Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Abstract

Abbildung biologischer Proben mittels Fluoreszenzmikroskopie im Wesentlichen mit den neuen Technologien, um die Auflösung Barriere der Beugung von Licht ab, das Super-Auflösung von Lebendproben zu überwinden fortgeschritten. Derzeit gibt es drei Haupttypen von Super-Resolution-Technik - stimulated emission depletion (STED), Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (einschließlich Techniken wie PALM, STORM und GDSIM) und Structured Illumination Microscopy (SIM). Während STED und Einzelmolekültechniken Lokalisation zeigen die größten Zuwächse in der Auflösung, wurden sie langsamer zu erhöhten Geschwindigkeiten der Bildaufnahme zu bieten. Dreidimensionale SIM (3D-SIM) eine Weitfeldfluoreszenzmikroskopie Technik, die eine Reihe von Vorteilen sowohl Einzelmoleküllokalisierung und STED bietet. Auflösung verbessert, wobei typische laterale und axiale Auflösungen von 110 und 280 nm und die Tiefe der Probennahme von bis zu 30 um aus dem Deckglas, so dass fürAbbildung der ganzen Zellen. Jüngste Fortschritte (schnelle 3D-SIM) in der Technologie die Erhöhung der Aufnahmerate von RAW-Bilder ermöglicht die schnelle Erfassung von biologischen Prozessen in Sekunden auftritt, während Foto-Toxizität und Ausbleichen deutlich zu reduzieren. Hier beschreiben wir die Verwendung eines solchen Verfahrens zur Bild bakteriellen Zellen, die das fluoreszenzmarkierte zytokinetischen FtsZ Protein zu zeigen, wie Zellen analysiert und die Art der eindeutigen Information, dass diese Technik kann.

Introduction

Eine Anzahl von verschiedenen bildgebenden Verfahren über die Jahre verwendet worden, um Bakterien, einschließlich verschiedener Elektronen und optische Mikroskopie-Techniken zu untersuchen. Während der Elektronenmikroskopie bietet eine extrem hohe Auflösung, bis in den Nano, die Notwendigkeit für Vakuum und Verwendung von Kontrastmitteln hat diese Technik, um feste und eingebetteten Proben beschränkt. Artefakte können auch auf langwierige Probenvorbereitung und ein Fachmann benötigt wird, um die Proben vorzubereiten und zu analysieren und zu interpretieren, die daraus resultierenden Bilder eingeführt werden. Lichtmikroskopie bietet die Vorteile einfacher Probenvorbereitung und die Anwendung mehrerer Etiketten relativ einfach im Vergleich mit der Elektronenmikroskopie. Verwendung von fluoreszierenden Proteinen und Farbstoff-Konjugate, die Fähigkeit, lebende Zellen mit Fluoreszenzmikroskopie zu studieren, ist ebenfalls möglich. Mit Verbesserungen in der Stabilität und Fluorophor fluoreszierende Protein Größe /-Struktur, die in Kameraerkennung techn verringerte Zelltoxizität sowie Fortschritteologie, Fluoreszenzmikroskopie mit Weitfeld-und konfokalen Imaging-Systeme hat unser Verständnis der räumlichen Dynamik der Zellen deutlich erweitert. Mit Hilfe dieser Techniken hat sich unser Wissen über die Bakterienzelle über den letzten 20 Jahren erheblich an eine weit detailliertere Ansicht, die einen hohen Grad an struktureller Organisation und Protein in der bakteriellen Zelle ¹ zeigt fortgeschritten.

Herkömmliche Methoden der optischen Mikroskopie sind jedoch beugungsbegrenzt, so dass die inhärente Auflösung ist etwa die Hälfte der Wellenlänge des Anregungslichts verwendet wird. Folglich, auch mit der optimalen herkömmlichen optischen Mikroskopiesystem, ist die beste laterale Auflösung zu 220-250 nm und die axiale Auflösung ist etwa 500 nm (für eine Übersicht siehe Schermelleh et al. ^2). Für die bakterielle Zellbiologen insbesondere, das immer noch stark begrenzt unser Verständnis der räumlichen Organisation dieser winzigen Zellen; wobei nur 1-2 um in diameter und 1-10 um in der Länge. Es besteht auch die Notwendigkeit einer höheren Auflösung Techniken, die von lebenden Zellen in dem dynamischen räumlichen Verhalten eines Proteins analysiert werden, um in vitro Daten zu ergänzen ausgeführt werden können.

In den vergangenen zehn Jahren haben mehrere Super-Resolution-Fluoreszenz-Imaging-Techniken entwickelt. Superauflösungsmikroskopie beschreibt Bildgebungstechniken, die mindestens das Doppelte der lateralen Auflösung, erhältlich mit konventionellen Lichtmikroskopie, die Beugungsgrenze dadurch überwinden. Diese Techniken manipulieren die Beleuchtung und / oder Analyse des emittierten Lichts in Echt steigt in der scheinbaren Auflösung erstellen. Derzeit gibt es drei Haupttypen von Super-Resolution-Techniken - i) stimulierte Emission Mikroskopie ³ (STED); ii) Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie, einschließlich Techniken wie Photolokalisationsmikroskopie ^4,5 (PALM), stochastische optische Mikroskopie Wiederaufbau 7 (dSTORM) und Grundzustand Erschöpfung mit einzelnen Moleküls Rück ⁸ (GDSIM); und iii) Structured Illumination Microscopy ^9-12 (SIM). Einzelmolekül-Lokalisierung Techniken bieten die größten Zuwächse in lateraler Auflösung bis auf zwischen 10-40 nm in biologischen Proben. In vielen Implementierungen von Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie ist Entnahmetiefe an der abklingenden Welle begrenzt und die ersten Implementierungen der STED wurden auch in der Probentiefe begrenzt. Die jüngsten Fortschritte, wie die Verwendung von adaptiven Optik Ausnutzung des Astigmatismus in der Punktverteilungsfunktion an verschiedenen Brennpunkten, Mehrebenen-Detektion und Verwendung von zwei Zielen, die axiale Position des emittierten Lichts abzuleiten gesehen Verbesserungen sowohl in axialer Auflösung und Sampling-Tiefen in beiden STED und Einzelmolekül-Lokalisierung ^13,14. Datenerfassungsraten für STED und Einzelmolekültechniken Lokalisierungsind auch relativ langsam aufgrund der großen Anzahl von Bildern, die für die maximale Auflösung (zur Lokalisierung Techniken bis 50.000) erhalten werden müssen. Diese langsame Datenerfassung beschränkt sich nicht auf die Abbildung von Lebendproben zu verleihen, ohne kundenspezifische Modifikationen, die oft sehr teuer sind. Diese beiden Techniken sind derzeit optimal für feste Proben geeignet (für eine Übersicht siehe ^2,15), jedoch viel Arbeit getan wird, um diese Einschränkung zu beheben.

Dreidimensionale Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) ist ein Weitfeld-Technik, die sowohl laterale und axiale Auflösung, was zu einer Auflösung von etwa 110 und 280 nm bzw. verbessert. Entnahmetiefe beträgt bis zu 30 um aus dem Deckglas, so dass für die Bildgebung von ganzen Zellen. Die Variation der 3D-SIM durch Sedat, Agard und Gustaffsson auf dem optischen Mikroskop eXperimental (OMX) Plattform entwickelt umfasst Beleuchten der Probe mit einer bekannten Gitterstruktur, die in 15 verschiedenen verschobenPositionen in jeder z-Ebene ^9-11. Die Streifen in der resultierenden Moiré-Muster, die in den Frequenzraum außerhalb des beobachtbaren Bereichs erzeugt werden, werden gemessen. Die Informationen aus dem Frequenzraum rechnerisch rekonstruiert, um ein sichtbares Superauflösungsbild ^10,11 erzeugen. Die relative Geschwindigkeit, mit der die Ausgangsbilder können unter Verwendung dieser Technik erfaßt werden können Bildgebung von lebenden Zellen. Es ist jedoch zu beachten, dass für biologische Prozesse auf einer Zeitskala von Sekunden erfolgt, ist die Erfassungsrate der RAW-Bilder immer noch zu langsam, um dynamische Änderungen zu erfassen. Für Zeitreihen mit einer Erfassungsrate von Sekunden kann der Erwerb wiederholt ohne ausreichende Erholungszeit zu Phototoxizität und Photobleaching vor allem bei Live-Darstellung von kleinen Bakterienzellen führen.

Um diese Probleme zu überwinden, haben die jüngsten Fortschritte für schnelle 3D-SIM-Karte (SIM-F3D) entwickelt. Hier beschreiben wir eine als OMX Blaze ^16, dass ich bekanntEnde 2011 ntroduced Diese Technik schafft die strukturierte Beleuchtung ohne die Verwendung eines physikalischen Raster als in früheren Systemen. Die Verwendung von störenden Lichtstrahlen und neue Shutter-Technologie ermöglicht die Erstellung des strukturierten Licht auf die Probe in einem sehr schnellen Mode. Die Geschwindigkeit der Bildaufnahme wurde mit der Einführung von wissenschaftlichen komplementären Metall-Oxid-Halbleiter (sCMOS Kameras) verbessert, insbesondere im Vergleich zu den bestehenden EMCCD Kameras. Diese Änderungen führten zu einer möglichen Bildaufnahmerate von einem Bild pro Sekunde für eine Probentiefe von 1 um (512 x 512 Pixel, 9 z-Scheiben), so dass die Überwachung der dynamischen Veränderungen in den Zellen, die innerhalb von Sekunden ¹⁶ auftreten. Die Abnahme der scheinbaren Belichtung (Anregung) mal Zellen unter Verwendung dieser Methode können entweder längeren Zeitreihe erfasst werden oder eine Erhöhung der Aufnahmerate zu leben.

Die Anwendung der SIM-Mikroskopie-F3D beschreiben wir examine die Struktur und die dynamische Bewegung des zytokinetischen Z-Ring in den Zellen von zwei Bakterienarten: der stabförmigen Modellorganismus Bacillus subtilis und der kokkoiden menschlichen Erreger Staphylococcus aureus. FtsZ ist ein Tubulin-Zytoskelett wie Protein, das eine Schlüsselrolle bei der Zellteilung in Bakterien ^17,18 spielt. Es lokalisiert auf den Geschäftsbereich Website mindestens 20 anderen Sparte Proteine ​​rekrutieren, bilden die Teilung Gerät ^17,18, und wird angenommen, dass die Kraft für die Zell Verengung ^19-23 bieten. Diese Methode zeigt, dass FtsZ heterogen um die Z-Ring in beiden Organismen in einer sickenartigen Anordnung verteilt sind; Lösen des lang gehegten Frage, ob der Z-Ring ist eine kontinuierliche gleichförmige Band um die Zelle durch herkömmliche Weitfeldfluoreszenzmikroskopie oder eine diskontinuierliche Struktur visualisiert durch Elektronen Kryo-Tomographie (ECT) ²⁴ vorgeschlagen. Wir zeigen, wie die Fähigkeit der 3D-SIM können erheblich verbessern räumliche Prüfung von winzigen (1Mikrometer Durchmesser) Rundzellen wie S. aureus, die in drei aufeinander folgenden senkrechten Ebenen (x, y, z) teilen. Zeitraffer-Studien mit diesen Techniken zeigen, dass die Struktur der Z-Ring ist dynamisch, mit einem Brutto Organisation Veränderungen innerhalb des Rings, anstatt FtsZ-Moleküle, die in und aus einem festen Gerüst ^24.

Protocol

1. Probenvorbereitung

1. Herstellung von B. subtilis-Zellen für Imaging
   1. Impfen 10 ml Penassay Broth (PAB, auch als Antibiotika Medium 3 bekannt) mit einer Einzelkolonie von B. subtilis-Stamm SU570 (168 trpC2 ftsZ :: ftsZ-GFP-spec) ^16. Wachsen über Nacht in einem geringen Geschwindigkeit (100 UpM) Schüttler bei 30 ° C.
   2. Verdünnen Sie die Nacht-Kultur zu 0,05 A ₆₀₀ (Absorption bei 600 nm) in frischem PAB bei 30 ° C mit hoher Geschwindigkeit (215 rpm) schüttelt und wachsen bis mittleren exponentiellen Phase (A ₆₀₀ ~ 0.4).
   3. 2 g Elektrophorese-Grade Agarose in 100 ml 1x Wachstumsmedium (PAB) in einem Schraubverschluss Glasflasche. Lösen Sie die Agarose durch Autoklavieren. Dies kann bei 4 ° C für einige Monate gelagert werden, und in der Mikrowelle, um die Agarose zu schmelzen, wenn erforderlich. Bei Raumtemperatur einstellen.
   4. Bringen Sie einen Kleberahmen (65 ul Kapazität, siehe Tabelle der Materialien) auf einem Standard-glass Objektträger. Um dies zu tun, entfernen Sie die dünne Polyesterfolie (jede Kleberahmen zwischen zwei Polyesterfolien, eins dünn und eins stark positioniert und hat die Mitte Platz entfernt) und wenden die freigelegte Klebefläche des Rahmens auf der Oberfläche der Objektträger. Dadurch entsteht eine quadratische gut auf der Folie. Lassen die dicke Polyesterfolie mit dem Rahmen befestigt ist, wie dies die Deck klebt es in den nachfolgenden Schritten zu vermeiden.
   5. Schmelzen Sie die Agarose-Lösung in einer Mikrowelle zum Kochen und Pipette 67 ul in die Kleberahmen. Sofort platzieren Ein Deckglas, um eine ebene Fläche zu schaffen und bei Raumtemperatur für 5-10 min. Entfernen Sie das Deckglas für 1-2 min, während die Probe geerntet.
   6. Ernte eine 1 ml-Aliquot der Probe und Zentrifuge bei 5.900 × g für 30 sek. Dekantiert und das Pellet in 200 ul frisch PAB.
   7. Nehmen Sie 2,5 ul der konzentrierten Probe und Pipette auf eine vorge preparot Agarose-Pad. Verteilen Sie die Probe gleichmäßig entlang der flachen Oberfläche der Agarose-Pad. Entfernen Sie die Kleberahmen aus der Objektträger mit einer Pinzette die zwar nicht die Agarose-Pad zu berühren.
   8. Übertragen Sie die Agarose-Pad aus dem Objektträger zu einem Durchmesser von 35 mm Petrischale mit einem Deckglas unten. Invertieren die Agarose-Pad, so daß die Zellsuspension und Deck der Petrischale in direktem Kontakt miteinander. Der Boden der Petrischale hat einen Brechungsindex von 1,525 für eine hochauflösende Abbildung.
2. Vorbereitung von Live S. aureus Zellen für Imaging
   1. Beimpfen von 10 ml L-Medium mit einer Einzelkolonie von S. aureus-Stamm SA94 (SH1000 enthält Pflug-FtsZ-GFP und pGL485; Erm ^r, Cm ^{r) 25.} Wachsen über Nacht in einem geringen Geschwindigkeit (100 UpM) Rotationsschüttler bei 37 ° C aufweist.
   2. Verdünnen Sie die Nacht-Kultur zu 0,05 A ₆₀₀ (Absorption bei 600 nm) in frischem LB-Medium mit 0,05 mM IPTG (isoPropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid) zur Produktion des Fusionsproteins zu induzieren.
   3. Bei 37 ° C mit hoher Geschwindigkeit (215 rpm) schüttelt und wachsen bis mittleren exponentiellen Phase (A ₆₀₀ ~ 0.4).
   4. Führen Sie die Schritte 1.1.3 - 1.1.8 für B beschrieben subtilis Lebendzell-Vorbereitung.
      Hinweis: Fügen Sie die entsprechende Konzentration der Induktor an die Agarose-Lösung in Schritt 1.1.3 für die Stämme, die ein fluoreszierendes Fusionsprotein unter Kontrolle induzierbaren auszudrücken.

2. Herstellung des Mikroskop

Diese Methode verwendet eine Deltavision OMX (Optical Microscope, experimenteller) 3D-SIM-Bildgebungssystem mit einem Blaze-Modul ausgestattet. Für die beschriebenen Experimente sind nur ein Laser und eine Kamera verwendet wird. Die Beleuchtung und Lichtpfad sind in Abbildung 1 beschrieben. Dieses Verfahren setzt voraus, dass das Mikroskop entsprechender Kalibrierung optischen Übertragungsfunktion (OTF)Dateien und Licht Kollimation Wartung durchgeführt wird.

1. Für Live Cell Imaging Experimente sicher, dass der Erwärmungsphase auf die Keramik der Bühne und dem Ziel-Heizung Halsband befestigt ist, ist mit dem Ziel, (60X 1,42 NA Öl-Objektiv) befestigt ist.
2. Schalten Sie den objektiven und Bühnen Heizungen mindestens 4 Stunden vor der Bildgebung und langsam Rampe die Temperatur auf die gewünschte Einstellung mit einer maximalen Rate von 5 ° C / h. Es wird empfohlen, diesen Prozess der Abend vor der Bildgebung zu starten und Rampe bei 3 ° C / 4 h. Für Lebendzellexperimente mit B. subtilis, sind die meisten Versuche bei 30 ° C durchgeführt. Für S. aureus sind alle Experimente bei 37 ° C durchgeführt.
3. Am Tag des Experiments Einschalten des Systems mindestens 1 Stunde vor der Bildgebung zu erlauben, das System und Laser vollständig zu stabilisieren. Laden Sie die kleinen Teller Tischeinsatz auf die Bühne, um erhitzte vorzuwärmen.
   1. Schalten Sie den Master-Controller-Workstation.
   2. Einschalten des Bildverarbeitungs workstation.
   3. Schalten Sie die Kamera-Kühler auf dem Boden außerhalb des Mikroskop-Gehäuses.
   4. Schalten Sie alle sCMOS Kameras (auch wenn sie nicht alle verwendet werden).
   5. Innerhalb des Laser-und Elektronikgehäuse, schalten Sie:
      1. Instrument-Controller-Chassis.
      2. Nanomotion-Chassis.
      3. Jena-Controller für Piezo-Z.
      4. Alle 4 Galvo Motorsteuerungen.
      5. Primären Lasersteuermodul.
      6. Sekundärlasersteuermodul.
      7. Alle Kamera-Workstations.
      8. OMXIC Workstation.
   6. Auf dem Master-Controller Workstation, öffnen Sie die OMX-Software, indem Sie auf das Symbol. Stellen Sie den Dateipfad für die Datensicherung auf einen geeigneten Datenordner.
   7. , Um die Hardware zu initialisieren, gehen Sie auf die Hardware-Menü wählen Sie Hardware und klicken Sie auf die Schaltfläche Neu starten Hardware. Fenster schließen.
   8. Starten des SoftWorX software.Turn auf den für die Versuche benötigten Laser (488 nm).
   9. Schalten Sie den Schlüsselschalter für die Lasersicherheitsverriegelung.
   10. Stellen Sie sicher, die richtige dichroitischen Filterschublade unter dem Ziel eingelegt. Für GFP, ist es die Norm (oder feste) Schublade.
   11. In OMX SF, gehen Sie zum Menü Datei, wählen Sie Einstellungen und wählen Sie die Fest Schublade aus der Schublade Dropdown-Menü. Fenster schließen.
   12. Führen Sie die folgenden aus dem Hauptbildschirm der Software, in der Lichtparameter Schnitt:
       1. Aktivieren Sie die entsprechende Kamera für den Anregungslaser und Emissionsfilter (FITC) Kamera von der Kanal-Auswahl.
       2. Überprüfen Sie den Bildmodus auf Sequential gesetzt.
       3. Überprüfen der Lichtpfad zu SI eingestellt.
       4. Überprüfen Sie den Modus auf 95 MHz eingestellt.
       5. Prüfen Sie die 488 Lasererregung ausgewählt.
       6. Stellen Sie die 512 x 512 für die Fenstergröße und Binning auf 1 x 1.
   13. In der Registerkarte Experiment, sicherzustellen, Typ aus dem Dropdown-Menü auf SI eingestellt.
   14. Stellen Sie sicher, Schnitte aktiviert und dass die optische Abschnitt Abstand auf 0,125 eingestellt.
   15. Stellen Sie sicher, Fokus Punkt, wenn Scan startet ist Mitte.

3. Image Acquisition

1. Geben Sie einen Tropfen Öl an die Spitze des Objektivs. 37 ° C, hat die empfohlene Anfangs Öl einen Brechungsindex von 1,518 am besten passen den Brechungsindex des Gel-Polster verwendet, um die Bakterienzellen zu montieren bei 37 ° C (siehe Schritt 1.1.3).
2. Legen Sie die Probe Petrischale die vorbereiteten Zellen, die in die Stufe Einsatz und decken mit der kreisförmigen Deckel Heizung. Senken Sie die Bühne, bis das Öl den Boden berührtdie Probe Petrischale.
3. Anschließend wird die Schale erwärmt äquilibrieren für 15 min in der Phase. Verwendung einer niedrigen Belichtungseinstellung von 5 ms oder weniger (in der Lichtparameter Abschnitt befindet), konzentrieren sich auf die Probe mit Hilfe der Nanopositionierung Bühne Kontrollen (dz in der Nano Positioning Abschnitt befindet). Konzentrieren Sie sich auf und ab durch die Probe, um zu bestimmen, wenn das Licht gleichmäßig über und unter der Probe Brennebene zu verbreiten. Wenn die Punktbildfunktion ist noch nicht einmal (sphärische Aberration), reinigen Sie den Boden des Probenschale und das Ziel mit Chloroform. Öl wechseln und diesen Schritt wiederholen, bis eine geeignete Übereinstimmung zwischen der Öl-und Probenbrechungsindex gefunden, die sphärische Aberration zu minimieren.
4. Mit 0,5 um dZ Schrittgrößen, markieren Sie den oberen und unteren Rand des Bildstapels. Zurück in die Mitte der Probe. Klicken Sie auf die Schaltfläche Get Stärke in der Registerkarte Experiment, um die Probe Erwerb Dicke eingestellt. Keep die Stapelhöhe auf ein Minimum, während man aufpassen, um nicht schneiden Sie die oberen und unteren Ende der Z-Ringe. Typische Dicken für B. subtilis Proben 2-3 um.
5. Bestimmen Sie den maximalen Intensitätswert (Max) der Probe Bild mit der aktuellen Belichtung und% T-Einstellungen. Dieser Wert wird unter dem Bildfenster gefunden. Für Zeitraffer-Bildgebung, die die Belichtung eingestellt und% T, um eine maximale Intensität von 1,100-1,400 oben Hintergrund für das Bild zu erhalten. Eine Mindeststärke von 1.000 über dem Hintergrund notwendig ist, um die Bildrekonstruktion zu erhalten. Für eine einmalige Bild, erhöhen Sie die maximale Intensität zu 4000-5000.
6. Aktivieren Sie die Zeitraffer-Abschnitt in der Registerkarte Experiment. Stellen Sie die gewünschte Bildrate und Gesamtzeit. In Datendatei, geben Sie einen entsprechenden Dateinamen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Bildaufnahme zu beginnen.
   Hinweis: Bildaufnahme abgeschlossen ist, wenn die gReen Fortschrittsbalken fertig ist und eine Log-Datei für die Daten in den entsprechenden Datenordner gesetzt erscheint.

4. Überprüfung der Datenqualität

1. Zu Beginn der Bildaufnahme, beträgt die maximale Intensitätswert des Bildes am Anfang der Bildaufnahme für den ersten Rahmen der Zeitreihe. Am Ende der Erfassung des ersten Rahmens zu überprüfen, dass es nicht mehr als eine 10% ige Abnahme der Signalintensität durch die z-Stack für diesen ersten Rahmen ist. Wenn es mehr gewesen, als dieser Ebene der Photobleaching in dem ersten Zeitpunkt, werden die Daten durch die Zeitreihen von unzureichender Qualität für die Analyse und die Zeitreihen Nahme gestoppt werden kann.
2. Am Ende der Übernahme der Zeitreihe, öffnen Sie die resultierende RAW-Bilddatei mit .DV Suffix und festzustellen, die Abnahme der maximalen Signalintensität von Anfang der Zeitreihe auf dem endgültigen Bild. Entsorgen Sie alle Zeitpunkte, wo es hat Bienen mehr als 30% Ausbleichen.

5. Rekonstruktion 3D-SIM-Bilder

1. Von der Prozess-Menü, aktivieren Sie die SI Wiederaufbau Fenster. Mit den bereits bestehenden Einstellungen für alle Parameter.
2. Aktivieren Sie die Kanalspezifische OTF-Taste, und mit dem Standard-Filtersatz. Aktivieren Sie die Kanalspezifische KO-Winkel-Taste und mit dem Standard-Filtersatz.
3. Ziehen Sie die RAW (.dv)-Datei in der Eingabedatei Raum. Klicken Sie tun. Die Ausgabedatei den gleichen Namen wie die Eingabedatei mit _SI am Ende hinzugefügt.
   Hinweis: Diese Wiederaufbauprozess kann als eine Aufgabe mit dem Task-Builder-Funktion aus dem Menü Prozess, wenn mehrere Dateien verarbeitet werden sollen ausgeführt werden.

6. Datenexport und Datenanalyse

1. Verwenden Imaris, 3D-Bilder visualisieren treffen Modus und ExPort-Bilddaten als TIFF (300 dpi) oder AVI-Dateien (keine Komprimierung). Größenmessungen in Imaris kann mit dem Messwerkzeug in treffen Modus werden.
2. Erzeugung von 3D-Intensität Plots der Z-Ring aus 3D-SIM-Bilddaten:
   1. Die Aufteilung von FtsZ um die Z-Ring und 3D-Plots Intensität erstellen
      1. Öffnen Sie eine 3D-Bilddatei, um die einzelnen Z-Scheiben zu sehen. Verwenden Sie die Lautstärke-Viewer-Tool unter der Registerkarte Ansicht-Menü befindet, eine Region von Interesse zu beschneiden.
      2. Geben Sie die Anzahl der Fenster für dieses Bild 3D in das Eingabefenster und geben Sie einen neuen und unbenutzten Fensternummer in das Ausgabefenster. Die Region Select-Taste zur Verfügung stehen werden, um eine individuelle Z-Ring von Interesse aus dem ursprünglichen 40 x 40 um Sichtfeld zu beschneiden.
      3. Stellen Sie die gewünschte Achse und der Grad der Drehung in der Registerkarte Rotation. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen. Blättern Sie durch die Lautstärke, um die gewünschte Perspektive der Z-Ring erhalten.
      4. Verwenden Sie den Dateninspektor Werkzeug und passen ter Spalte / Zeile Dimensionen, eine neue Region von Interesse in der Umgebung eines einzelnen Z-Ring zu schaffen. Klicken Sie auf die Bildmitte, um diesen neuen Bereich von Interesse zu positionieren. Der Text-Bilddaten ist eine automatisch erzeugte Tabelle, die die Fluoreszenzintensität jedes Pixels in dem interessierenden Bereich anzeigt.
      5. Klicken Sie auf die 3D-Grafik-Taste, um die Intensität Grundstück zunächst anzuzeigen.
      6. Alternativ können die Text-Bilddaten können durch Klicken auf die Schaltfläche Speichern von Tabellendaten in der Datei-Menü exportiert werden.
      7. Kopieren Sie die Bilddaten aus der gespeicherten Textdatei in ein neues Tabellenblatt. Wählen Sie alle Zellen innerhalb der Tabellenkalkulation und eine neue 3D-Oberflächendiagramm. Formatieren Sie die 3D-Intensität Grundstück Diagramm für die Veröffentlichung.
   2. Für Zeitraffer-Daten wiederholen Sie die Schritte 6.2.1.1 - 6.2.1.7 auf jedem der verschiedenen Zeitpunkten aus dem 3D-Bilddatei.
3. Tracking mittlere Fluoreszenzintensität über die Zeit
   1. Verwenden Sie die Text-Bilddaten, die fluorescen verfolgence Intensität über die Zeit in einem Bereich von Interesse.
   2. Markieren Sie die Zellen, die der Region von Interesse entsprechen.
   3. Berechnung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität in jedem Zeitpunkt für diese Region von Interesse.
   4. Verwenden Sie die mittlere Fluoreszenzintensitätswerte, einen separaten Liniendiagramm zu erzeugen.

Representative Results

In dieser Studie visualisiert wir die bakteriellen Zellteilungsprotein FtsZ, ausgedrückt in lebenden Zellen als FtsZ-GFP-Fusion, um die Vorteile der leistungsfähigen SIM-F3D über herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der bakteriellen Proteinlokalisierung und Dynamik zu veranschaulichen. FtsZ ist ein Tubulin-ähnliche Zytoskelett-Protein, das in einem dynamischen Ringstruktur um den Umfang der Zelle polymerisiert. Die Z-Ring hat eine wichtige Funktion bei der Zellteilung: seine Montage markiert den künftigen Standort der Teilung, wirbt er alle Zellteilung Proteine ​​an dieser Seite, und Z-Ring Verengung scheint die Kraft während der Zellteilung ¹⁷ bereitzustellen, um nach innen gerichtete Bewegung der Zellhülle ermöglichen ^{, 18.}

Wenn durch konventionelle Weitfeldfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, wird die Z-Ring als eine einzige Querband der Fluoreszenz in stäbchenförmige Bakterien, einschließlich der am besten untersuchten Organismen wie B. subtilis (2A), <em> E. coli und C. crescentus. Wichtig ist, wird die Fluoreszenzintensität in diesem Band, die mehr oder weniger gleichförmig sein, und die Lokalisierungsmuster bietet wenig Einblick in die strukturelle Organisation und Verteilung von FtsZ Polymere innerhalb der Z-Ring. Wenn die gleichen Zellen unter Verwendung der hier beschriebenen F3D-SIM-Verfahren (2B) untersucht, jedoch sind die Vorteile dieser Technik sofort offensichtlich. Zuerst wird die Drehung der 3D-SIM-Bildes um die Z-Achse ermöglicht die Visualisierung der Z-Ring als echte Ringstruktur im dreidimensionalen Raum (2C und 3A). Zusammen mit der Erhöhung der Auflösung, zeigt dies, daß die Verteilung von FtsZ in Z-Ring ist in der Tat sehr heterogen (Abbildung 3). Die Verbesserung der Auflösung erlaubt uns auch, Z Ringe, die den Prozess der Verengung begonnen haben, eine Division Septum (durch die Einstülpung der Zellmembran in angegebenen Form zu sehen <strong> 2C und 2D).

Zusätzliche Beispiele von B. subtilis Z Ringe durch diese Technik visualisiert sind in Abbildung 3Bi gezeigt - 3Biv und zeigen, wie die Fluoreszenz-Intensität um die Z-Ring ist nie das gleiche. Außerdem sind Bereiche sehr geringer Fluoreszenzintensität häufig beobachtet. Wir bezeichnen diese Regionen als Lücken (weiße Pfeilspitzen). Wir beobachten diese Lücken in 15% aller untersuchten Z-Ringe (n = 84) und vor allem in Z-Ringe mit einem Durchmesser von 800 bis 900 nm (93%). Um diese Beobachtungen zu quantifizieren, wurden 3D-Intensität Plots der Z-Ring erstellt und sind in Abbildung 3CI und 3Cii unter Verwendung der in den Figuren 3Biii und 3Biv gezeigt Z Ringe gezeigt. Die Intensität Plots zeigen, dass in der Regel die Menge der Fluoreszenz in der Z-Ring kann bis zu 3 variieren - 4-fach in verschiedenen Regionen des B. subtilis Z-Ring. Darüber hinaus zeigen die 3D-Intensität, dass die Grundstücke gaps der Fluoreszenz in der Z-Ring fast das Ausgangsniveau lesen von Hintergrundfluoreszenz (schwarzer Pfeil in Abbildung 3CI). Diese oben genannten Beispiele zeigen gute Rekonstruktionen der Z-Ring und sind abhängig von ausreichend Licht, das von der Probe ohne nennensPhotoBleaching emittiert. Dies wird durch die Helligkeit des GFP-Fluorophors an FtsZ und dessen Menge in der Zelle unter diesen Bedingungen (hohes Signal-Rausch-Verhältnis) fusioniert erreicht. In anderen Zellen, in denen das Signal-Rausch-Verhältnis niedrig ist die Rekonstruktion des Bildes ist schlecht. Um dieses Auftreten zu FtsZ-GFP, die Menge des Emissionssignals aus der Kategorie B. simulieren subtilis-Zellen wurde durch Absenken der Anregungsenergie verringert. Wie in Figur 3D eine 100-fache Reduktion der Anregungsenergie zu einem Bild des Z-Rings, die erhebliche Artefakte gezeigt hat. Dies tritt als Folge der unzureichenden lokalen Kontrast zwischen FtsZ-GFP-Signal und dem Hintergrund der zu Poor Rekonstruktion des Bildes.

Interessant ist, dass B. subtilis Z Ringe zeigten stärkere Lücken und Heterogenität in der oberen und unteren Bereiche des Ring nicht aber in den Seiten des Ringes (3B). Dies tritt auf, weil der Unterschied in der Auflösung durch diese Variation des 3D-SIM in der lateralen Ebene im Vergleich zu der axialen Ebene erreicht. Dies führt zu den oberen und unteren Regionen der Z-Ring (seitlichen Ebene) mit optimaler Auflösung abgebildet. Die Lücken in der Z-Ring zu klein, um in den Seiten des Z-Rings nachgewiesen werden, wie in der axialen Ebene, die etwa die Hälfte der Auflösung der lateralen Ebene hat visualisiert. Bakterien, die ein coccoid Morphologie aufweisen, wie S. aureus weisen Z-Ringe, die in allen Ebenen positioniert sind. So Abbilden der Z-Ring, wenn es liegt in der seitlichen Ebene (oder nahe daran) bietet die Möglichkeit, Bild alle Regionen der Ring mit optimaler Auflösung. Ausnutzend, haben wir die Struktur des untersuchtendie Z-Ring im Live S. aureus-Zellen unter Verwendung einer Belastung, die ein Plasmid-tragenden ein FtsZ-GFP-Fusions enthält. Herstellung dieser Fusions unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors P _SPAC (siehe Schritt 1.2.1). Wenn sie mit in der axialen Ebene, S. abzubildenden aureus Z Ringe erschien identisch mit B. subtilis Z-Ringe, die in der gleichen Ebene (Abbildung 4Ai) vorhanden sind. Abbildung jedoch Z-Ringe in der lateralen Ebene bestätigt, dass das gesamte Z-Ring erschien sowohl wulstartige und heterogen. Über 26% dieser Ringe zeigten auch mindestens eine sichtbare "Lücke" der Fluoreszenz (Abbildung 4Aii, 4B). Ähnlich B. subtilis FtsZ zeigen Fluoreszenzintensität Stücke, dass die Intensität der Fluoreszenz in der Z-Ring variiert so viel wie 4 - 6-fach in verschiedenen Bereichen des S. aureus Z Ring (4C).

Die Länge und die Breite der Wülste gemessen werden (finden Sie in 4D schematisch). Dies zeigte, dass 80% der Z-Ringe (n = 43), die untersucht wurden, hatten eine Leistenlänge von 200 nm und erreicht eine Maximallänge von 400 nm auf. Die Breite der Kügelchen, auf der anderen Seite bis zu 200 nm gemessen. Es war im Durchschnitt 12 ± 2 (SEM) FtsZ Perlen pro Z-Ring. Ähnliche Lokalisierungsdaten wurde beobachtet, wenn Mutter FtsZ wurde mit diesen Methoden mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie (IFM) zeigen, dass diese heterogenen und perlenähnlichen Muster Lokalisierung echt war und nicht ein Artefakt durch die Expression von GFP-ftsZ neben nativen FtsZ verursacht visualisiert (Daten nicht dargestellt). Diese Weiterentwicklung von 3D-SIM ist in der Lage zu zeigen, dass die Z-Ring erscheint als eine heterogene Struktur auf und ist möglicherweise in der Natur diskontinuierlich.

Um die Frage, wie diese heterogenen Z-Ring-Struktur erfährt Verengung und erleichtert die Zellteilung anzusprechen, kann ein Zeitraffer-Analyse der Z-Ring Dynamik durchgeführt werden. Eine der wichtigsten Herausforderungen, die mitFluoreszenzmikroskopie Zeitraffer-Studien ist in der Minimierung von Proben Bleichen und Phototoxizität während der Bildgebung. 3D-SIM erfordert eine große Anzahl von RAW-Bilder zu erhalten, was bedeutet, dass Photobleaching einer Probe im Laufe der Zeit in einem schlechten Signal-zu-Rausch-Verhältnis führt zu einer unzureichenden Signals führen, um geeignete Bildrekonstruktionen zu ermöglichen. Die Anwendung der neuen Technologie minimiert die Menge an Anregungsenergie für jede Belichtung und damit eine Verringerung der Energie, die in der lebenden Zellen verwendet. Es tut dies durch eine Kombination von Lichtstrahl-Interferometrie, um die strukturierten Musters auf die Probe und die Verwendung von wissenschaftlichen CMOS-Kameras, die Empfindlichkeit und die Quantenausbeute zu erhöhen erstellen. Diese Kombination ergibt Z-Stapel-Übernahme von 1 um pro Sekunde (512 × 512 Pixel x 8 z-Scheiben) im Vergleich zu 1 um pro 5-8 sec (512 x 512 Pixel x 8 z-Scheiben) mit unserer vorherigen Iteration erhalten 3D-SIM-Karte (in Riglar et al. ²⁶ beschrieben).Verringerung der Bildaufnahmezeit und Belichtungseinstellungen kann auch helfen, zu minimieren Phototoxizität von lebenden Zellen, die besonders relevant im Zeitraffer Studien ist. Die neue Technologie hier vorgestellten Adressen auch ein anderes Problem im Live-Cell-Imaging, die wir als "Bewegungsunschärfe", die in diesem Zusammenhang bezieht sich auf die Lokalisierung von Proteinen ändert sich während der Bildaufnahme. Durch die Verringerung der Bildaufnahmezeit der Betrag "Bewegungsunschärfe" minimiert somit eine genauere Bildrekonstruktion.

Frühere Studien, die angesprochen haben, wie FtsZ ist innerhalb der Z-Ring organisiert haben nicht in der Lage zu zeigen, wie Z-Ringstruktur im Laufe der Zeit ändert. Um diesen Aspekt zu untersuchen führten wir im Zeitraffer mit F3D-SIM-Karte. Dies ermöglichte Erwerb einer 3D-SIM-Bild der Z-Ring in B. subtilis alle 5-10 Sekunden über einen Zeitraum von 50 s, die zuvor auf dieser Zeitskala nicht möglich war. Gezeigt in Figur 5A ist eine example der schnellen Veränderungen in FtsZ Verteilung innerhalb der Z-Ring über die Zeit (Durchmesser von 890 nm). Andere Z-Ringe, die sichtbar in den Prozess der Verengung waren, wurden auch gezeigt, dass eine ähnliche Dynamik, die die Verteilung von FtsZ um die Z-Ring beeinflußt (nicht gezeigt). 3D-Intensität kann auch Grundstücke für jeden der Zeitpunkte erzeugt werden, um zu quantifizieren und schätzen die kontinuierliche Fluoreszenzintensität ändert und somit die relative Häufigkeit von FtsZ in verschiedenen Regionen der Z-Ring auf einer Zeitskala von Sekunden (5B) werden. Regionen von Interesse kann aus diesen Intensitätsgrundstücke identifiziert, um die Schwankungen der Fluoreszenzintensität (5C) zu verfolgen. Tracking diese Änderungen in der Z-Ring-Struktur unter diesen Bedingungen wäre ohne die erweiterte F3D-SIM-Technologie praktisch unmöglich. Darüber hinaus offenbart diese Arbeit von S. aureus die dynamische Bewegung des FtsZ ist ähnlich zu dem in B beobachtet subtilis. S. aureus RN4220 Zellen producing FtsZ-GFP wurden für 50 s bei 10 sec Zeitintervallen abgebildet. Änderungen an der Heterogenität der Z-Ring in S. aureus mit F3D-SIM waren auch ähnlich B. subtilis (siehe Pfeilspitzen und Pfeile in Abbildung 6). Diese Zeitraffer Studien unterstützen ein Modell der Z-Ring Verengung (die iterative Kneifen-Modell), die durch Prüfung von Fest C vorhergesagt wurde crescentus Zellen, aber nicht durch die Notwendigkeit der Z-Ring Dynamik in lebenden Zellen zu untersuchen ²⁷ gezeigt werden.

Abbildung 1 Schematische Darstellung der optischen Konfiguration der SIM-F3D in dieser Studie. Laserlicht von dem Lasertisch verwendet wird, durch eine SIM-Faser auf eine Kollimationslinse dann in den Phasensteuerungsmodul, das sowohl die spezifischen Wellenlänge erzeugt gerichtet und fixiert Gitter, optimale Abstand of den ± ^1. Ordnung Strahlen, die von der Zentralstrahl der nullten Ordnung und der Phasenschritte für die SIM-Kollektion. Die Balken geben Sie dann die Winkel-Steuermodul, wo die Strahlen zu den 3 verschiedenen Clustern wider, um die 3 Beleuchtungswinkel zu schaffen. Die Balken geben Sie dann das Mikroskop und die Lichtbahn wie abgebildet (Modified mit Genehmigung von Paul Goodwin, API).

Abbildung 2. Vergleich der konventionellen Weitfeld-Fluoreszenz-und 3D-SIM-Bildgebung von B. subtilis-Zellen ftsZ-GFP-exprimierenden. (A) Konventionelle Weitfeld-Fluoreszenz-Imaging von B. subtilis-Zellen ftsZ-GFP-exprimierenden (SU570, grün) als Einzelkopie wurden auch mit dem Membranfarbstoff FM4-64 (rot) gefärbt. Maßstab = 5 um. Das Bild wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops aufrecht erworben.(B) 3D-SIM-Bildgebung der gleichen B. subtilis-Stamm ftsZ-GFP, mit FM4-64 gefärbten Ausdruck zu bringen. Regionen von Interesse aus dem Bild ausgewählt (gestrichelter Kasten) Zum Vergrößern werden. Das Bild kann auch um die z-Achse, um 3D-FtsZ-Ringe in der axialen Ebene anzuzeigen gedreht werden. (C, D) Die Entfernung von Out-of- Fokus Licht und verbesserte Bildauflösung von 3D-SIM vorgesehen ermöglicht eine klare Visualisierung der Z-Ringe (auch solche, die verengt sind) und die innere Zellmembran während der Teilung (weiße Pfeile). Beachten Sie, dass das Protokoll Text beschreibt die Darstellung eines einzelnen Fluorophors. Jedoch kann das Verfahren zum Erfassen von bis zu vier verschiedenen Wellenlängen gleichzeitig angepasst werden. Diese Zahl hat sich von Strauss et al ¹⁶ abgedruckt.

Figur 3. Repräsentative Bilder der Z-Ring im Live-stabförmigen Bakterienzellen (B. subtilis) Expression FtsZ-GFP mit Hilfe von 3D-SIM-Karte. (Ai) Der Z-Ring als Band der Fluoreszenz senkrecht zur Längsachse der Zelle, die in der xy-Ebene beobachtet. (Aii) Das Bild ist auf der Z-Achsen-gedreht mit Imaris 3D-Visualisierungssoftware (siehe Protokoll Schritt 6.1), so dass man durch die Ringstruktur suchen, um klar zu sehen, wie FtsZ ist innerhalb der Z-Ring verteilt. Dieses Bild, jetzt in der ZX-Ebene zeigt, dass der Ring eine heterogene Verteilung der FtsZ mit Bereichen keine oder nur sehr wenig Fluoreszenz (weiße Pfeile). Das Bild muss gedreht werden, um diese "Lücke" Regionen der Fluoreszenz zu beobachten. Bi-Biv zeigen weitere Beispiele der gedrehten Z-Ringe, die jetzt liegen in der ZX-Ebene. Z Ringe (Bi-iii) einen Durchmesser von ca. 0,9 um. (BIV) einen Z-Ring mit einem Durchmesser von ONLy 0,65 um zogen Verengung. (Ci) Dieses typische 3D-Intensitätsprofil zeigt die Fluoreszenzintensität (dh Konzentration) Unterschiede in der FtsZ-GFP um die Z-Ring mit einem Durchmesser von 0,85 um (siehe Protokollschritte 6.1-6.3). Die Höhe der Fluoreszenz in dieser Lücken ist niedrig und nähert Hintergrundfluoreszenz Ebenen (schwarzer Pfeil). (CII) Eine ähnliche 3D-Intensitätsprofil einer Z-Ring in den Prozess der Verengung. FtsZ-GFP-Konzentration ist auch nicht einheitliche; Durchmesser 0,65 um. Platten A, B, CI und Cii haben von Strauss et al ¹⁶ abgedruckt.

Abbildung 4. Repräsentative 3D-SIM-Bilder von S. aureus Zellen, FtsZ-GFP. Da diese Zellen rund (Kokken) sind, wird der Z-Ring havE verschiedenen Orientierungen. Zellen, die ein Band der Fluoreszenz in der normalen Betrachtungsorientierung zeigen (das heißt, in der xy-Ebene), wie in (IV) dargestellt ist, sehr ähnlich zu denen in stäbchenförmigen Zellen, wenn sie um die Z-Achse gedreht wird, wie für Abbildung 1Ai. In (aii) die Z-Ring ist bereits in der xy-Ebene; Seitenausrichtung und die Auflösung ist maximal über die gesamte Ring der nunmehr eine Perle artige Struktur (B). (C) Ein 3D-Intensität Grundstück von der relativen Häufigkeit von FtsZ-GFP in der Z-Ring. (D) Schematische Darstellung des S . aureus Z-Ring. Rote Pfeile zeigen Wulst Länge und Breite (siehe Protokoll Schritt 6.1). Diese Zahl hat sich von Strauss et al ¹⁶ geändert.

<strong> Abbildung 5. F3D-SIM ermöglicht die schnelle Analyse von FtsZ Lokalisierung im Laufe der Zeit in 3D-SIM-Karte. (A) Änderungen in der FtsZ-GFP Verteilung innerhalb der Z-Ring in stabförmigen B. subtilis-Zellen sichtbar gemacht, um die Dynamik des Rings anzugeben. (Sec) auf der linken oberen Ecke jedes Bildes angezeigt. (B) 3D-Fluoreszenzintensität Plots zeigen die nicht-gleichmäßige und dynamische Verteilung der FtsZ in der Z-Ring. (C) FtsZ Dynamik (FtsZ-GFP-Fluoreszenz Veränderungen in der Ring) kann auch in mehr Detail durch die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität über die Zeit in zwei Bereiche von Interesse untersucht werden. Diese Zahl hat sich von Strauss et al ¹⁶ abgedruckt.

Abbildung 6. F3D-SIM-Zeitraffer-Aufnahmen zeigen Veränderungen in FtsZ Lokalisierung innerhalb des Rings im Laufe der Zeit in S. einureus. Eine weiße Pfeilspitze zeigt eine Lücke, wenn es anfänglich in der Z-Rings nachgewiesen. Das Auftreten und Verschwinden von Lücken an der gleichen Position (wie durch die weißen Pfeilspitze markiert) über die Zeit zeigt, wie FtsZ ist um die Z-Ring verteilt. Weiße Pfeile zeigen die Bildung von Lücken in der Z-Ring zu späteren Zeitpunkten. Zeit (sec) ist auf der oberen linken Seite des Bildes angezeigt. Diese Zahl hat sich von Strauss et al ¹⁶ geändert.

Discussion

Fluoreszenz Live-Cell-Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das Beobachtung der dynamischen Veränderungen innerhalb der Zellen über die Zeit ermöglicht. Echtzeit-Bildgebung des bakteriellen Zellbiologie ist schwierig, weil der kleine Zellengröße und verringert die Fähigkeit der bakteriellen Zellen auf wiederholte Einwirkung von Anregungslicht zu widerstehen. F3D-SIM hat die für alle verfügbar Zellbiologie verhören Tools erweitert, aber es ist notwendig, um diese Technik durchführen sorgfältig als Artefakte können eingeführt werden, wenn schlecht umgesetzt werden. Es gibt eine Reihe wichtiger Überlegungen für die erfolgreiche Anwendung dieser Technik. Da es eine Weitfeld-Abbildungsverfahren, das auf der Verwendung der Punktstreufunktion des emittierten Lichts, Brechungsindex-Fehlanpassung und die sphärische Aberration des emittierten Lichts beruht müssen vermieden werden, um eine genaue Bildrekonstruktion zu ermöglichen. Die Verwendung von Deckgläsern von 0,17 mm Dicke eine hohe Qualität der Variation der Signalintensität aufgrund der Glasdicke Variabilität in den Abdeckungen zu vermeidenLippe ist sehr zu empfehlen. Es ist sehr wichtig, um sorgfältig die sphärische Aberration des emittierten Lichts während der Anfangsstufen aller Experimente und stellen Sionsöl Brechungsindex benötigt. Dies kann von Tag zu Tag variieren, wie es sowohl von der Temperatur und dem Befestigungsmittel / Substrat der Probe ist. Die Verwendung der falschen Öl schlechteren Rekonstruktion der Bilder mit Artefakten wie Halos und Echosignalen führen.

Am Ende der Bildrekonstruktionsprozess für jede Phase ein Maß für die Qualität der Rekonstruktion durch den "best fit Ko Winkel" für jede Phase / Winkel des Beleuchtungs erhalten werden. Wenn dieser Wert kleiner als 1 für jeden Winkel, dann wird die Qualität des rekonstruierten wird wahrscheinlich hoch. Wenn dieser Wert über 6 ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass das rekonstruierte Bild Artefakte enthalten. Gemeinsame Ausstellungsstücken zählen i) das Aussehen der Streifen im Bild, die entsprecheneiner der Ecken des Gitters. Diese können von niedrigeren Signal von diesem Gitterwinkel führen; ii) Lichtrand um Strukturen. Dies kann aus sehr uneben Ebenen des Signals von hellen Strukturen im Vergleich zu den umgebenden Strukturen führen, eine Fehlanpassung des Brechungsindex des Öls und die Probe oder aufgrund der Strukturen im Bild als zu amorphen und nicht enthält genug "Struktur" zu sein nach dem Algorithmus erfasst; iii) "Wabenbildung", die von einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis ergibt sich das Bild, in der Regel aufgrund des hohen Hintergrundsignal; iv) Strukturen, die gedehnt werden / Lang in xy, die durch im Brechungsindex von Öl-und Proben sein können. Dieses Artefakt ist schwierig, für einen unerfahrenen Benutzer zu erkennen. Es wird empfohlen, dass neue Benutzer einen erfahrenen SIM-Forscher für die Beratung über die Bildinterpretation und Analyse beim Start, um diese Technik zu nutzen.

Wie bei allen Leuchtstoff Live-Cell-Imaging-Experimente ist es Important sorgfältig Ausgleich der Erregerenergiezufuhr, um den Grad der Ausbleichung und Phototoxizität der Zellen mit benötigt, um Bilder mit minimalen Artefakten rekonstruieren ausreichende Emissionssignal zu minimieren. Übermäßige Photobleaching (mehr als 30% über eine einzige Z-Stapel-Erwerb) wird an einen Streifenmuster in dem rekonstruierten Bild führen. Mit dem Einsatz von sCMOS Kameras können Super-Resolution-Bilder erfolgreich von RAW-Bildern mit Emissionssignal so niedrig wie 1000 zählt über dem Hintergrund rekonstruiert werden. Dies kann für sehr kurze Belichtungszeiten, wodurch Photobleaching verringert und den schnellen Erfassung für jeden Rahmen zu ermöglichen. Es erhöht auch die Menge an Zeit zwischen Rahmen für Zellen von der Anregungsenergiezufuhr zu erholen. Zusätzlich, da die Erfassungszeit für jeden einzelnen Rahmen kann sehr kurz sein, den Grad der Artefakt "motion blur" bei einer einzelnen Erfassung eingeführt wird unter Verwendung dieses Verfahrens verringert.

Das Varioation von 3D-SIM bietet eine Reihe weiterer Vorteile gegenüber anderen verfügbaren Super und hochauflösende bildgebende Verfahren für die Bildgebung durch bakterielle Zellbiologen. Das 2-fache Zunahme in der Auflösung in allen 3 Dimensionen und die Fähigkeit, Bild bis 30 um in einer Probe ermöglicht die Abbildung der gesamten Bakterien (und Säuger-Zellen) in einem Experiment. Techniken wie Einzelmoleküllokalisierung, die üblicherweise in der abklingenden Welle durchgeführt werden, können die Eindringtiefe in einer Probe nicht erreichen, und bieten keine Informationen an ganzen Zellen. Jüngste Fortschritte, die höhere Samplingtiefen für diese Technik ermöglichen kann besser axiale Auflösung von ganzen Zellen führen. Außerdem ist Einzelmolekültechniken Lokalisierung, die Tausende von RAW-Bildern erworben werden auch in der Bildrate, die erfasst werden können, und kann Kompromiss zwischen Capture Frame-Rate und dem ultimativen erreicht räumliche Auflösung erfordern, wie die räumliche Auflösung begrenzt erfordern abhängig von der Anzahl der VorabendNTS in einem definierten Raum aufgenommen. Verringerung der Anzahl der aufgenommenen Bilder werden in einer geringeren räumlichen Auflösung führen, sondern kann ausreichen, um die zeitliche Auflösung für den biologischen Prozess von Interesse erforderlich zu erreichen. Die Menge der Erholungszeit zwischen den Rahmen möglicherweise auch erhöhte Phototoxizität in lebenden Zellen, wodurch die Dauer und die Häufigkeit, mit der Zeitreihe erhalten werden Begrenzung zu minimieren. Hochauflösung Techniken wie die Elektronenmikroskopie (EM) oder Elektronen cryotomography (ECT) bieten höhere Auflösung als 3D-SIM (und anderen höchstauflösenden optischen Mikroskopie-Techniken), müssen aber an festen Proben durchgeführt werden. Die Festsetzung und die Verarbeitung kann Artefakten führen und die fehlende Kennzeichnung kann Interpretation erschweren. Markierungsfreien ECT einen schlechten Kontrast und Probe Eindringtiefen von etwa 500-200 nm ²⁴ zu erreichen, so dass selbst wenn das Protein von Interesse identifiziert werden kann, kann die Struktur des Proteins in einer ganzen Bakterienzelle nicht beobachtet werden.Selbst wenn die Kennzeichnung in EM, wie mit Immun verwendet werden, wird die Abbildungs ​​nur in 2D durchgeführt. 3D ist nur mit dünnen Schnitte und Computerrekonstruktion der Abschnitte erreichbar. Die dünne Schnitte erfordert einen erfahrenen Techniker, kann aber problematisch sein und zu Artefakten. Mit Live-oder fixierten Zellen, ist 3D-SIM nicht brauchen, um in einer bestimmten Art und Weise eingebettet werden und die Zellen können sich schnell für die Bildgebung in der Nähe einer nativen Zustand hergestellt werden.

Dieses Verfahren ist relativ einfach, die von Forschern mit minimaler Erfahrung in der Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen. Experimente können in Medien, die gesunde Zellfunktion, so lange es nicht fluoreszieren oder erzeugen unnötige Hintergrundsignal unterstützt durchgeführt werden. Für Bakterienzellen, kann dies die Verwendung von vielen Arten von komplexen und Minimalmedien oder die Verwendung von festen oder halbfesten Medium, um bakterielle Zellbewegung steuern können. Viele Biologen, die bereits fluoreszierende Protein (FP)-Fusionen entwickelt und getestet haben die Funktionalität vondiese Fusionen können schnell erfolgen diese Technologie ohne weitere Engineering und Validierung mit neuen photoaktivierbares FP Fusionen. Wir fanden, als eine allgemeine Beobachtung, dass S. aureus war während der Bildgebung mit FP-Fusionen als B. anfälliger für Photobleaching subtilis. Mit unserem Original-3D-SIM-Verfahren, bei denen das Gittermuster wurde durch eine physikalische Gitter erzeugt wird, waren wir nicht in der Lage, Live Cell Imaging mit einer Reihe von S. durchführen aureus FP Fusionen. Doch mit dieser fortschrittlichen F3D-SIM-Verfahren, waren wir in der Lage, diese Bild FP Fusionen und führen kurze Zeitreihen, um die Dynamik dieser markierten Proteine ​​zu erfassen. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der reduzierten Belichtungszeiten für die Bildgebung erforderlich und erhöhte Zeit zwischen Rahmen für die Erholung der Zellen.

OMX Blaze 3D-SIM ist ein handelsüblicher Technik, die relativ leicht in einem einzigen Labor oder einem Kern Imaging Facility umgesetzt werden können. Vorsicht geboten, um die Technik durchzuführen, um zu vermeiden ArtiFakten aufgrund der schlechten Probenvorbereitung oder schlechte Bild-Capture. Sobald die Technik beherrscht, kann Studien der Proteinstruktur und Dynamik in kleinen Organismen wie Bakterien, in Einzel-oder Mehrfarben-Fluoreszenz durchgeführt werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose I (Biotecnology grade)	AMRESCO	0710-500G	Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media.
N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 4-64)	Life Technologies	T-13320	Lipophylic dye used for staining cell membranes.
1.5 ml microtube, graduated Natural	Scientific specialties Inc.	1210-00	Made from Homopolymer polypropylene, used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization.
Luria broth base, Miller	BD	241420	Prepared according to manufacturer's instructions. Add 2% agarose after autoclaving.
BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3	BD	210932	Prepared according to manufacturer's instructions.
Adhesive frame	Thermo-Fisher Scientific	ABGAB-0577	Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15 x 16 mm).
Microscope cover glass	Thermo-Fisher Scientific	111512-9	22 x 22 No. 1 Thickness
35 mm diameter Petri dish with a glass coverslip bottom	World precision instruments	FD35-100	Known as FluoroDish with this company. Dish: Ø35 mm, Glass: Ø 23 mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378-25G	Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol.
Lincomycin hydrochloride	Sigma	L6004-5MU	Make a 25 mg/ml stock in 50% ethanol.
Erythromycin	Boehringer Mannheim GmbH	12390120-14	Make a 10 mg/ml stock in 95% ethanol.
Combined orbital/linear shaking waterbath	Grant scientific Instruments	OLS-200	Shaking speed used for cultures: 215 rpm
UV visible spectrophotometer	Shimadzu	UV-1601	600 nm wavelength was used for measuring optical density of bacterial cultures.
Centrifuge	Eppendorf	5415R	Pellets of bacterial culture were obtained by spinning down mid exponentially growing cultures at 8,000 rpm for 30 sec.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma	15502-10G	Prepare 1 M stock and filter sterilize prior to use.
softWoRx software	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company	version 5.0
Imaris data analysis software	Bitplane Scientific Software, Bitplane AG	version 7.0.0	Matlab XTensions included
DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.	Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company		Blaze module fitted on OMX V3
Upright fluorescence microscope	Zeiss Axioplan 2