Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ikke-kromatografisk rensing av rekombinant Elastin-lignende polypeptider og deres Fusjoner med peptider og proteiner fra Published: June 9, 2014 doi: 10.3791/51583
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Research Triangle MRSEC, Duke University
* These authors contributed equally

Summary

Elastin-lignende polypeptider er stimulus-responsive biopolymerer med applikasjoner som spenner fra rekombinant protein rensing til levering av legemidler. Denne protokollen beskriver rensingen og karakteriseringen av elastin-lignende polypeptider og deres peptid-eller protein-fusjoner fra Escherichia coli ved hjelp av sin nedre kritiske løsningstemperaturen faseovergang oppførsel som et enkelt alternativ til kromatografi.

Abstract

Elastin-lignende polypeptider er repeterende biopolymerer som viser en lavere kritisk løsning temperatur faseovergangen atferd, eksisterende som løselig unimers under et karakteristisk overgang temperatur og aggregere i mikron-skala coacervates over deres overgang temperatur. Utformingen av elastin-lignende polypeptider på genetisk nivå tillater nøyaktig kontroll av deres sekvens og lengde, som bestemmer deres termiske egenskaper. Elastin-lignende polypeptider brukes i en rekke applikasjoner, inkludert biosensing, tissue engineering, og levering av legemidler, der overgangen temperatur og biopolymer arkitektur av ELP kan være innstilt for den spesifikke anvendelsen av interesse. Videre tillater den nedre kritiske temperatur løsningen faseovergangs oppførselen til elastin-lignende polypeptider deres rensing ved deres termiske respons, slik at de selektivt reversibel koaguleringsteknikk og resolubilization tillater fjerning av både løselige og uløselige forurensningers følgende uttrykk i Escherichia coli. Denne tilnærmingen kan brukes for rensing av elastin-lignende polypeptider alene eller som et renseverktøy for peptid-eller protein-fusjoner hvor rekombinante peptider eller proteiner genetisk vedføyde til elastin-lignende polypeptid-lapper kan bli renset uten kromatografi. Denne protokollen beskriver rensing av elastin-lignende polypeptider og deres peptid-eller protein-fusjoner og diskuterer basiskarakteriseringsteknikker for å bedømme den termiske oppførselen av rene elastin-lignende polypeptid-produkter.

Introduction

Elastin-lignende polypeptider (elps) er biopolymerer sammensatt av gjentakende pentapeptide VPGXG der X, gjesten rester, er enhver aminosyre unntatt prolin. Elps utstillings nedre kritiske temperatur-løsning (LCST) faseovergangs oppførsel, slik at en homogen ELP løsningen vil skille seg i to faser ved oppvarming til sin LCST, som vanligvis blir kalt inverse overgangstemperatur (T t) i ELP litteratur 1.. De to faser består av en meget fortynnet ELP Globule fase og en ELP rik sediment fase. ELP rik sedimentet er dannet på en kort tidsskala på aggregering av ELP kjedene i mikron-størrelse partikler som senere vokser sammen. Dette skjer over et område på noen få grader Celsius, og er typisk reversible, som en homogen oppløsning gjenvinnes ved retur til en temperatur under T t.

Elps er vanligvis syntetisert i Escherichia coli (E. coli) from en kunstig gen som ligeres til et ekspresjonsplasmid. Dette plasmid ble så transformert inn i en E. coli cellelinje som er optimal for proteinekspresjon. Vi har utelukkende brukt til T7-lac pET vektoren system for ekspresjon av et stort utvalg av elps i E. coli, selv om andre ekspresjonssystemer i gjær 2-4, sopp 5, og plantene 6-8 har også blitt benyttet av andre forskere. En rekke tilnærminger eksisterer for å genetisk konstruere repetitive ELP gener, inkludert rekursiv retnings ligation (RDL) 9, rekursiv retnings ligation av plasmid rekonstruksjon (pre-RDL) 10, og overlapper forlengelse rullende sirkel forsterkning (OERCA) 11. Evnen til å konstruere elps på genetisk nivå gir mulighet til å bruke rekombinante DNA-teknikker for å lage elps med forskjellige arkitekturer (f.eks, mono, diblocks, triblocks, etc.), som kan bli ytterligere føyes med funksjonellepeptider og proteiner. Kontroll på genetisk nivå sikrer også at hver ELP uttrykkes med den nøyaktige lengde og sammensetning diktert av dens genetiske plasmid-mal, noe som gir perfekt monodisperse biopolymer produkter.

De termiske egenskapene til hver ELP avhenge av parametere iboende til biopolymer slik som molekylvekt (MW) og sekvens, så vel som ytre faktorer, inkludert konsentrasjonen i oppløsningen, og nærværet av andre cosolutes, for eksempel salter. Lengden av ELP 12 og dens gjest rester sammensetning 1, 13, 14 er to ortogonale parametre i ELP utforming som kan brukes til å kontrollere T-T, hvor gjeste hydrofobe rester og lengre kjedelengder gir lavere T t s, mens hydrofile gjesteRester og kortere kjedelengde resultere i høyere T t s. ELP konsentrasjonen er omvendt relatert til T-t, hvor oppløsninger av greater ELP konsentrasjon har lavere T t s 12. Typen og konsentrasjonen av salter også påvirke ELP T t, hvor effekten av salter følger Hofmeister-serien 15.. Kosmotropic anioner (Cl - og høyere på Hofmeister serien) senke ELP T t og økende saltkonsentrasjon forsterker denne effekten. Disse indre og ytre parametere kan være innstilt til å få termisk oppførsel innenfor et mål temperaturområde som er nødvendig for en bestemt anvendelse av en ELP.

Stimulus-responsive atferd elps er nyttig for en rekke ulike bruksområder, inkludert biosensing 16, 17, tissue engineering 18, og levering av legemidler 19, 20. I tillegg, når elps er kondensert til peptider eller proteiner ved genetisk nivå, kan ELP tjene som en enkel rensing kode for å tilveiebringe en billig fremgangsmåte for satsvis rensing av rekombinant peptidevann eller proteiner som krever ingen kromatografi 21. Modifikasjon av renseprosessen sikrer at aktiviteten av peptidet eller proteinet fusjonert til ELP opprettholdes. Peptid eller protein ELP fusjoner kan bli renset for anvendelser der ELP tag er nyttig 22, 23 eller alternativt når fritt peptid eller protein er nødvendig, kan en protease anerkjennelse stedet settes inn mellom peptid eller protein og ELP. Fjerning av ELP koden kan da oppnås ved fordøyelsen med gratis protease eller en protease ELP fusjon, hvor sistnevnte gir den ekstra enkel behandling som en siste runde med ELP rensing kan skille ELP tag og protease ELP fusjon fra målet peptid eller protein i et enkelt trinn 24, 25. Den følgende protokoll beskriver rensing fremgangsmåte for elps og peptid-eller protein-fusjoner ELP ved hjelp av sine termiske egenskaper, og drøfter grunnleggende teknikker for å karakterisereden termiske responsen ELP produkter.

Protocol

En. ELP Expression

  1. Vaksinere 3 ml sterile Terrific Buljong media med en DMSO lager eller agar plate koloni av E. coli er egnet for å uttrykke proteiner som inneholder den ønskede ELP-kodende plasmid under kontroll av T7-lac-promotoren. Til den aktuelle antibiotikum og inkuber ved 37 ° C over natten (O / N) med kontinuerlig risting ved 200 rpm.
  2. Tilsett 1 ml av O / N kultur til en L av Terrific Buljong sterile medier i en 4-L kolbe. Til den aktuelle antibiotikum og inkuberes ved 37 ° C i 24 timer med kontinuerlig risting ved 200 rpm. NB: "leaky" baseline ekspresjon sett med T7-lac-promotoren er tilstrekkelig for ekspresjon på høyt nivå av mange elps dersom kulturen inkuberes i 24 timer. Imidlertid kan en mer konvensjonell metode anvendes, karakterisert ved at proteinet uttrykket er ytterligere indusert ved tilsetning av 0,2 til 1 mM isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) når den optiske tetthet av kulturen når 0,6. Overfør kultur fra 4-L kolbe til en 1-L sentrifugeflaske og sentrifugert ved 4 ° C i 15 min ved 2000 x g.
  3. Kast supernatanten. MERK: Hvis mer enn en L av kulturen er vokst de kan kondenseres ved å legge til en annen liter av kultur til pellets og gjenta trinn 1.3. Opp til 2 l kultur kan være kondensert til en enkelt-celle-pellet.
  4. Resuspender pellet i fosfatbufret saltvann (PBS), vann, eller en annen ønsket buffer for å oppnå 45 ml av cellesuspensjonen, og overføring til et 50 ml konisk rør.

2 ELP rensing:. Innledende trinn og første runde av Inverse Transition Sykling

  1. Sonicate cellepelleten resuspendert i totalt 9 min i sykluser på 10 sek "på" og 20 sek "av" ved en utgangseffekt på 85 V, samtidig som prøven på is. Kort tillate prøven å avkjøles på is, og deretter gjenta 9 min syklus en gang til. MERK: Hvis ELP er forventet å ha en svært lav T t t.
  2. Overfør lysatet til en 50 ml rundbunnet sentrifugerør.
  3. Tilsett 2 ml av 10% (w / v) polyethylenimin (PEI) for hver liter av kultur og rist for å blande. MERK: PEI er et positivt ladet polymer som hjelpemidler i kondensasjon av negativt ladede genetiske forurensninger. Ikke gjør dette trinnet hvis ELP er negativt ladet, som PEI kan også kondensere og fjerne ELP produktet.
  4. Sentrifuger ved 4 ° C i 10 min ved 16 000 x g.
  5. Overfør supernatanten til et rent 50 ml rundbunnet sentrifugerør og kast pelleten.
  6. Valgfri "bake out" trinn: Inkuber prøven ved 60 ° C i 10 minutter for å denaturere proteinurenheter og deretter overføre til 4 ° C eller på is inntil ELP er fullstendig resolubilized. Sentrifuger prøven ved 4 ° C i 10 min ved 16 000 x g. Overfør supernatanten til et clEAN 50 ml runde bunnen sentrifugerør og forkaste pellet. MERK: Ikke gjør dette trinnet hvis et peptid eller protein er smeltet til ELP og forventes å denaturere i tilstanden til forhøyet varme. Dette kan føre til ELP overgangen til å bli varme-irreversibelt eller kan ødelegge aktiviteten av det smeltede del.
  7. Fremkall det ELP overgang med tillegg av krystallinsk NaCl (høyst 3 M). Alternativt kan natrium-citrat (som ikke overskrider 0,3 M) anvendes for elps som har høyere T t s eller lave utbytter. MERK: Oppløsningen skal vende regn når saltet er oppløst, noe som indikerer faseseparasjon av ELP fra oppløsningen. Meget hydrofile elps med høy T t s kan kreve en viss grad av varme, i kombinasjon med tilsetning av salt, for å indusere faseseparering av ELP i denne foreløpige induksjon av ELP overgangen.
  8. Sentrifuger ved værelse temperatue (RT) i 10 min ved 16 000 xg (hot sentrifugering). MERK: En ELP pellet bør be observert, hvis størrelse avhenger uttrykk utbytte av ELP. Dette ELP pellet kan ved første vises ugjennomsiktig, men etter avkjøling det vil dukke gjennomskinnelig og kan være brun i fargen. ELP pellet vil bli mer fargeløs som rensing provenyet og forurensninger fjernes.
  9. Kast supernatanten og tilsett 1-5 ml ønskede buffer til pelleten. Resuspender pelleten ved pipettering eller sette røret til å rotere ved 4 ° C. NB: Det nødvendige volum av buffer, vil avhenge av størrelsen på ELP pellet, og dermed utbyttet av ELP ekspresjon, hvor en tilstrekkelig mengde av buffer skal tilsettes for å tillate resolubilization av ELP pellet. Elps med høyt innhold cystein utbytte av rensing i vann med 10 mM Tris (2-karboksyetyl) fosfin-hydroklorid (TCEP-HCI) ved pH 7 for å fjerne disulfid-interaksjoner med forurensende proteiner. Elps med høy charge innholdet utbytte av rensing ved en pH justert til å nøytralisere deres ladning og redusere electrostatic interaksjoner med forurensende proteiner.
  10. Overfør resuspendert ELP-løsning i en ml alikvoter til rene 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  11. Sentrifuger ved 4 ° C i 10 min ved 16 000 xg (kaldsentrifugering). En liten pellet av uløselige forurensninger bør følges.
  12. Overfør supernatanten til et rent rør og kasser pelleten.

. 3 ELP Rensing: påfølgende rundene av Inverse Transition Sykling

  1. Fremkall det ELP overgang med varme og / eller tilsetning av NaCl. Prøver kan bli inkubert i en varmeblokk eller i et vannbad i 15 min ved en temperatur over T t. Hvis, derimot, er ELP kondensert til et protein (som utelukker bruk av varme), eller hvis den ELP har en høy T t som ikke kan nås med varme alene, en 5 M oppløsning av NaCl kan tilsettes dråpevis for å indusere ELP overgang. MERK: Oppløsningen skal vende regn, noe som indikerer faseseparasjon av ELP fra oppløsningen.
  2. Kast supernatanten, tilsett 500 til 750 mL av ønsket buffer, og resuspender pelleten ved pipettering eller sette røret til å rotere ved 4 ° C.
  3. Sentrifuger ved 4 ° C i 10 min ved 16 000 xg (kaldsentrifugering). En liten pellet av uløselige forurensninger bør følges.
  4. Overfør supernatanten til et rent rør og kasser pelleten.
  5. Gjenta trinn 03.01 til 03.05 fram til ingen forurensning pellet er observert under trinn 3.4.

4. Post-rensing Processing (valgfritt)

  1. Hvis ønskelig, dialyser prøven mot en egnet buffer for å fjerne overskudd av salt fra den rensede ELP-løsning. MERK: elps som skal lyofiliseres bør væredialyseres mot DDH 2 OO / N ved 4 ° C.
  2. Hvis ønskelig, Lyofiliser ELP for langtidslagring ved å fryse løsningen ved -80 ° C i 30 min før lyofilisering O / N. MERK: Lyophilization bør ikke brukes for elps med vedlagte proteiner.
  3. Hvis ønskelig, gjenopprette fri peptid eller protein fra et peptid eller protein ELP fusjon ved å fjerne ELP tag:
    1. Fordøy peptidet eller proteinet ELP fusjon med biotinylert protease (som anbefalt av leverandøren protease) eller med en protease ELP blanding som svarer til den protease-området genetisk konstruert mellom peptidet eller proteinet og ELP.
    2. Hvis det er aktuelt, fjerner biotinylated protease ved hjelp av streptavidin-modifisert perler (som anbefalt av protease leverandør).
    3. Indusere overgang av spaltet ELP-og / eller protease ELP fusjon av dråpevis tilsetning av en 5 M NaCl-løsning.
    4. Sentrifuger ved RT i 10 min ved 16 000 x g. MERK: En ELP pellet bør følges.
    5. Samle supernatanten og kast ELP pellet. Dialyser supernatanten mot en ønsket buffer eller bruke et sentrifugalfilter å utføre en bufferutveksling for å fjerne den høye saltkonsentrasjonen fra det rene peptid-eller proteinløsning.
    6. Bekrefte den fullstendige spalting av fritt peptid eller protein fra den ELP tag av natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE).

5 Karakterisering:. SDS-PAGE

  1. Forbered ELP prøver for SDS-PAGE ved å blande 10 ul av ELP fortynnet i vann med 10 pl prøvebuffer inneholdende 2-merkaptoetanol. MERK: 40 pg av ELP er ofte tilstrekkelig for å evaluere størrelsen og renheten av ELP produktet.
  2. Inkuber prøven ved 100 ° C i 2 min, og deretter lastes på en polyakrylamidgel sammen med en passende størrelse protein stigen.
  3. Kjør gelen ved 180 V inntil fargestoffet nærmer seg bunnen av gelen (ca. 45 min).
  4. Flekkengel med en 0,5 M CuCl 2-oppløsningen i 5 minutter, mens vippe. MERK: Elps er vanligvis ikke visualisert ved Coomassie Brilliant Blue flekken, som noen ELP sekvenser ikke samhandler med dette fargestoffet. Coomassie Brilliant Blue samhandler primært med arginindeler og samhandler svakt med andre grunnleggende rester-histidin og lysin-og aromatiske rester-tryptofan, tyrosin og fenylalanin 26. Dermed elps og peptid eller protein ELP fusjoner kan være farget med Coomassie Brilliant Blue bare hvis deres primære sekvensen inneholder et tilstrekkelig antall av disse spesifikke rester.
  5. Kontroller at MW ELP båndet svarer til den av det teoretiske MW forventet fra ELP-genet, og at ingen uvedkommende forurensnings band er til stede. MERK: Noen elps migrere med et tilsynelatende MW opp til 20% høyere enn forventet MW 9, 27.

6 Karakterisering:. Matrix-assistert Laser desorpsjon /ionisering Time-of-Flight massespektrometri (MALDI-TOF-MS)

  1. Tilbered en ELP-løsning i 50% vandig acetonitril inneholdende 0,1% trifluoreddik-syre for å oppnå en ELP konsentrasjon på omtrent 25 pM. MERK: Denne løsningen bør være fri for salt, så ELP må kunne fjernes ved dialyse mot H 2 O etter rensing.
  2. Tilbered en matrise oppløsning av mettet sinapinic syre i 50% vandig acetonitril inneholdende 0,1% trifluoreddiksyre.
  3. Legg 1 mL av ELP løsningen til 9 mL av matriseoppløsning for å oppnå en ELP konsentrasjon på omtrent 2,5 pmol / pl. NB: Denne blandingen kan bli ytterligere fortynnet med matriseoppløsningen for å optimalisere MALDI-TOF-signal.
  4. Innskudd 1-2 mL av ELP-matrise blandingen på en metall MALDI plate og la stedet tørke helt.
  5. Innhent 5-10 spektra med MALDI-TOF for å bestemme massen for å lade-forhold (m / z) av ELP og utlede målte MW.

7. Characterization: Temperatur-programmert turbidimetri og dynamisk lysspredning

  1. Bestem T t av ELP av temperatur-programmert turbidimetri:
    1. Forbered en fortynning serien (f.eks 5-100 mm) av ELP løsninger i ønsket buffer.
    2. Ved hjelp av en temperaturstyrt UV-Vis spektrofotometer, måle den optiske tetthet (OD) ved 350 nm over et område av temperaturer (for eksempel 20-80 ° C) ved en oppvarmingshastighet på 1 ° C / min. MERK: Hvis ingen økning i OD er sett T t kan overskride den øvre temperaturgrense for instrumentet. Den tilsynelatende t t kan reduseres ved tilsetning av NaCl. Start med 1 M NaCl og øker i trinn på 0.5 M til ELP overgang detekteres i løpet av en målbar temperaturområde.
    3. Verifiserings reversibilitet av ELP overgangen ved å måle reduksjonen i OD over samme spekter av temperatur ved en avkjølingshastighet på 1 ° C / min.
    4. Bestem T t av homopolymer ELP ved å identifisere infleksjonspunktet av turbiditeten profilen (OD plottet mot temperatur). Merk Denne temperatur kan lett defineres av den deriverte av OD-kurve, hvor den temperatur som tilsvarer den maksimale av derivatet er definert som T t. Mer komplekse ELP arkitekturer vil vise mer kompliserte turbiditetsprofiler og bør videre analysert som beskrevet i pkt. 7.2.
  2. Ytterligere karakterisering av elps som viser mer komplekse termiske egenskaper (f.eks ELP diblock kopolymerer som selv samler inn sfæriske miceller) oppnås ved dynamisk lysspredning (DLS):
    1. Forbered en ELP løsning i ønsket buffer og bestå prøven gjennom et filter med en 20-450 nm pore størrelse. MERK: Valg av filter pore-størrelse vil være avhengig av nærværet, størrelsen og stabiliteten av eventuelle ELP sammenstillinger i løsning. Den minste bart filter porestørrelse er foretrukket for å fjerne forurensninger, som f.eksstøv, som reduserer kvaliteten på DLS-målinger. En større filter pore størrelse bør brukes når signifikant motstand oppleves når du passerer en ELP løsning gjennom mindre filter porestørrelser.
    2. Måle den hydrodynamiske radius (R H) over et område av temperaturer som svarer til et område av interesse som er identifisert i turbiditet profilen. MERK: ELP unimers vanligvis har en R H <10 nm, nanopartikkel forsamlinger har en R H ~ 20-100 nm, og tilslag har en R H> 500 nm. Hver økning i R H skulle tilsvare en økning av OD ved 350 nm målt ved UV-Vis-spektrofotometri som en funksjon av temperatur, som er proporsjonal med størrelsen av partikkelen.

Representative Results

Her beskriver vi representative resultater for rensing og karakterisering av en ELP-homopolymer og en ELP diblokk-kopolymer. Etter 24 timers uttrykk i E. coli, blir cellene oppsamlet ved sentrifugering og lysert ved sonikering. Vanligvis oppstår en subtil endring i farge etter lydbehandling, som bekrefter tilstrekkelig cellelyse (figur 1A). Etter tilsetningen av PEI er genomisk komponenter og celle-debris, oppsamlet ved sentrifugering, separering av en stor pellet av uløselige forurensninger fra den oppløselige ELP i supernatanten (figur 1B). ELP blir ytterligere renset ved omvendt overgang sykling (ITC) som utnytter den LCST virkemåten for å separere ELP fra både løselige og uløselige forurensninger (figur 2) 28. Den faseovergangen av ELP utløses ved tilsetning av varme og / eller salt. Sentrifugering resulterer i dannelse av en pellet i bunnen av røret som består av ELP ennd noen uløselige forurensninger (figur 1C). Dette trinn kalles en varm ring Forkaster oppløselige forurensninger i supernatanten mens ELP pellet beholdt og resuspendert i kald buffer. Den resolubilized ELP sentrifugeres igjen ved 4 ° C. Denne trinn-betegnet en kald ring forkaster pellets av uløselige forurensninger mens supernatanten inneholder løselig ELP er beholdt. Gjentatte syklus av alternerende varme og kalde spinn øker renheten av ELP, men på bekostning av lett avtagende utbytte, da rest ELP er tapt under hver ITC runde i sentrifugerør, og på pipettespissene.

Vellykket rensing av elps og peptid-eller protein ELP fusjoner blir bekreftet av SDS-PAGE. Små prøver tatt i løpet av renseprosessen viser den progressive rensing av ELP fra E. coli lysate. ELP er overexpressed i råolje E. coli lysatet og forurensninger redusere viddh suksessive runder med ITC (figur 3). Renset ELP vises som en enkelt bånd nær spådd teoretisk MW.

ELP T t er preget av temperaturprogrammert turbidimetri. Turbiditeten profil av en ELP homopolymer oppviser en eneste kraftig økning i OD ved 350 nm (omtrent 2,0 enheter over utgangsverdien for en ELP-konsentrasjon på 25 pM) (figur 4A). Kjøle turbiditet skanninger bekrefter den reversible natur av ELP overgang som OD returnerer til utgangspunktet når senkes temperaturen til under den T t (Figur 4B). ELP diblokk-kopolymerer oppviser en mer kompleks turbiditet profil, sammenlignet med homopolymer elps. OD typisk første øker til 0,1-0,5 enheter over baseline, etter som OD øker kraftig til 2,0 enheter over baseline (figur 5A). DLS målinger gir informasjon om endringen i R H med hensyn til temperatur, co rroborating den informasjonen han fikk fra turbiditet profilen (Figur 5B).

Figur 1
Figur 1. Foreløpige ELP rensing. Etter 24 timer av uttrykk, E. coli-celler blir oppsamlet ved sentrifugering og resuspendert i PBS. A) Celler blir lysert ved sonikering, som er ledsaget av en liten endring i farge slik at lysatet mørkner etter sonikering. B) Etter tilsetning av PEI til å kondensere DNA-forurensninger, er det lysate sentrifugert og en stor pellet av uoppløselige bestanddeler separeres fra oppløselig ELP i supernatanten. C) Den ELP overgangen er indusert med tilføring av varme og / eller salt-og sentrifugeringsformer av en gjennomskinnelig ELP pellet.ank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 2
Figur 2. Inverse overgangs sykling. ELP renses ved hjelp av dets LCST oppførsel både løselige og uløselige forurensninger. Fra og med den ELP-rik lysat (1) ELP overgangen er indusert med tilføring av varme og / eller salt, og ELP fraskilles ved sentrifugering (hot spin) (2). Den ELP pellet beholdt (3a), mens supernatanten inneholdende oppløselige forurensninger blir forkastet (3b). Den ELP resuspenderes i kald buffer (4), og sentrifugeres igjen ved 4 ° C (kaldt spin) (5). Pelleten som inneholder uoppløselige forurensninger blir forkastet (6a), mens supernatanten inneholdende oppløselige ELP beholdes (6b). Sykluser av alternerende varme og kalde spinn blir gjentatt inntil den ønskede renhetsgrad er nådd, som bestemt medSDS-PAGE. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3. SDS-PAGE-analyse av ELP rensing produkter. Vellykket rensing av en ELP er bekreftet ved hjelp av SDS-PAGE. Overexpressed ELP er tydelig i den rå E. coli lysat etter sonikering (2). Etter tilsetningen av PEI og sentrifuge det oppløselige ELP er i stor grad holdt tilbake i supernatanten (3), selv om noen ELP går tapt i kassert pellet av uoppløselige forurensninger (4). Overstående etter den første varme spin inneholder betydelige nivåer av oppløselige forurensninger (5). Overstående etter den første kalde spin indikerer god separasjon av ELP fra uoppløselige forurensninger (6). Ytterligere sykluser med varm (7), og cold spinner (8) fjerne gjenværende oppløselige og uoppløselige forurensninger, henholdsvis, før endelig varme (9) og kald ring (10) supernatanter oppviser ingen utenforliggende forurensningsbånd, noe som bekrefter en tilfredsstillende renhet av ELP produktet. Dette ELP homopolymer, med en sekvens av SKGPG-(VGVPG) 80-Y, har en forventet molekylvekt på 33,37 kDa. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4 Karakterisering av ELP homopolymer av temperaturprogrammert turbidimetri.. ELP T t er bestemt ved overvåking av OD ved 350 nm, mens økning av temperaturen ved en hastighet på 1 ° C / min. A) ELP homopolymerer utviser en enkelt skarp økning OD som defines deres T t ved en gitt konsentrasjon. B) Reversibiliteten til ELP overgangen er bekreftet ved å måle OD ved 350 nm av en 25 μ M oppløsning mens avtagende temperatur, hvor reversibilitet er bekreftet ved tilbakeføring av den utvendige omkrets til grunnlinjen. Dette ELP homopolymeren har sekvensen SKGPG-(VGVPG) 80-Y. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Karakterisering av ELP diblock copolymer av temperaturprogrammert turbidimetri og dynamisk lysspredning. Elps som gjennomgår nano-skala selvbygging, for eksempel ELP diblock kopolymerer som selv samler inn sfæriske miceller, utstillings mer komplekse turbiditetsprofiler. B) DLS målinger bekrefter virkemåten utledes fra turbiditeten profil for en oppløsning ved 25 uM ved å gi informasjon om endringen i R H med hensyn til temperatur. Her ELP Unimer har en R H ~ 8 nm og micelle har en R H ~ 25 nm. Dette ELP diblock copolymer har sekvensen GCGWPG-(VGVPG) 60 - (AGVPGGGVPG) 30-PGGS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Elps tilby en billig og kromatografi-free hjelp av rensing ved utnyttelse av deres stimulus-responsive faseoppførsel. Denne tilnærmingen utnyttet LCST oppførselen til elps og peptid eller protein ELP fusjoner for å eliminere både løselig og uløselig forurensninger etter uttrykk for genetisk kodet elps i E. coli. Denne lette rensing kan anvendes til å produsere elps for en rekke applikasjoner, eller kan utnyttes for rensing av rekombinante peptider eller proteiner hvori ELP kan fungere som en rense kode som kan fjernes med etter-rensing prosessering.

ELP rensing innebærer innledende trinn for å lysere E. coli og fjerne genomisk og uløselige cellerester fra det rå lysatet kultur (figur 1), etterfulgt av fjerning av resterende oppløselige og uoppløselige forurensninger ved ITC (figur 2). Sentrifugering etter å ha utløst den ELP overgangen ved å tilsettening av varme eller salt skiller ELP fra oppløselige forurensninger i den overliggende, i et trinn betegnet som en varm spinn. Etter resolubilizing ELP, oppløsningen sentrifugeres igjen ved en temperatur under T t for å fjerne uoppløselige forurensninger pellet, i et trinn betegnet som en kaldsentrifugering. Alternerende varme og kalde spinn forbedrer renheten av ELP-løsning med hver syklus, til en liten kostnad å gi etter. Rensing utbytter varierer avhengig av ELP T t, lengde og smeltet peptider eller proteiner. Vanligvis gir denne protokollen 100 mg av renset ELP per liter E. coli kultur, men rentene kan nå opp til 500 mg / L. Den endelige renhet av ELP produktet er bekreftet ved hjelp av SDS-PAGE (figur 3). Den MW av renset ELP bør matche tett med den teoretiske MW kodet av ELP genet. Men noen elps vandrer i SDS-PAGE med en tilsynelatende MW opptil 20% høyere enn de forventede MW 9, 27.. Mer presis analyse av ELPMW kan oppnås ved MALDI-TOF-MS, som også kan gi ytterligere informasjon om renheten av ELP produktet sammen med ortogonale analytiske teknikker som høy ytelse væskekromatografi (HPLC).

Etter rensing blir ELP T t målt ved temperatur-programmert turbidimetri. Denne teknikken overvåker OD av en ELP-løsning mens temperaturen økes. Den T t er konsentrasjonsavhengig, så er det tilrådelig å karakterisere en konsentrasjonsserie som er relevant for den tilsiktede anvendelse av ELP. For ELP homopolymerer turbiditeten profilen oppviser en enkelt skarp økning som svarer til den ELP overgang fra Unimer til mikron-skala aggregater (figur 4A). Den T t er definert som den temperatur som svarer til den infleksjonspunktet i turbiditeten profil, nøyaktig bestemt som maksimum av den første deriverte av OD med hensyn til temperatur. Reversibilitet avELP faseovergangen er bekreftet ved en reduksjon i OD til utgangspunktet som er senket temperatur under T t (Figur 4B). Turbiditeten profil med økende og avtagende temperatur ramper vil variere i omfang og kinetikk på grunn av bosetting av ELP coacervates og variabel hysterese på ELP resolubilization. Peptid-eller protein ELP fusions likeledes oppviser LCST oppførsel på denne måten, der peptidet eller proteinet fusjonert til ELP påvirker T t. For protein ELP fusjoner overgangen er reversibel under smeltetemperaturen for proteinet. Mens temperatur-programmert turbidimetri er en utmerket metode for den første varme karakterisering av ELP-produkter, alternative teknikker, slik som differensial scanning kalorimetri (DSC), kan også brukes til å måle ELP T t.

Elps med mer komplekse arkitekturer utstillings mer kompliserte termiske atferd som kan også være preget av temperatur-programmed turbidimetri. ELP diblock kopolymerer, for eksempel vise en karakteristisk turbiditet profil tilsvarende deres temperatur-utløst selvbygging til sfæriske miceller på deres kritiske micellization temperatur. For slike ELP diblokk-kopolymerer OD typisk først økes 0,1 til 0,5 enheter over grunnlinjen som angir overgangen fra unimers til miceller, hvoretter en kraftig økning i OD (opp til 2,0 enheter over utgangsverdien) ved en høyere temperatur indikerer dannelsen av mikrometer-skala tilslag (Figur 5A). Ytterligere informasjon om temperatur utløst selv-montert ELP strukturer oppnås med DLS, en teknikk som måler R H av ELP forsamlinger i løsningen. Endringer i R H enig tett med endringer i OD målt med turbidimetri (Figur 5B). ELP unimers typisk et R H <10 nm mens nanopartikkel forsamlinger utviser en R H ~ 20-100 nm og aggregater vise en R H 17, 23, 29..

På grunn av den tunability av ELP termiske egenskaper, er en rekke av T-t s oppnådd ved forskjellige ELP utførelser. Det er viktig å huske på at den iboende T t vil påvirke optimalisering av renseprotokoll for hver ELP, hvor ekstremt lav eller høy T t s vil kreve mest modifikasjon til denne standardprotokollen. Elps med ekstremt høye overgangstemperaturer kan være uegnet for rensing med denne tilnærming. Hvis utformingen av romanen elps og peptid eller protein ELP fusjoner kan kompromittere den termiske responsen i ELP, kan en enkel histidin tag inkluderes for alternativ rensing ved immobilisert metall affinitet kromatografi. I tilleggegenskapene til ELP sekvensen kan kreve endring av denne protokollen hvis gjesten rester belastes. Manipulering av buffer pH kan anvendes som en metode for å endre den totale ladning av den ELP i et forsøk på å eliminere elektrostatiske interaksjoner med forurensninger 17. Videre er denne protokoll egnet for det spesielle tilfelle av ELP fusjoner med peptider og proteiner ved passende tiltak iverksettes for å sikre at renseprosessen ikke forstyrre aktiviteten av den kondenserte del. Noter hele protokollen på slike modifikasjoner tjener til direkte rensing av elps som kan presentere disse utfordringene med hensyn til T t, kostnad, eller fusjons bekymringer.

Denne rensing av elps ved hjelp av deres LCST oppførsel presenterer en enkel og kromatografi fritt tilnærming for å rense de fleste elps og peptid eller protein ELP fusjoner uttrykt i E. coli. Protokollen oppsummert her tillater rensing of elps i en enkelt dag ved hjelp av utstyr som er felles for de fleste biologiske laboratorier. Den enkle rensing av elps og deres fusjoner vil, vi håper, oppfordrer en stadig voksende mangfold av ELP design for nye anvendelser innen materialvitenskap, bioteknologi og medisin.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NSFs Research Triangle MRSEC (DMR-1121107).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET-24a(+)
pET-25b(+)		 Novagen 69749-3
69753-3		 T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).
Ultra BL21 (DE3) competent cells Edge BioSystems 45363 Competent E. coli for recombinant protein expression.
Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media MO BIO Laboratories 12105 Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.
Phosphate buffered saline (PBS) tablet Calbiochem 524650 These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C.
Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) MP Biomedicals 195444 PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.
Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 ml Thermo Scientific 3138-0050 These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) Thermo Scientific 20491 A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.
Ready Gel Tris-HCl gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl Bio-Rad Laboratories 161-1105 These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.
Cupric chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) Fisher Scientific C454-500 A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCl polyacrylamide gels.
Anotop 10 syringe filter:
0.02 μm
0.1 μm
0.2 μm		 Whatman 6809-1002
6809-1012
6809-1022		 These 10-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.
Millex-HV filter:
0.45 μm		 EMD Millipore SLHVX13NK These 13-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Urry, D. W. Physical Chemistry of Biological Free Energy Transduction As Demonstrated by Elastic Protein-Based Polymers. J. Phys. Chem. B. 101, 11007-11028 (1997).
  2. Sallach, R. E., Conticello, V. P., Chaikof, E. L. Expression of a recombinant elastin-like protein in pichia pastoris. Biotechnology progress. 25, 1810-1818 (2009).
  3. Schipperus, R., Teeuwen, R. L., Werten, M. W., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secreted production of an elastin-like polypeptide by Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 85, 293-301 (2009).
  4. Schipperus, R., Eggink, G., de Wolf, F. A. Secretion of elastin-like polypeptides with different transition temperatures by Pichia pastoris. Biotechnology progress. 28, 242-247 (2012).
  5. Herzog, R. W., Singh, N. K., Urry, D. W., Daniell, H. Expression of a synthetic protein-based polymer (elastomer) gene in Aspergillus nidulans. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 368-372 (1997).
  6. Conley, A. J., Joensuu, J. J., Jevnikar, A. M., Menassa, R., Brandle, J. E. Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants. Biotechnology and bioengineering. 103, 562-573 (2009).
  7. Conrad, U., et al. ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock. Plant biotechnology journal. 9, 22-31 (2011).
  8. Kaldis, A., et al. High-level production of human interleukin-10 fusions in tobacco cell suspension cultures. Plant biotechnology journal. 11, 535-545 (2013).
  9. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3, 357-367 (2002).
  10. McDaniel, J. R., Mackay, J. A., Quiroz, F. G., Chilkoti, A. Recursive directional ligation by plasmid reconstruction allows rapid and seamless cloning of oligomeric genes. Biomacromolecules. 11, 944-952 (2010).
  11. Amiram, M., Quiroz, F. G., Callahan, D. J., Chilkoti, A. A highly parallel method for synthesizing DNA repeats enables the discovery of 'smart' protein polymers. Nat Mater. 10, 141-148 (2011).
  12. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 5, 846-851 (2004).
  13. Urry, D. W., et al. Temperature of Polypeptide Inverse Temperature Transition Depends on Mean Residue Hydrophobicity. Journal of the American Chemical Society. 113, 4346-4348 (1991).
  14. Urry, D. W. The change in Gibbs free energy for hydrophobic association - Derivation and evaluation by means of inverse temperature transitions. Chem Phys Lett. 399, 177-183 (2004).
  15. Cho, Y., et al. Effects of Hofmeister anions on the phase transition temperature of elastin-like polypeptides. The journal of physical chemistry. B. 112, 13765-13771 (2008).
  16. Kim, B., Chilkoti, A. Allosteric actuation of inverse phase transition of a stimulus-responsive fusion polypeptide by ligand binding. J Am Chem Soc. 130, 17867-17873 (2008).
  17. Hassouneh, W., Nunalee, M. L., Shelton, M. C., Chilkoti, A. Calcium binding peptide motifs from calmodulin confer divalent ion selectivity to elastin-like polypeptides. Biomacromolecules. 14, 2347-2353 (2013).
  18. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1479-1485 (2010).
  19. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides: biomedical applications of tunable biopolymers. Biopolymers. 94, 60-77 (2010).
  20. McDaniel, J. R., Callahan, D. J., Chilkoti, A. Drug delivery to solid tumors by elastin-like polypeptides. Adv Drug Deliv Rev. 62, 1456-1467 (2010).
  21. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. , (2010).
  22. Shamji, M. F., et al. Development and characterization of a fusion protein between thermally responsive elastin-like polypeptide and interleukin-1 receptor antagonist: sustained release of a local antiinflammatory therapeutic. Arthritis Rheum. 56, 3650-3661 (2007).
  23. Hassouneh, W., et al. Unexpected multivalent display of proteins by temperature triggered self-assembly of elastin-like polypeptide block copolymers. Biomacromolecules. 13, 1598-1605 (2012).
  24. Lan, D. M., et al. An improved nonchromatographic method for the purification of recombinant proteins using elastin-like polypeptide-tagged proteases. Analytical Biochemistry. 415, 200-202 (2011).
  25. Bellucci, J. J., Amiram, M., Bhattacharyya, J., McCafferty, D., Chilkoti, A. Three-in-one chromatography-free purification, tag removal, and site-specific modification of recombinant fusion proteins using sortase A and elastin-like polypeptides. Angewandte Chemie. 52, 3703-3708 (2013).
  26. Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).
  27. McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein expression and purification. 7, 51-57 (1996).
  28. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17, 1112-1115 (1999).
  29. McDaniel, J. R., et al. Self-assembly of thermally responsive nanoparticles of a genetically encoded peptide polymer by drug conjugation. Angewandte Chemie. 52, 1683-1687 (2013).

Tags

Molecular Biology elastin-lignende polypeptider lavere kritisk temperatur løsning faseseparasjon inverse overgang sykling protein rensing batch-rensing
Ikke-kromatografisk rensing av rekombinant Elastin-lignende polypeptider og deres Fusjoner med peptider og proteiner fra<em&gt; Escherichia coli</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

MacEwan, S. R., Hassouneh, W.,… More

MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. J. Vis. Exp. (88), e51583, doi:10.3791/51583 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter