagem no início da aquisição da imagem para o primeiro quadro da série histórica. No final da aquisição do primeiro quadro, verificar que não foi mais do que uma diminuição de 10% na intensidade do sinal por meio do z-pilha para este primeiro quadro. Se houve mais do que este nível de fotodegradação no primeiro momento, os dados através da série de tempo vai ser de qualidade insuficiente para análise e aquisição vezes séries pode ser interrompido.
- No final da aquisição da série de tempo, abrir o ficheiro de imagem em bruto resultante com .dv sufixo e determinar a diminuição da intensidade máxima do sinal a partir do início da série tempo para a imagem final. Descarte qualquer momentos onde não tem a abelhan mais de 30% de fotodegradação.
5. imagens Reconstrução 3D-SIM
- No menu Processos, activar a janela do SI Reconstrução. Use as configurações pré-existentes para todos os parâmetros.
- Ative o botão OTF Específica Use Channel, e definido como o conjunto de filtro padrão. Ative o Específico Use Canal botão KO ângulos e definida como o conjunto de filtro padrão.
- Arraste e solte a matéria (.dv) arquivo para o espaço de arquivo de entrada. Clique Faça. O arquivo de saída terá o mesmo nome do arquivo de entrada com _SI adicionado no final.
Nota: Este processo de reconstrução pode ser executado como uma tarefa utilizando a função Task Builder no menu Processo se vários arquivos devem ser processados.
6 Exportação de Dados e Análise
- Use Imaris para visualizar imagens 3D no modo e ex superardados de imagem de porta como tiff (300 dpi) ou AVI (sem compressão). O tamanho do comprimento em Imaris pode ser realizado utilizando a ferramenta de medição no modo de ultrapassar.
- Gerando parcelas de intensidade 3D do anel Z a partir de dados de imagem 3D-SIM:
- Examinar a distribuição de FtsZ em torno do anel Z e para criar parcelas intensidade 3D
- Abra um arquivo de imagem 3D para visualizar os z-fatias individuais. Use a ferramenta visualizador de volume localizado na guia Vista menu para cortar uma região de interesse.
- Digite o número de janela para esta imagem 3D na janela de entrada e digite um novo e sem uso número janela para janela de saída. O botão select região ficará disponível para cortar um anel Z individual de interesse do campo da visão original de 40 × 40 m.
- Ajustar o eixo desejado e do grau de rotação na aba de rotação. Clique no botão fazê-lo. Percorrer o volume para se obter o desejado perspectiva do anel Z.
- Use a ferramenta Inspetor dados e ajuste tele dimensões de coluna / linha para criar uma nova região de interesse em torno de um anel Z individual. Clique no centro da imagem para posicionar esta nova região de interesse. Os dados da imagem de texto é uma tabela que mostra gerado automaticamente a intensidade de fluorescência de cada pixel no interior da região de interesse.
- Clique no botão 3D gráfico para visualizar inicialmente a trama intensidade.
- Em alternativa, os dados de imagem de texto pode ser exportado, clicando no botão salvar os dados da tabela no menu arquivo.
- Copie os dados de imagem do arquivo de texto salvos em um novo planilha. Selecione todas as células dentro da planilha e criar um novo gráfico 3D Surface. Formate o gráfico intensidade enredo 3D para publicação.
- Para dados time-lapse repita os passos 6.2.1.1 - 6.2.1.7 em cada um dos diferentes pontos de tempo a partir do arquivo de imagem 3D.
- Examinar a distribuição de FtsZ em torno do anel Z e para criar parcelas intensidade 3D
- Acompanhando Intensidade Média de fluorescência ao longo do tempo
- Use os dados de imagem de texto para acompanhar os fluoresce intensidade ao longo do tempo numa região de interesse.
- Escolha das células que correspondem à região de interesse.
- Calcula-se a intensidade média da fluorescência em cada ponto de tempo para esta região de interesse.
- Use os valores médios de intensidade da fluorescência para gerar um gráfico de linha em separado.
Representative Results
Neste estudo foi visualizada a proteína bacteriana divisão celular FtsZ, expressa em células vivas como uma fusão FtsZ-GFP, para ilustrar as vantagens de poderosos F3D-SIM através de microscopia de fluorescência convencional para estudar a localização da proteína bacteriana e dinâmica. FtsZ é uma proteína do citoesqueleto afim da tubulina polimeriza em que uma estrutura em anel dinâmico em torno da circunferência da célula. O anel Z tem uma função importante na divisão celular: a sua montagem marca o futuro local de divisão, recruta todas as proteínas de divisão celular a este site, e anel Z constrição parece fornecer a força para permitir o movimento para dentro do envelope celular durante a citocinese 17 , 18.
Quando visualizadas por microscopia de fluorescência de campo amplo convencional, o anel Z aparece como uma banda única transversal de fluorescência em bactérias em forma de bastonete, incluindo os organismos mais bem estudados tal como B. subtilis (Figura 2A), <em> E. coli, e C. crescentus. É importante notar que a intensidade de fluorescência ao longo desta faixa parece ser mais ou menos uniforme, e o padrão de localização oferece muito pouco conhecimento sobre a organização estrutural e de distribuição dos polímeros FtsZ dentro do anel Z. Quando as mesmas células são examinadas usando o método F3D-SIM descrito aqui (Figura 2B), no entanto, as vantagens desta técnica são imediatamente aparentes. Em primeiro lugar, a rotação da imagem 3D-SIM em torno do eixo z, permite a visualização do anel Z como uma estrutura de anel genuíno no espaço tridimensional (Figuras 2C e 3A). Juntamente com o aumento na resolução, isto revela que a distribuição de FtsZ no anel Z é, de facto, altamente heterogénea (Figura 3). A melhoria na resolução também permite-nos ver os anéis Z que já começaram o processo de constrição para formar um septo divisão (indicado pela invaginação da membrana celular em <strong> Figura 2C e 2D).
Exemplos adicionais de B. anéis Z subtilis visualizadas por esta técnica são mostrados na Figura 3Bi - 3Biv e ilustram como a intensidade de fluorescência em torno do anel Z nunca é a mesma. Além disso, as regiões de muito baixa intensidade de fluorescência são frequentemente observados. Referimo-nos a estas regiões como lacunas (setas brancas). Observamos essas lacunas em 15% de todos os anéis Z examinados (n = 84) e, predominantemente, em anéis Z com um diâmetro de 800-900 nm (93%). Para quantificar estas observações, as parcelas de intensidade 3D foram criados do anel Z e são mostrados na Figura 3CI e 3CII usando os anéis Z mostrados nas Figuras 3Biii e 3Biv. As parcelas de intensidade mostram que tipicamente a quantidade de fluorescência no anel Z pode variar até 3-4 vezes em diferentes regiões do B. anel Z subtilis. Além disso os lotes de intensidade 3D mostram que a gaps de fluorescência dentro do anel Z quase ler níveis basais de fluorescência de fundo (seta preta na figura 3CI). Estes exemplos acima mostram boas reconstruções do anel Z e são dependentes de luz suficiente ser emitida a partir da amostra sem fotobranqueamento significativa. Isto é conseguido através do brilho do fluoróforo de GFP fundida a FtsZ e sua abundância na célula sob estas condições (elevada relação sinal-ruído). Em outras células, onde a relação sinal-ruído é o baixo de reconstrução da imagem é pobre. Para simular esta ocorrência com FtsZ-GFP, a quantidade de sinal de emissão recolhidos a partir do B. células subtilis foi reduzida através da redução da energia de excitação. Tal como mostrado na Figura 3D, uma redução de 100 vezes de energia resulta na excitação de uma imagem do Z-anel que possui artefactos significativos. Isso ocorre como consequência de contraste local insuficiente entre o sinal FtsZ-GFP eo fundo levando a poor reconstrução da imagem.
Curiosamente, B. Z anéis subtilis mostrou lacunas mais pronunciados e heterogeneidade nas regiões superior e inferior do anel, mas não nos lados do anel (Figura 3B). Isto ocorre por causa da diferença de resolução conseguida por esta variação de 3D-SIM no plano lateral, em relação ao plano axial. Isto resulta nas regiões superior e inferior do anel Z (plano lateral) a ser trabalhada com a melhor resolução possível. As lacunas no anel Z são demasiado pequenos para serem detectados nos lados do anel Z tal como visualizado no plano axial, que tem cerca de metade da resolução da superfície lateral. As bactérias que têm uma morfologia cocoides, tais como S. aureus, tem anéis de Z, que se encontram posicionados em todos os planos. Então, imaginando o anel Z quando se situa no plano lateral (ou perto disso) fornece a capacidade de imagem todas as regiões do anel com ótima resolução. Aproveitando isso, examinamos a estrutura deo anel Z em directo de S. células aureus, utilizando-se uma estirpe que contém um uma fusão GFP-FtsZ rolamento plasmídeo. A produção desta fusão está sob o controlo de um promotor indutível SPAC P (ver o passo 1.2.1). Quando examinados por, no plano axial, S. Z anéis aureus apareceu idêntico a B. Z subtilis anéis que estão presentes no mesmo plano (figura 4AI). Contudo, os anéis de imagiologia Z no plano lateral confirmou que todo o anel Z apareceu tanto talão semelhante e heterogénea. Cerca de 26% destes anéis também mostraram, pelo menos, um "fosso" visíveis de fluorescência (Figura 4Aii, 4B). Semelhante a B. subtilis FtsZ, parcelas de intensidade de fluorescência mostram que a intensidade de fluorescência do anel Z varia tanto quanto 4-6 vezes em diferentes áreas do S. aureus anel Z (Figura 4C).
O comprimento e largura dos grânulos pode ser medida (Consulte Diagrama esquemático na Figura 4D). Isto mostrou que 80% dos anéis Z (n = 43) que foram examinados tinha um comprimento de 200 nm de talão, atingindo um comprimento máximo de 400 nm. A largura de grânulos, por outro lado, medido a 200 nm. Houve, em média, 12 ± 2 (SEM) contas FtsZ por anel Z. Localização de dados semelhante foi observado quando FtsZ nativa foi visualizado com esses métodos usando microscopia de imunofluorescência (IFM), mostrando que este padrão de localização heterogênea e cordão-como era genuína e não um artefato causado pela expressão de FtsZ-GFP, além de FtsZ nativa (dados não mostrada). Este avanço do 3D-SIM é capaz de mostrar que o anel Z aparece como uma estrutura heterogénea e é possivelmente descontínuo na natureza.
Para abordar a questão de como essa estrutura Z-ring heterogêneo sofre constrição e facilita a divisão celular, uma análise de time-lapse de Z dinâmica anel pode ser realizada. Um dos principais desafios commicroscopia de fluorescência estudos time-lapse é a minimização de fotodegradação e fototoxicidade amostra durante o exame. 3D-SIM exige um grande número de imagens em bruto a ser obtido, o que significa que a fotodegradação de uma amostra ao longo do tempo resulta numa proporção baixa de sinal-ruído do sinal que conduz à insuficiente para permitir a reconstrução da imagem apropriados. A aplicação da nova tecnologia minimiza a quantidade de energia utilizada para a excitação de cada exposição e, consequentemente, uma diminuição da energia de entrar nas células vivas. Ele faz isso através de uma combinação de interferometria de feixe de luz para criar o padrão de estrutura sobre a amostra e a utilização de câmaras científicos CMOS que podem aumentar a sensibilidade e eficiência quântica. Esta combinação resulta em aquisição z-pilha de 1 mM por segundo (512 × 512 pixels x 8 z fatias) em comparação com 1 mM por 5-8 segundos (512 x 512 pixels x 8 z fatias) obtido com a iteração anterior 3D-SIM (descrito em Riglar et 26 ai.).Diminuir o tempo de aquisição de imagem e ajustes de exposição também podem ajudar a minimizar fototoxicidade de células vivas que é particularmente relevante em estudos de lapso de tempo. A nova tecnologia apresentada aqui também aborda outro problema na geração de imagens ao vivo de células que nos referimos como "motion blur", que, neste contexto, refere-se à localização de proteínas mudança na aquisição da imagem. Ao diminuir o tempo de aquisição de imagem a quantidade de "motion blur" são minimizadas, criando assim uma reconstrução de imagem mais preciso.
Estudos anteriores que abordaram como FtsZ é organizada dentro do anel Z não ter sido capaz de mostrar como a estrutura do anel Z muda ao longo do tempo. Para investigar este aspecto realizamos time-lapse usando F3D-SIM. Esta aquisição permitiu à de uma imagem 3D-SIM do anel Z em B. subtilis cada 5-10 seg durante um período de 50 segundos, o que anteriormente não era possível nesta escala de tempo. Mostrado na Figura 5A é uma example das rápidas mudanças na distribuição FtsZ dentro do anel Z ao longo do tempo (diâmetro de 890 nm). Outros anéis Z que estavam visivelmente no processo de constrição também mostraram ter dinâmicas semelhantes que afectaram a distribuição de FtsZ em torno do anel Z (não mostrado). Parcelas intensidade 3D também pode ser gerado para cada um dos pontos de tempo para quantificar e valorizar as contínuas mudanças na intensidade de fluorescência e, assim, abundância relativa de FtsZ em diferentes regiões do anel Z sobre uma escala de tempo de segundos (Figura 5B). As regiões de interesse pode ser identificada a partir destas parcelas de intensidade para acompanhar as flutuações de intensidade de fluorescência (Figura 5C). O acompanhamento destas mudanças na estrutura do anel Z nessas condições seria praticamente impossível sem a tecnologia avançada F3D-SIM. Além disso, esse trabalho revelou que em S. aureus o movimento dinâmico de FtsZ é semelhante à observada em B. subtilis. S. células aureus RN4220 producing FtsZ-GFP foram fotografadas por 50 segundos a 10 intervalos de tempo sec. Alterações à heterogeneidade do anel Z em S. aureus com F3D-SIM também foram semelhantes para B. subtilis (ver setas e setas da figura 6). Estes estudos lapso de tempo apoiar um modelo de constrição anel Z (o modelo beliscar iterativo), que foi predito por meio de exame de C. fixo células crescentus, mas não podia ser demonstrada devido à necessidade de examinar dinâmica Z-ring 27 em células vivas.
Figura 1 Diagrama esquemático da configuração óptica do F3D-SIM utilizado neste estudo luz. Laser a partir da tabela de laser é dirigida através de uma fibra de um cartão SIM para lentes de colimação e fixa grade, em seguida, para o módulo de controlo de fase, que cria, tanto o comprimento de onda específico espaçamento ideal of ± as vigas de 1 a ordem do feixe central de ordem zero e as etapas da fase de recolha SIM. As vigas em seguida, insira o módulo de controle do ângulo em que os raios são refletidos para os três grupos diferentes para criar os três ângulos de iluminação. As vigas em seguida, entrar no microscópio e caminho da luz, como mostrado (Modificado com permissão de Paul Goodwin, API).
Figura 2 Comparação da fluorescência de campo amplo convencional e imagens 3D-SIM de B. As células que expressam subtilis FtsZ-GFP. (A) convencional de grande campo de imagem de fluorescência de B. As células que expressam subtilis FtsZ-GFP (SU570; verde) como uma única cópia, também foram coradas com o corante de membrana FM4-64 (vermelho). Barra de escala = 5 um. A imagem foi obtida através de um microscópio de fluorescência vertical.(B) imagem 3D-SIM do mesmo B. subtilis cepa expressar FtsZ-GFP, manchado com FM4-64. Regiões de interesse a partir da imagem pode ser selecionado (caixa tracejada) para ampliar. A imagem também pode ser girada em torno do eixo z para ver anéis FtsZ 3D no plano axial. (C, D) A remoção de fora-de- foco de luz e uma melhor resolução de imagem fornecidos pela 3D-SIM permite a visualização nítida dos anéis de Z (incluindo aqueles que estão contraindo) e da membrana celular interna durante a divisão (indicado por setas brancas). Note-se que o texto do protocolo descreve a visualização de uma única fluoróforo. No entanto, o procedimento pode ser adaptado para a aquisição de um máximo de quatro comprimentos de onda diferentes ao mesmo tempo. Este número foi reproduzido a partir de Strauss et al 16.
Figura 3. Imagens representativas do anel Z em forma de bastonete células bacterianas vivas (B. subtilis) expressando FtsZ-GFP usando o 3D-SIM. (Ai) O anel Z é observado como uma banda de fluorescência perpendicular ao eixo longitudinal da célula de que está no plano xy. (Aii) A imagem foi rodado em torno do z -axis usando software de visualização 3D Imaris (consulte protocolo passo 6.1), de modo que se está olhando através da estrutura do anel para ver claramente como FtsZ é distribuído dentro do anel Z. Esta imagem, agora no plano ZX mostra que o anel tem uma distribuição heterogênea de FtsZ com regiões de muito pouca ou nenhuma fluorescência (setas brancas). A imagem deve ser girada para observar essas regiões 'gap' de fluorescência. Bi-Biv mostrar mais exemplos de anéis Z girada que agora se encontram no plano ZX. Anéis em Z (bi-iii) têm um diâmetro de 0,9 um. ~ (Biv) mostra um anel Z com um diâmetro de only 0,65 uM constrição submetidos. (Ci) Este perfil típico intensidade 3D ilustra a intensidade da fluorescência (isto é, concentração) diferenças na FtsZ-GFP em torno do anel de Z tendo um diâmetro de 0,85 um (referem-se a passos de protocolo 6,1-6,3). O nível de fluorescência em estas lacunas é baixa e se aproxima de níveis de fluorescência de fundo (seta preta). (CII) Um perfil de intensidade semelhante 3D de um anel Z no processo de constrição. Concentração FtsZ-GFP é também não uniforme; diâmetro, 0,65 m. Painéis A, B, CI e Cii foram reimpressos de Strauss et al 16.
Figura 4 imagens Representante 3D-SIM de S. células aureus produzem FtsZ-GFP. Uma vez que estas células são arredondadas (cocos), o anel Z vai havenviar um e várias orientações. As células que mostram uma banda de fluorescência na orientação normal de visualização (isto é, no plano xy), como mostrado em (Ia), são muito semelhantes às de células em forma de bastonete quando girado em torno do eixo Z, como para a Figura 1AI. Em (Aii) o anel Z já está no plano xy; orientação e resolução lateral é máximo ao longo de todo o anel, que já apresenta uma estrutura de cordão de tipo (B). (C) Um gráfico de intensidade 3D da abundância relativa de FtsZ-GFP no anel Z (D). representação esquemática do S . aureus anel Z. As setas vermelhas indicam o comprimento de esferas e dimensões de largura (consulte o protocolo passo 6.1). Este valor foi modificado de Strauss et al 16.
<strong> Figura 5 F3D-SIM permite a análise rápida de FtsZ localização ao longo do tempo em 3D-SIM. (A) Mudanças na distribuição FtsZ-GFP dentro do anel Z em forma de bastonete B. subtilis células pode ser visualizado para indicar a dinâmica do anel. Tempo (seg) é indicado no canto superior esquerdo de cada imagem. (B) parcelas de intensidade de fluorescência em 3D mostrar a não uniforme e a distribuição dinâmica de FtsZ no anel Z. Dinâmica (C) FtsZ (FtsZ-GFP alterações de fluorescência na anel) também pode ser analisada em mais pormenor através da quantificação da intensidade de fluorescência ao longo do tempo, em duas regiões de interesse. Este número foi reproduzido a partir de Strauss et al 16.
Figura 6 F3D-SIM imagens de lapso de tempo mostram mudanças na FtsZ localização dentro do anel ao longo do tempo em S. umaUreus. uma seta branca indica um intervalo quando é inicialmente detectado no anel Z. O aparecimento ou desaparecimento de lacunas na mesma posição (como indicado pela seta branca) ao longo do tempo ilustra como FtsZ é redistribuído em torno do anel Z. As setas brancas indicam a formação de lacunas no anel Z em pontos de tempo posteriores. Tempo (seg) é mostrada no lado esquerdo superior das imagens. Este valor foi modificado de Strauss et al 16.
Discussion
Imagens ao vivo de células fluorescentes é uma ferramenta poderosa que permite a observação de mudanças dinâmicas no interior das células ao longo do tempo. Imagens ao vivo a biologia celular bacteriana tem sido difícil devido ao tamanho pequeno de células e redução da capacidade de as células bacterianas para suportar a exposição repetida à luz de excitação. F3D-SIM ampliou as ferramentas disponíveis para interrogar toda a biologia celular, mas é necessário para executar cuidadosamente esta técnica como artefatos podem ser introduzidas se mal aplicada. Há uma série de considerações importantes para o sucesso do uso dessa técnica. Como se trata de um grande campo método de imagem de fluorescência, que se baseia na utilização da função de dispersão de luz emitida a, incompatibilidade índice de refracção e aberração esférica da luz emitida deve ser evitado, para permitir a reconstrução da imagem exacta. A utilização de lamelas de 0,17 mm de espessura de uma alta qualidade, para evitar a variação de intensidade de sinal, devido à variabilidade de espessura de vidro nas tampaslabial é altamente recomendado. É extremamente importante avaliar cuidadosamente a aberração esférica da luz emitida durante os estágios iniciais de todas as experiências e ajustar a imersão índice de refração do óleo, conforme necessário. Isto pode variar de dia-a-dia, uma vez que é dependente tanto da temperatura e a montagem de meios de comunicação / substrato da amostra. A utilização do óleo incorrecto resultará na reconstrução das imagens inferiores com artefactos, tais como halos e sinais de eco.
No final do processo de reconstrução de imagem, para cada fase de uma medida da qualidade da reconstrução podem ser obtidas pela "melhor ajuste do ângulo de kO" para cada fase / ângulo de iluminação. Se este valor for inferior a 1, para cada ângulo, então a qualidade do reconstruída será provavelmente elevado. Se este valor for acima de 6, o mais provável é que a imagem reconstruída conterá artefactos. Artefactos comuns incluem: i) o aparecimento de riscas na imagem que correspondema um dos ângulos da grade. Isto pode resultar de sinal mais baixo de que ângulo de grade; ii) haloing em torno das estruturas. Isto pode resultar de níveis muito desiguais de sinal a partir de estruturas brilhantes, em comparação com as estruturas envolventes, um desfasamento entre o índice de refracção do óleo e da amostra, ou pode ser devido às estruturas na imagem a ser demasiado amorfo e não contendo "estrutura" suficiente para ser reconhecido pelo algoritmo; iii) «favo de mel», que resulta a partir de um sinal de baixa-ruído na imagem, em geral, devido ao sinal de fundo elevado; iv) as estruturas que são esticadas / xy alongados em que pode ser devido a incompatibilidade de refracção índice de óleo e de amostra. Este artefato é difícil discernir para um usuário inexperiente. Recomenda-se que os novos usuários consultar um pesquisador SIM experiente para aconselhamento sobre a interpretação e análise de imagem quando começar a usar esta técnica.
Tal como acontece com todas as experiências de imagem ao vivo de células fluorescentes, isto é importaçãoformiga para equilibrar cuidadosamente a entrada de energia de excitação, a fim de minimizar o grau de fotodegradação e fototoxicidade das células com sinal de emissão suficientes necessárias para reconstruir imagens com artefacto mínima. Fotobranqueamento excessivo (superior a 30% através de uma única pilha de aquisição z) vai levar a um padrão de listras na imagem reconstruída. Com o uso de câmeras scmos, imagens de super-resolução pode ser reconstruído com sucesso a partir de imagens brutas com sinal de emissão tão baixo como 1.000 contagens acima do fundo. Isto pode permitir que os tempos de exposição muito curto reduzindo assim fotobranqueamento e permitindo a captura rápida para cada quadro. Além disso, aumenta a quantidade de tempo entre os quadros para as células para se recuperar a partir do fornecimento de energia de excitação. Além disso, como o tempo de captura para cada quadro individual pode ser muito curto, o grau de artefacto introduzido por «motion blur 'durante uma captura indivíduo é reduzida com a utilização do presente método.
Esta varição de 3D-SIM oferece uma série de outras vantagens sobre outras tecnologias super disponíveis e imagens de alta resolução para imagens ao vivo por biólogos de células bacterianas. O aumento de 2 vezes na resolução de todas as três dimensões e a capacidade de imagem superior a 30 um para uma amostra permite a imagiologia de células bacterianas (e mamíferos) integrais durante uma experiência. Técnicas como a localização de uma única molécula que são habitualmente desempenhadas na onda evanescente pode não conseguir a profundidade de penetração e uma amostra não oferecem informação sobre as células inteiras. Os recentes avanços que permitem a profundidades superiores de amostragem para esta técnica pode resultar em melhor resolução axial de células inteiras. Além disso, as técnicas de localização de moléculas individuais que exigem milhares de imagens em bruto a ser adquiridos também são limitadas na taxa de quadros que podem ser capturadas e pode exigir compromisso entre a taxa de captura de quadro e resolução espacial alcançado final, como a resolução espacial depende da número de vésperants gravadas dentro de um espaço definido. Diminuir o número de quadros capturados vão resultar em uma resolução espacial mais baixa, mas pode ser suficiente para se conseguir a resolução temporal necessária para o processo biológico de interesse. A quantidade de tempo de recuperação entre quadros também podem precisar de ser aumentada para minimizar a fototoxicidade em células vivas, limitando assim a duração e frequência em que o tempo-série pode ser obtido. Técnicas de alta resolução, como a microscopia eletrônica (ME) ou elétron cryotomography (ECT) oferecem uma maior resolução sobre 3D-SIM (e outras técnicas de microscopia óptica de super-resolução), mas devem ser realizados em amostras fixas. A fixação e processamento pode introduzir artefatos ea falta de rotulagem pode tornar difícil interpretação. Livre de marcador a ECT tem um contraste fraco e pode atingir profundidades de penetração da amostra de cerca de 500-200 nm, 24, de modo que, mesmo que a proteína de interesse pode ser identificada, a estrutura da proteína de uma célula bacteriana todo, não pode ser observado.Mesmo quando etiquetagem pode ser utilizado na EM, tais como com imuno, a formação de imagens é realizada apenas em 2D. 3D só é possível com o corte fino e reconstrução computacional das seções. O corte fino requer um técnico experiente, mas pode ser problemático e levar ao artefato. Com células vivas ou fixas, 3D-SIM não precisa ser incorporado de uma forma específica e as células podem ser preparadas rapidamente para imagens em um estado próximo natal.
Este método é relativamente fácil de implementar por pesquisadores com experiência mínima em microscopia de fluorescência. As experiências podem ser realizadas em meios que suportem a função de célula saudável, enquanto não apresentam fluorescência ou gerar o sinal de fundo indevida. Para as células bacterianas, isto pode permitir o uso de diversos tipos de complexo e meios mínimos ou o uso de meios sólidos ou semi-sólidos para controlar a motilidade celular bacteriana. Muitos biólogos que já projetadas proteína fluorescente (FP) fusões e testado a funcionalidade doestas fusões podem ocupar essa tecnologia rapidamente, sem mais engenharia e validação de novas fusões PF fotoactiv�eis. Encontramos, como observação geral, que S. aureus foi mais suscetível à fotodegradação durante o exame com fusões PF que B. subtilis. Usando nossos métodos 3D-SIM original, onde o padrão de grade foi gerada por uma grade física, não fomos capazes de realizar imagens de células vivas com um número de S. fusões aureus PF. No entanto, com este método avançado F3D-SIM, fomos capazes de imagem estas fusões PF e realizar séries de tempo curto para capturar a dinâmica destas proteínas marcadas. Este é, provavelmente, devido aos tempos de exposição reduzidos necessários para a imagem latente e aumento do tempo entre os quadros para a recuperação das células.
OMX chama 3D-SIM é uma tecnologia disponível no mercado que pode ser relativamente fácil de implementar em um único laboratório ou uma instalação de imagem do núcleo. Cuidados devem ser tomados para realizar a técnica para evitar artifatos, devido à má preparação da amostra ou pobre de captura de imagem. Uma vez que a técnica é dominada, estudos sobre a estrutura da proteína e dinâmica em pequenos organismos, tais como bactérias pode ser realizada na fluorescência único ou multi-cor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose I (Biotecnology grade) | AMRESCO | 0710-500G | Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media. |
| N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 4-64) | Life Technologies | T-13320 | Lipophylic dye used for staining cell membranes. |
| 1.5 ml microtube, graduated Natural | Scientific specialties Inc. | 1210-00 | Made from Homopolymer polypropylene, used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization. |
| Luria broth base, Miller | BD | 241420 | Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2% agarose after autoclaving. |
| BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3 | BD | 210932 | Prepared according to manufacturer's instructions. |
| Adhesive frame | Thermo-Fisher Scientific | ABGAB-0577 | Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15 x 16 mm). |
| Microscope cover glass | Thermo-Fisher Scientific | 111512-9 | 22 x 22 No. 1 Thickness |
| 35 mm diameter Petri dish with a glass coverslip bottom | World precision instruments | FD35-100 | Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35 mm, Glass: Ø 23 mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol. |
| Lincomycin hydrochloride | Sigma | L6004-5MU | Make a 25 mg/ml stock in 50% ethanol. |
| Erythromycin | Boehringer Mannheim GmbH | 12390120-14 | Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol. |
| Combined orbital/linear shaking waterbath | Grant scientific Instruments | OLS-200 | Shaking speed used for cultures: 215 rpm |
| UV visible spectrophotometer | Shimadzu | UV-1601 | 600 nm wavelength was used for measuring optical density of bacterial cultures. |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Pellets of bacterial culture were obtained by spinning down mid exponentially growing cultures at 8,000 rpm for 30 sec. |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma | 15502-10G | Prepare 1 M stock and filter sterilize prior to use. |
| softWoRx software | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | version 5.0 | |
| Imaris data analysis software | Bitplane Scientific Software, Bitplane AG | version 7.0.0 | Matlab XTensions included |
| DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module. | Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company | Blaze module fitted on OMX V3 | |
| Upright fluorescence microscope | Zeiss Axioplan 2 |
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