Summary
פוליפפטידים דמויי אלסטין הם biopolymers גירוי מגיב עם יישומים החל טיהור חלבון רקומביננטי לאספקת סמים. פרוטוקול זה מתאר את הטיהור ואפיון של פוליפפטידים כמו אלסטין והתכת פפטיד או חלבון שלהם מחיידקי Escherichia באמצעות שלב טמפרטורת פתרון מעבר ההתנהגות הקריטית נמוך יותר שלהם כאלטרנטיבה פשוטה לכרומטוגרפיה.
Abstract
פוליפפטידים דמויי אלסטין הם biopolymers חוזר על עצמו כי תערוכת שלב טמפרטורת פתרון מעבר התנהגות קריטית נמוך יותר, קיים unimers מסיס כמתחת לטמפרטורת מעבר אופיינית וצבירה לתוך coacervates מיקרון בקנה המידה מעל לטמפרטורת המעבר שלהם. העיצוב של פוליפפטידים כמו אלסטין-ברמה הגנטית מאפשר שליטה מדויקת של הרצף שלהם ואורך, אשר מכתיב את תכונות התרמיות שלהם. פוליפפטידים דמויי אלסטין משמשים במגוון של יישומים, כולל biosensing, הנדסת רקמות, ואספקת סמים, שבו טמפרטורת המעבר ואדריכלות biopolymer של ELP יכולים להיות מכוונת ליישום הספציפי של עניין. יתר על כן, בשלב מעבר טמפרטורת פתרון הקריטי נמוך יותר ההתנהגות של פוליפפטידים כמו אלסטין-מאפשרת הטיהור שלהם על ידי תגובת התרמית שלהם, כך שcoacervation סלקטיבית שלהם וresolubilization מאפשר את הסרתם של שני מזהמים מסיסים ולא מסיסיםים הבא לידי הביטוי בEscherichia coli. גישה זו יכולה לשמש לטיהור פוליפפטידים כמו אלסטין-לבד או ככלי לטיהור להתכת פפטיד או חלבון שבו יכולים להיות מטוהרים פפטידים רקומביננטי או חלבונים גנטי צירפו תגי פוליפפטיד כמו אלסטין-בלי כרומטוגרפיה. פרוטוקול זה מתאר את הטיהור של פוליפפטידים כמו אלסטין והתכת פפטיד או חלבון שלהם ודן בשיטות אפיון בסיסיות על מנת להעריך את התנהגות התרמית של מוצרי פוליפפטיד כמו אלסטין טהורים.
Introduction
פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) הם biopolymers המורכבת מVPGXG pentapeptide החוזר שבו X, שאריות האורחים, היא כל חומצת אמינו מלבד פרולין. טמפרטורת פתרון קריטית נמוך תערוכת ELPs (LCST) מעבר התנהגות שלב, כך שפתרון ELP הומוגנית יפריד לשני שלבים על חימום לLCST, הנקרא הטמפרטורה ההפוכה המעבר (t T) בספרות ELP 1 בדרך כלל. שני השלבים מורכבים של שלב מאוד לדלל ELP כדורית ושלב משקע עשיר ELP. המשקע העשיר ELP נוצר על לוח זמנים קצרים על צבירה של רשתות ELP לחלקיקים בגודל של מיקרון כי לאחר מכן להתגבש. התנהגות זו מתרחשת על פני טווח של כמה מעלות צלזיוס, והוא בדרך כלל הפיך, כפתרון הומוגני הוא התאושש לאחר ששב לטמפרטורה מתחת t T.
ELPs מסונתזים בדרך כלל בEscherichia coli (E. coli) לכאן ולכאןמ 'גן מלאכותי שגבעול לפלסמיד ביטוי. פלסמיד זה הפך לאחר מכן לתוך E. שורת תאי coli שהוא אופטימלי לביטוי חלבון. יש לנו להשתמש באופן בלעדי במערכת וקטור T7-Lac חיית המחמד לביטוי של מגוון גדול של ELPs בE. coli, למרות מערכות ביטוי אחרות בשמרים 2-4, פטריות 5, וצמחים 6-8 יש גם מנוצלים על ידי חוקרים אחרים. מספר גישות קיימות כדי גנטי לבנות גנים ELP חוזר על עצמו, כולל קשירה רקורסיבית כיוונית (RDL) 9, קשירה כיוונית רקורסיבית על ידי שחזור פלסמיד (PRE-RDL) 10, וחפיפת הגברה העיגול מתגלגלת סיומת (OERCA) 11. היכולת להנדס ELPs ברמה הגנטית מעניקה את ההזדמנות להשתמש בטכניקות ה-DNA רקומביננטי ליצור ELPs עם מגוון רחב של ארכיטקטורות (למשל, מונובלוקים, diblocks, triblocks, וכו '), אשר יכול להיות מצורף נוספת עם פונקציונליפפטידים וחלבונים. שליטה ברמה הגנטית גם מבטיחה כי כל ELP בא לידי ביטוי באורך ובהרכב מוכתב על ידי תבנית פלסמיד הגנטית שלו מדויקים, המספק מוצרי biopolymer monodisperse בצורה מושלמת.
תכונות התרמיות של כל ELP תלויים בפרמטרים מהותיים לbiopolymer כגון משקלה המולקולרי (MW) ורצף, כמו גם גורמים חיצוניים ובכלל זה הריכוז שלה בפתרון ואת הנוכחות של cosolutes האחר, כגון מלחים. אורכו של ELP 12 והרכב שאריות אורחיה 1, 13, 14 שני פרמטרים מאונך בעיצוב ELP שניתן להשתמש בם כדי לשלוט על t T, שבו שאריות אורח הידרופובי ואורכי שרשרת ארוכים יותר יביאו לים לא T נמוך יותר, ואילו הידרופילי שאריות אורח ואורך שרשרת קצרה יותר לגרום s t T גבוהה יותר. ריכוז ELP הוא ביחס הפוך לt T, שבו הפתרונות של גרלא צריך T נמוך של 12 ריכוז ELP האוכל. הסוג והריכוז של מלחים משפיעים גם לא ELP T, שבו ההשפעה של מלחים מלווה את סדרת הופמייסטר 15. אניוני Kosmotropic (Cl - וגבוה יותר על סדרת הופמייסטר) להפחית את t ELP T וריכוז מלח הגדלת משפר את האפקט הזה. יכולים להיות מכוון פרמטרים פנימיים וחיצוניים אלה כדי להשיג התנהגות תרמית בטווח טמפרטורות יעד שנדרש ליישום ספציפי של ELP.
הגירוי מגיב להתנהגות של ELPs שימושית למגוון רחב של יישומים, כולל biosensing 16, 17, הנדסת רקמות 18, ואספקת סמים 19, 20. בנוסף, כאשר ELPs הם התמזגו לפפטידים או חלבונים ברמה הגנטית, ELP יכול לשמש כתג טיהור פשוט לספק שיטה אצווה זולה לטיהור של פפ רקומביננטיגאות ושפל או חלבונים שאינם דורש כרומטוגרפיה 21. שינוי של תהליך הטיהור מבטיח כי הפעילות של פפטיד או החלבון התמזגו ELP נשמר. התכה פפטיד או ELP החלבון יכולה להיות מטוהרת ליישומים בהם תג ELP שימושי 22, 23 או לחלופין, כאשר נדרש פפטיד או החלבון החופשי, אתר הכרת פרוטאז יכול להיות מוכנס בין פפטיד או החלבון וELP. ההסרה של תג ELP אז יכולה להיות מושגת על ידי עיכול עם פרוטאז בחינם או היתוך ELP פרוטאז, שבו האחרונים מספק הקלות נוספות של עיבוד כמו סיבוב של טיהור ELP סופי יכול להפריד את התג ופרוטאז היתוך ELP ELP מפפטיד או היעד חלבון בשלב אחד 24, 25. הפרוטוקול הבא מתאר את הליך הטיהור לELPs והתכת פפטיד או ELP החלבון באמצעות תכונות התרמיות שלהם ודן בטכניקות בסיסיות לאפיוןתגובת התרמית של מוצרי ELP.
Protocol
1. ביטוי ELP
- לחסן 3 מיליליטר של תקשורת נהדרת מרק סטרילי עם מניית DMSO או מושבה צלחת אגר של E. coli המתאים לביטוי חלבון המכיל את הפלסמיד ELP הקידוד הרצוי תחת שליטה של אמרגן T7-Lac. הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (O / N) עם רציף רועד בסל"ד 200.
- הוסף 1 מיליליטר של תרבות O / N ל1 ליטר של מדיה סטרילי נהדר מרק בבקבוק 4 L-. הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 24 עם רציף רועד בסל"ד 200. הערה: הביטוי "הדולף" נקודת ההתחלה ראה עם אמרגן T7-Lac הוא מספיק לביטוי ברמה הגבוהה של ELPs רבים, אם התרבות היא טופח במשך 24 שעות. עם זאת, ניתן להשתמש בגישה קונבנציונלית יותר, שבו ביטוי חלבון מושרה עוד יותר על ידי התוספת של 0.2-1 מ"מ איזופרופיל-beta-D-thiogalactoside (IPTG) כאשר הצפיפות האופטית של התרבות מגיעה 0.6. העבר את התרבות מהבקבוק 4 L-לבקבוק צנטריפוגות 1-L ו צנטריפוגות ב 4 ° C למשך 15 דקות ב 2,000 x גרם.
- בטל supernatant. שים לב: אם L יותר מ 1 של התרבות הוא גדל הם יכולים להיות מרוכזים על ידי הוספת ליטר נוסף של תרבות לגלולה וחוזר על שלב 1.3. עד 2 ליטר של התרבות יכול להיות מרוכז לגלולת תא בודדת.
- Resuspend את הכדור בופר פוספט (PBS), מים, או חיץ רצוי אחר להגיע 45 מיליליטר של השעיה תא והעברת צינור חרוטי 50 מיליליטר.
2 טיהור ELP:. ראשוני צעדים והסיבוב הראשון של הופכי מעבר רכיבה על אופניים
- Sonicate התא גלולה resuspended עבור סכום כולל של 9 דקות במחזורים של 10 שניות 'על' ו 'כבויה' 20 שניות בתפוקת חשמל של 85 W, תוך שמירה על המדגם על קרח. בקצרה לאפשר את המדגם כדי לצנן על קרח ולאחר מכן לחזור על מחזור 9 דק 'עוד פעם אחת. הערה: אם ELP צפוי לי t T נמוך מאוד t T.
- העבר את lysate ל50 מיליליטר עגול צינור צנטריפוגות תחתון.
- הוסף 2 מיליליטר של 10% (w / v) polyethyleneimine (PEI) עבור כל ליטר של התרבות ולנער כדי לערבב. הערה: PEI הוא פולימר טעון חיובי שמסייע בעיבוי של מזהמים גנטיים טעונים שלילי. אל תבצע שלב זה אם ELP טעון שלילי, כמו PEI יכול גם להתעבות ולהסיר את מוצר ELP.
- צנטריפוגה ב C ° 4 10 דקות ב 16,000 X גרם.
- מעביר את supernatant לנקי 50 מיליליטר עגול צינור צנטריפוגות תחתון וזורקים את הכדור.
- אופציונאלי "לאפות את" צעד: דגירה המדגם ב 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לפגל מזהמים חלבון ולאחר מכן להעביר ל4 ° C או לקרח עד ELP הוא resolubilized לחלוטין. צנטריפוגה המדגם ב C ° 4 10 דקות ב 16,000 X גרם. מעביר את supernatant לCL50 מיליליטר EAN עגול צינור צנטריפוגות תחתון וזורקים את הכדור. הערה: אין לבצע שלב זה אם פפטיד או חלבון הוא קבע את ELP וצפוי לפגל במצב של חום גבוה. זה עלול לגרום למעבר ELP להפוך לחום בלתי הפיך או יכול להרוס את הפעילות של מחצית התמזגו.
- לגרום למעבר ELP עם התוספת של NaCl גבישים (שלא יעלה על 3 מ '). לחלופין, ציטרט הנתרן (שלא יעלה על 0.3 M) יכול לשמש לELPs שיש לי T גבוה יותר T S או תשואות נמוכות. הערה: הפתרון צריך להפוך מעונן פעם מלח נמס, המציין את הפרדת פאזות של ELP מפתרון. ELPs מאוד הידרופילי עם ים לא גבוה T עשוי לדרוש מידה מסוימת של חימום, בשילוב עם התוספת של מלח, כדי לגרום להפרדת פאזות של ELP באינדוקציה ראשונית זה של מעבר ELP.
- צנטריפוגה בtemperatue החדר (RT) 10 דקות ב XG 16,000 (ספין חם). הערה: גלולה ELP צריכה bדואר ציין, גודלם תלוי בתשואת הביטוי של ELP. גלולה ELP זו עלולה להופיע בהתחלה אטומה, אבל לאחר הקירור היא תופיע שקופה ועשויה להיות בצבע חום. גלולה ELP תהפוך חסרת צבע יותר כתמורה לטיהור ומזהמים יוסרו.
- בטל supernatant ולהוסיף 1-5 מיליליטר של חיץ רצוי לגלולה. Resuspend את הכדור על ידי pipetting או הגדרת הצינור כדי לסובב ב 4 ° C. הערה: הנפח הנדרש של חיץ יהיה תלוי בגודל של גלולה ELP, ולכן התשואה של ביטוי ELP, שבו כמות מספקת של חיץ יש להוסיף כדי לאפשר resolubilization של גלולה ELP. ELPs עם תוכן ציסטאין תועלת גבוה מטיהור במים עם 10 מ"מ טריס hydrochloride phosphine (2-carboxyethyl) (TCEP-HCl) ב-pH 7 לחסל אינטראקציות דיסולפיד עם חלבונים מזהמים. ELPs עם תוכן תשלום גבוה תועלת מטיהור ב-pH המותאם לנטרול תשלום שלהם ולהפחית את eleאינטראקציות ctrostatic עם חלבונים מזהמים.
- מעביר את פתרון ELP המושעה זה ב1 aliquots מיליליטר לתוך צינורות microcentrifuge 1.5-מיליליטר נקיים.
- צנטריפוגה ב 4 ° C למשך 10 דקות ב XG 16,000 (ספין קר). גלולה קטנה של מזהמים מסיסים יש לשים לב.
- מעביר את supernatant לצינור נקי וזורקים את הכדור.
. 3 טיהור ELP: סיבובים עוקבים של הופכי מעבר רכיבה על אופניים
- לגרום למעבר ELP עם חום ו / או התוספת של NaCl. ניתן מודגרות דגימות על גוש חום או באמבט מים במשך 15 דקות בטמפרטורה מעל t T. אם, לעומת זאת, ELP הוא קבע את חלבון (המונע שימוש בחום) או אם ELP יש לא גבוה T שלא ניתן להגיע אליו עם חום לבד, פתרון 5 M של NaCl ניתן להוסיף טיפה חכמה כדי לגרום מעבר ELP. הערה: הפתרון צריך להפוך מעונן, המציין את הפרדת פאזות של ELP מפתרון.
- בטל supernatant, להוסיף 500-750 μl של חיץ רצוי וresuspend את הכדור על ידי pipetting או הגדרת הצינור כדי לסובב ב 4 ° C.
- צנטריפוגה ב 4 ° C למשך 10 דקות ב XG 16,000 (ספין קר). גלולה קטנה של מזהמים מסיסים יש לשים לב.
- מעביר את supernatant לצינור נקי וזורקים את הכדור.
- חזור על שלבים 3.1-3.5 עד אין גלולה מזהם הוא ציין במהלך שלב 3.4.
4. עיבוד פוסט טיהור (אופציונלי)
- אם תרצה, dialyze המדגם נגד חיץ מתאים כדי להסיר עודף מלח מפתרון ELP מטוהר. הערה: ELPs להיות lyophilized צריך להיותdialyzed נגד DDH 2 OO / N ב 4 ° C.
- אם תרצה, Lyophilize ELP עבור אחסון לטווח ארוך על ידי הקפאת הפתרון ב-80 ° C ל30 דקות לפני lyophilizing O / נ הערה: אין להשתמש בlyophilization לELPs עם חלבונים מצורפים.
- אם תרצה, לשחזר פפטיד או חלבון חופשיים מהיתוך ELP פפטיד או חלבון על ידי הסרת תגית ELP:
- לעכל את היתוך ELP פפטיד או חלבון עם פרוטאז biotinylated (כפי שהומלץ על ידי ספק פרוטאז) או עם פיוז'ן ELP פרוטאז המתאים לאתר פרוטאז תוכנן גנטי בין פפטיד או החלבון וELP.
- אם ישים, הסר את פרוטאז biotinylated באמצעות חרוזים שונה streptavidin (כפי שהומלץ על ידי ספק פרוטאז).
- לגרום למעבר של ELP ביקע ו / או היתוך ELP פרוטאז על ידי תוספת הטיפה חכמה של פתרון 5 M NaCl.
- צנטריפוגה ב RT 10 דקות ב 16,000 X גרם. הערה: גלולה ELP צריכה להיות שנצפתה.
- לאסוף את supernatant וזורקים את כדור ELP. Dialyze supernatant נגד חיץ רצוי או להשתמש במסנן צנטריפוגלי לבצע חילופי חיץ על מנת להסיר את ריכוז מלח הגבוה מהפפטיד הטהור או פתרון חלבון.
- לאשר את המחשוף של פפטיד בחינם או חלבון מתג ELP ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide נתרן גופרתי dodecyl (SDS-PAGE) המלא.
5 אפיון:. SDS-PAGE
- הכן דגימות ELP עבור-SDS על ידי ערבוב 10 μl של ELP מדולל במים עם 10 μl של חיץ מדגם המכיל 2-mercaptoethanol. הערה: 40 מיקרוגרם של ELP הוא לעתים קרובות מספיק כדי להעריך את הגודל וטוהר של מוצר ELP.
- דגירה המדגם ב C ° 100 למשך 2 דקות ולאחר מכן לטעון על ג'ל polyacrylamide יחד עם סולם חלבון בגודל מתאים.
- הרץ את הג'ל על 180 V עד הצבע מתקרב לתחתית הג'ל (כ 45 דקות).
- כתםג'ל עם פתרון 0.5 M CuCl 2 במשך 5 דקות, תוך נדנדה. הערה: ELPs בדרך כלל לא דמיינו ידי כתם הכחול מבריק Coomassie, כמו כמה רצפי ELP לא אינטראקציה עם הצבע הזה. כחול מבריק Coomassie אינטראקציה בעיקר עם שאריות ארגינין ואינטראקציה חלשה עם שאריות-היסטידין האחר בסיסי ושאריות טריפטופן-ליזין וארומטי, טירוזין, פנילאלנין ו26. כך ELPs והתכת פפטיד או ELP החלבון יכולים להיות מוכתמת בכחול מבריק Coomassie רק אם הרצף העיקרי שלהם כולל מספר מספיק של שאריות הספציפיות אלה.
- ודא שMW של להקת ELP תואם לזה של MW התיאורטי צפוי מגן ELP ושאין להקות מזהמים זרות נוכחים. הערה: ELPs חלק להגר עם MW לכאורה גבוה יותר עד 20% מ MW הצפוי 9, 27.
6 אפיון:. Desorption לייזר בסיוע מטריקס /יינון זמן של טיסת ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF-MS)
- הכן את פתרון ELP ב50% אצטוניטריל מימיים המכיל 0.1% חומצת trifluoroacetic כדי להשיג ריכוז ELP של כ 25 מיקרומטר. הערה: פתרון זה צריך להיות חופשי של מלח, כך ELP חייב להיות dialyzed נגד H 2 O הבא טיהור.
- הכן פתרון מטריצה של חומצת sinapinic רוויה ב50% אצטוניטריל מימיים המכיל 0.1% חומצת trifluoroacetic.
- הוסף 1 μl של פתרון ELP עד 9 μl של פתרון המטריצה כדי להשיג ריכוז ELP של כ 2.5 pmol / μl. הערה: תערובת זו יכולה להיות מדוללת עוד יותר עם פתרון מטריצה כדי לייעל את אות MALDI-TOF.
- הפקדת 1-2 μl תערובת ELP מטריצה על צלחת MALDI מתכת ולתת למקום להתייבש לחלוטין.
- השג 5-10 ספקטרום עם MALDI-TOF כדי לקבוע את המסה לחייב יחס (m / z) של ELP ולהסיק MW המדוד.
7. Characterization: Turbidimetry ופיזור אור דינאמי מתוכנתת טמפרטורה
- לקבוע את t T של ELP ידי turbidimetry מתוכנתת טמפרטורה:
- להכין סדרת דילול (למשל, 5-100 מיקרומטר) של פתרונות ELP במאגר הרצוי.
- באמצעות UV-Vis ספקטרופוטומטר בטמפרטורה מבוקרת, למדוד את הצפיפות האופטית (OD) ב350 ננומטר על פני טווח של טמפרטורות (למשל, 20-80 מעלות צלזיוס) בקצב חימום של 1 ° C / min. הערה: אם אין עלייה בקוטר חיצוני נראית t T עשוי לחרוג ממגבלת הטמפרטורה העליונה של המכשיר. T T לכאורה יכול להיות ירידה על ידי התוספת של NaCl. מתחיל ב 1 M NaCl ולהגדיל בקפיצות של 0.5 M עד מעבר ELP הוא זוהה בטווח טמפרטורות הניתן למדידה.
- ודא הפיכות של מעבר ELP ידי מדידת הירידה בקוטר חיצוני על אותו הטווח של טמפרטורה בקצב קירור של 1 ° C / min.
- לקבוע את t T של ההומופולימר ELP ידי זיהוי הנקודה של פרופיל עכירות הפיתול (OD זמם לעומת טמפרטורה). הערה: טמפרטורה זה יכול להיות מוגדר בקלות מהנגזרת של עקומת OD, שבו הטמפרטורה המתאימה למקסימום של הנגזר מוגדרת כt T. ארכיטקטורות ELP יותר מורכבות יציגו פרופילי עכירות מסובכים יותר וצריכה להיות מנותחות נוסף כמפורט בסעיף 7.2.
- אפיון נוסף של ELPs המציגים תכונות מורכבות יותר תרמית (לדוגמא, קופולימרים diblock ELP עצמיים להרכיב לתוך מיצלות הכדורית) מושגת על ידי פיזור אור הדינמי (DLS):
- הכן את פתרון ELP במאגר הרצוי ולהעביר את הדגימה דרך מסנן עם גודל נקבובית ננומטר 20-450. הערה: הבחירה של גודל נקבובית מסנן תהיה תלויה בנוכחות, הגודל, והיציבות של כל מכלולי ELP בתמיסה. הגודל הנקבובית מסנן האפשרי הקטן ביותר הוא העדיף לחסל את מזהמים, כגוןאבק, הפוגע באיכות של מדידות DLS. יש להשתמש בגודל נקבובית מסנן גדול יותר כאשר התנגדות משמעותית חווה כאשר עובר דרך פתרון ELP גדלים נקבוביות מסנן קטנים יותר.
- מדוד את הרדיוס הידרודינמית (R H) על פני טווח של טמפרטורות שמתאים לאזור של עניין שזוהה בפרופיל העכירות. הערה: יש לי unimers ELP בדרך כלל H R <10 ננומטר, יש לי מכלולי nanoparticle H R ~ 20-100 ננומטר, ויש מצרפים R H> ננומטר 500. כל עלייה בR H צריכה מתאימות לגידול בOD ב 350 ננומטר שנמדד על ידי UV-Vis spectrophotometry כפונקציה של טמפרטורה, שהיא פרופורציונלית לגודל של החלקיקים.
Representative Results
כאן אנו מתארים תוצאות נציג לטיהור והאפיון של homopolymer ELP וקופולימר diblock ELP. בעקבות 24 שעות ביטוי בE. coli, תאים שנאספו על ידי צנטריפוגה וlysed ידי sonication. בדרך כלל, שינוי עדין בצבע מתרחש לאחר sonication, המאשר תמוגה מספיק תאים (איור 1 א). לאחר התוספת של PEI, רכיבים הגנומי ופסולת הסלולר נאספים על ידי צנטריפוגה, הפרדת גלולה גדולה של מזהמים מסיסים מELP המסיסים בsupernatant (איור 1). ELP מטוהר עוד יותר על ידי רכיבה על אופניים הפוכות מעבר (ITC), המנצל את LCST ההתנהגות להפריד ELP ממזהמים הן מסיסים ובלתי מסיסים (איור 2) 28. שלב המעבר של ELP מופעל על ידי התוספת של חום ו / או מלח. תוצאות צנטריפוגה בהיווצרותה של גלולה בחלק התחתון של הצינור שמורכב מELPnd כמה מזהמים בלתי מסיסים (תרשים 1C). זה צעד שמכונה מזהמים מסיסים ספין ומתעלם חמים בsupernatant תוך גלולה ELP נשמרת וresuspended במאגר קר. ELP resolubilized הוא centrifuged שוב ב 4 ° C. זה צעד שמכונה ספין ומתעלם קר גלולה של מזהמים בלתי מסיסים ואילו את supernatant המכיל ELP מסיס נשמרת. חוזר על המחזור לסירוגין ספינים חמים וקרים מגביר את הטוהר של ELP, אבל במחיר של מעט ירידת תשואה, כELP שיורי הוא איבד במהלך כל סיבוב בצינורות צנטריפוגה ועל הטיפים פיפטה ITC.
טיהור מוצלחת של ELPs והתכת ELP פפטיד או חלבון אושר על ידי-SDS. aliquots הקטנים נלקחו לאורך כל תהליך הטיהור להדגים את הטיהור המתקדמת של ELP מE. lysate coli. ELP הוא מתבטא ביתר בה גולמי lysate coli ומזהמים להקטין שנינותהסיבובים הרצופים שעות של ITC (איור 3). ELP מטוהר מופיע כלהקה אחת ליד MW התיאורטי החזוי.
לא ELP T מאופיין turbidimetry מתוכנתת טמפרטורה. פרופיל העכירות של homopolymer ELP מציג גידול חד חד בOD ב 350 ננומטר (כ 2.0 יחידות מעל הבסיס לריכוז ELP של 25 מיקרומטר) (איור 4 א). סריקות עכירות קירור לאשר את האופי הפיך של מעבר ELP כOD חוזר לנקודת התחלה כאשר הטמפרטורה יורדת מתחת לt T (איור 4). קופולימרים diblock ELP תערוכת פרופיל עכירות מורכבים יותר, בהשוואה לhomopolymer ELPs. OD מגביר בדרך כלל ראשון 0.1-0.5 יחידות מעל הבסיס, לאחר שהעליות חדות OD ל2.0 יחידות מעל הבסיס (איור 5 א). מדידות DLS לספק מידע על השינוי בR H ביחס לטמפרטורה, שיתוף rroborating המידע שנצבר מפרופיל העכירות (איור 5).
איור 1. טיהור ELP מוקדמת. לאחר 24 שעות ביטוי, E. coli תאים נאספים על ידי צנטריפוגה וresuspended ב-PBS.) תאים הם lysed ידי sonication, שמלווה בשינוי עדין בצבע כזה שlysate מכהה לאחר sonication. ב ') לאחר תוספת של PEI לרכז מזהמים ה-DNA, lysate הוא centrifuged וגלולה גדולה של מסיסה פסולת מופרדת מELP מסיס בsupernatant. C) מעבר ELP מושרה עם התוספת של חום ו / או מלח וצורות צנטריפוגה גלולה ELP שקופה.ank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. רכיבה על אופניים מעבר הפוך. ELP מטוהר על ידי אמצעים שלה התנהגות LCST ממזהמים הן מסיסים ובלתי מסיסים. החל עם lysate ELP עשיר (1) מעבר ELP מושרה עם התוספת של חום ו / או מלח וELP מופרד על ידי צנטריפוגה (ספין חם) (2). גלולה ELP נשמרת (3 א) ואילו את supernatant המכיל מזהמים מסיסים נמחקת (3 ב). ELP הוא resuspended במאגר קר (4) וcentrifuged שוב ב 4 ° C (ספין קר) (5). גלולה המכילה מזהמים מסיסים נמחקת (6 א) ואילו את supernatant המכיל ELP מסיס נשמר (6 ב). מחזורים לסירוגין ספינים חמים וקרים חוזרים על עצמם עד שיגיעו לטוהר הרצוי, כפי שנקבע עםSDS-PAGE. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. SDS-PAGE ניתוח של מוצרי טיהור ELP. טיהור מוצלחת של ELP אושר על ידי-SDS. ELP ביטוי היתר ניכר בה גולמי lysate coli לאחר sonication (2). לאחר התוספת של PEI וצנטריפוגה ELP המסיסים נשמרת במידה רבה בsupernatant (3), למרות שחלקם ELP הוא אבד את הכדור שנזרק של מזהמים מסיסים (4). Supernatant הבא הספין החם הראשון מכיל רמות משמעותיות של מזהמים מסיסים (5). Supernatant הבא הספין הקר הראשון מציין הפרדה טובה של ELP ממזהמים בלתי מסיסים (6). מחזורים נוספים של (7) וג החםישן ספינים (8) להסיר מזהמים מסיסים ובלתי מסיסים שיורית, בהתאמה, עד (9) וספין קר (10) supernatants החם הסופי התערוכה לא להקות מזהמים חיצוניות, המאשרים את טוהר מספק של מוצר ELP. homopolymer זה ELP, עם רצף של SKGPG-(VGVPG) 80-Y, יש משקל מולקולרי צפוי של 33.37 kDa. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. אפיון ELP homopolymer ידי turbidimetry מתוכנתת טמפרטורה. לא ELP T נקבע על ידי ניטור OD ב 350 ננומטר תוך הגדלת הטמפרטורה בשיעור של 1 ° C / min. תערוכת homopolymers ELP) עלייה חדה באחד OD שdefאינס לא T בניתן ריכוז. B) ההפיכות של מעבר ELP מאומת על ידי ניטור OD ב 350 ננומטר של פתרון 25 μ M תוך הפחתת הטמפרטורה, שבו הפיכות אושר על ידי חזרתו של OD לתחילת מחקר. יש homopolymer ELP זה הרצף SKGPG-(VGVPG) 80-Y. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. אפיון קופולימר diblock ELP ידי turbidimetry מתוכנתת טמפרטורה ופיזור אור דינמי. ELPs שעובר הרכבה עצמית בקנה מידה ננו, כגון קופולימרים ELP diblock עצמיים להרכיב לתוך מיצלות הכדורית, פרופילי עכירות מורכבים יותר תערוכה.
Discussion
ELPs מציע אמצעי זול ונטולת כרומטוגרפיה של טיהור על ידי ניצול של גירוי תגובה שלב ההתנהגות שלהם. גישה זו מנצלת את LCST ההתנהגות של ELPs והתכת פפטיד או חלבון ELP לחסל שני מזהמים מסיסים ובלתי מסיסים לאחר הביטוי של ELPs מקודד גנטי בE. coli. קלות זו של טיהור יכולה לשמש לייצור ELPs עבור מגוון רחב של יישומים, או יכולה להיות מנוצלת לטיהור של פפטידים או חלבונים רקומביננטיים שבELP יכול לשמש תג טיהור שניתן להסיר עם עיבוד פוסט טיהור.
טיהור ELP כרוכה שלבים ראשוניים לlyse E. coli ולהסיר שאריות של תאי גנומי ובלתי מסיסים מlysate התרבות הגולמי (איור 1), ואחריו הסרת מזהמים מסיסים ובלתי מסיסים שיורית על ידי ITC (איור 2). צנטריפוגה לאחר מפעילה את מעבר ELP ידי addition של חום או מלח מפריד ELP ממזהמים מסיסים בsupernatant, בצעד המכונה חם ספין. לאחר resolubilizing ELP, הפתרון הוא centrifuged שוב בטמפרטורה מתחת t T כדי להסיר את גלולה המזהם מסיסה, בצעד המכונה ספין קר. לסירוגין ספינים חמים וקרים משפר את טוהר פתרון ELP עם כל מחזור, במחיר קטן להניב. תשואות טיהור להשתנות תלוי לא ELP T, האורך, ופפטידים או חלבונים התמזגו. בדרך כלל, פרוטוקול זה תשואות של ELP מטוהר 100 מ"ג לליטר E. תרבות coli, לעומת זאת תשואות יכולות להגיע עד 500 מ"ג / ל ' טוהר הסופי של מוצר ELP אושר על ידי-SDS (איור 3). מגה וואט של ELP המטוהרים צריכים להתאים עם MW התיאורטי המקודד על ידי גן ELP מקרוב. עם זאת, כמה ELPs להעביר ב- SDS עם MW לכאורה גבוה יותר עד 20% מ MW הצפוי 9, 27. ניתוח מדויק יותר של ELPיכול להיות מושגת על ידי MW MALDI-TOF-MS, אשר יכול גם לספק מידע נוסף על טוהר של מוצר ELP יחד עם טכניקות אנליטיות המאונכות כגון כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC).
לאחר טיהור, לא ELP T נמדד על ידי turbidimetry מתוכנתת טמפרטורה. טכניקה זו מנטרת את OD של פתרון ELP בעוד הטמפרטורה היא גדלה. T T הוא ריכוז תלוי ולכן רצוי לאפיין סדרת ריכוז רלוונטית ליישום המיועד של ELP. לELP homopolymers פרופיל העכירות מציג גידול חד חד שמתאים למעבר ELP מאגרגטים למיקרון בקנה מידת unimer (איור 4 א). T T מוגדר כטמפרטורה המתאימה לנקודת הפיתול בפרופיל העכירות, בדיוק כפי שנקבעה המקסימום של הנגזרת הראשונה של OD ביחס לטמפרטורה. ההפיכות שלשלב מעבר ELP אושר על ידי ירידה בOD לבסיס ככל שהטמפרטורה יורדת מתחת לt T (איור 4). פרופיל העכירות עם גדלה או קטן של רמפות טמפרטורה יהיה שונה בגודל וקינטיקה עקב שיקוע של coacervates ELP וhysteresis המשתנה של resolubilization ELP. התכה פפטיד או ELP החלבון דומה להפגין התנהגות LCST בדרך זו, בי פפטיד או החלבון התמזגו ELP משפיע t T. לחלבון ELP התכה המעבר הוא הפיך מתחת לטמפרטורת ההתכה של החלבון. בעוד turbidimetry מתוכנתת טמפרטורה היא שיטה מצוינת לאפיון התרמי הראשוני של מוצרי ELP, טכניקות חלופיות, כגון פער הסריקה calorimetry (DSC), יכול לשמש גם כדי למדוד את לא ELP T.
ELPs עם התנהגויות תרמית תערוכת ארכיטקטורות מורכבות יותר מורכבות יותר שיכול גם להיות מאופיינת בטמפרטורת prograturbidimetry mmed. קופולימרים diblock ELP, למשל, מציגים פרופיל עכירות אופייני המתאים להרכבה העצמית מופעל על הטמפרטורה שלהם למיצלות הכדורית בטמפרטורת micellization הקריטית שלהם. לקופולימרים diblock ELP כגון OD מגדיל 0.1-0.5 יחידות מעל בסיס המציינות את המעבר מunimers למיצלות, לאחר שעלייה חדה בOD (עד 2.0 יחידות מעל הבסיס) בטמפרטורה גבוהה יותר מצביעה על היווצרות של מיקרון בקנה מידה בדרך כלל ראשון אגרגטים (איור 5 א). מידע נוסף על מבני ELP עצמיים התאסף-מופעל על טמפרטורה שהושג עם DLS, טכניקה המודדת את H R של מכלולי ELP בתמיסה. שינויים בR H מסכימים עם שינויים בOD נמדדו עם turbidimetry (איור 5) באופן הדוק. unimers ELP בדרך כלל מפגין H R <10 ננומטר בעוד מכלולי nanoparticle תערוכת H R ~ 20-100 ננומטר ואגרגטים תערוכה H R 17, 23, 29.
בשל tunability של תכונות תרמיות ELP, מגוון של T T מתקבל על ידי עיצובי ELP שונים. חשוב לזכור כי לא T הגלום תשפיע על אופטימיזציה של פרוטוקול הטיהור עבור כל ELP, שבו ים לא T נמוך מאוד או גבוה ידרוש רוב השינוי לפרוטוקול הסטנדרטי הזה. ELPs עם מעבר לטמפרטורות גבוהות במיוחד עלולה להיות בלתי מתאים לטיהור עם גישה זו. אם העיצוב של ELPs רומן והתכת פפטיד או ELP החלבון עלול לפגוע בתגובת התרמית של ELP, תג היסטידין פשוט יכול להיכלל לטיהור חלופית על ידי זיקת כרומטוגרפיה מתכת משותקת. בנוסף,מאפיינים של רצף ELP עשויים לדרוש שינוי של פרוטוקול זה אם שאריות האורח טעונה. מניפולציה של ה-pH החיץ יכולה לשמש כאמצעי לשנות את תשלום הכולל של ELP במאמץ לחסל את האינטראקציות אלקטרוסטטיות עם מזהמים 17. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאים לנסיבות המיוחדות של התכה ELP עם פפטידים וחלבונים כאשר אמצעים מתאימים ננקטו כדי להבטיח את תהליך הטיהור לא להפריע לפעילות של מחצית התמזגו. הערות לאורך כל הפרוטוקול על שינויים כאמור לשרת לכוון את הטיהור של ELPs שעלול להציג אתגרים אלה ביחס לt T, פריצה, או חששות היתוך.
טיהור ELPs באמצעות LCST התנהגותם מציגה גישה פשוטה ונטולת כרומטוגרפיה לטהר את רוב ELPs והתכת פפטיד או ELP החלבון מתבטא בE. coli. הפרוטוקול סיכם כאן מתיר o טיהורו ELPs ביום אחד תוך שימוש בציוד המשותף למרבית מעבדות הביולוגיה. הקלות של טיהור ELPs והשילובים שלהם, אנו מקווים, לעודד גיוון ההולך וגדל של עיצובי ELP עבור יישומים חדשים במדע חומרים, ביוטכנולוגיה, ורפואה.
Disclosures
יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי Research Triangle MRSEC של NSF (DMR-1,121,107).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET-24a(+) pET-25b(+) |
Novagen | 69749-3 69753-3 |
T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25). |
| Ultra BL21 (DE3) competent cells | Edge BioSystems | 45363 | Competent E. coli for recombinant protein expression. |
| Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media | MO BIO Laboratories | 12105 | Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression. |
| Phosphate buffered saline (PBS) tablet | Calbiochem | 524650 | These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C. |
| Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) | MP Biomedicals | 195444 | PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O. |
| Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 ml | Thermo Scientific | 3138-0050 | These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml. |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) | Thermo Scientific | 20491 | A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O. |
| Ready Gel Tris-HCl gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl | Bio-Rad Laboratories | 161-1105 | These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs. |
| Cupric chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C454-500 | A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCl polyacrylamide gels. |
| Anotop 10 syringe filter: 0.02 μm 0.1 μm 0.2 μm |
Whatman | 6809-1002 6809-1012 6809-1022 |
These 10-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements. |
| Millex-HV filter: 0.45 μm |
EMD Millipore | SLHVX13NK | These 13-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements. |
References
- Urry, D. W. Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers. J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).
- Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris. Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).
- Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).
- Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris. Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).
- Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).
- Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants. Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).
- Conrad, U., et al. ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock. Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).
- Kaldis, A., et al. High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures. Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).
- McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes. Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).
- Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of 'smart' protein polymers. Nat Mater. 10, 141-148 (2011).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).
- Urry, D. W., et al. Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity. Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).
- Urry, D. W. The change in Gibbs free energy for hydrophobic association - Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions. Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).
- Cho, Y., et al. Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides. The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).
- Kim, B., Chilkoti, A. Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding. J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).
- Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).
- Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).
- MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers. Biopolymers. 94, 60-77 (2010).
- McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).
- Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. , (2010).
- Shamji, M. F., et al. Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic. Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).
- Hassouneh, W., et al. Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers. Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).
- Lan, D. M., et al. An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases. Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).
- Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides. Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
- McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).
- McDaniel, J. R., et al. Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation. Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).
