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Biology

से पेप्टाइड और प्रोटीन के साथ संयोजक Elastin तरह polypeptides और उनके fusions की गैर chromatographic शोधन Published: June 9, 2014 doi: 10.3791/51583
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Research Triangle MRSEC, Duke University
* These authors contributed equally

Summary

Elastin तरह polypeptides पुनः संयोजक प्रोटीन शुद्धि से दवा वितरण को लेकर आवेदन के साथ प्रोत्साहन उत्तरदायी biopolymers हैं. इस प्रोटोकॉल क्रोमैटोग्राफी करने के लिए एक सरल विकल्प के रूप में उनकी कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान चरण संक्रमण व्यवहार का उपयोग कोलाई से इलास्टिन तरह polypeptides और उनके पेप्टाइड या प्रोटीन fusions की शुद्धि और लक्षण वर्णन का वर्णन करता है.

Abstract

Elastin तरह polypeptides एक विशेषता संक्रमण तापमान नीचे के रूप में घुलनशील युनिमर्स मौजूदा और उनके संक्रमण तापमान ऊपर माइक्रोन पैमाने coacervates में कुल एक कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान चरण संक्रमण व्यवहार है कि प्रदर्शन के दोहराव biopolymers हैं. आनुवंशिक स्तर पर इलास्टिन तरह polypeptides के डिजाइन उनकी थर्मल गुण पैदा करती है जो उनके अनुक्रम और लंबाई, सटीक नियंत्रण के लिए परमिट. Elastin तरह polypeptides biosensing, ऊतक इंजीनियरिंग, और ELP के संक्रमण के तापमान और biopolymer वास्तुकला ब्याज की विशेष आवेदन के लिए देखते जा सकता है, जहां दवा वितरण, सहित आवेदन की एक किस्म में उपयोग किया जाता है. इसके अलावा, इलास्टिन तरह polypeptides के कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान चरण संक्रमण व्यवहार उनके थर्मल प्रतिक्रिया द्वारा उनकी शुद्धि की अनुमति देता है उनके चयनात्मक अंबर और resolubilization की अनुमति देता है कि इस तरह दोनों घुलनशील और अघुलनशील संदूषक को हटानेएस कोलाई में अभिव्यक्ति निम्नलिखित. यह दृष्टिकोण इलास्टिन तरह polypeptides अकेले या आनुवंशिक रूप इलास्टिन तरह पॉलीपेप्टाइड टैग के साथ जोड़ दिया पुनः संयोजक पेप्टाइड या प्रोटीन क्रोमैटोग्राफी बिना शुद्ध किया जा सकता है, जहां पेप्टाइड या प्रोटीन fusions के लिए एक शुद्धि उपकरण के रूप में की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल इलास्टिन तरह polypeptides और उनके पेप्टाइड या प्रोटीन fusions की शुद्धि का वर्णन करता है और शुद्ध इलास्टिन तरह पॉलीपेप्टाइड उत्पादों की थर्मल व्यवहार का आकलन करने के लिए बुनियादी लक्षण वर्णन तकनीक पर चर्चा.

Introduction

Elastin तरह polypeptides (ELPs) एक्स, अतिथि छाछ, प्रोलाइन को छोड़कर किसी भी एमिनो एसिड है जहां दोहराई pentapeptide VPGXG से बना biopolymers हैं. ELPs प्रदर्शनी कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST) चरण संक्रमण व्यवहार, एक सजातीय ELP समाधान सामान्यतः ELP साहित्य 1 में उलटा संक्रमण तापमान (टी टी) कहा जाता है जो अपने LCST, हीटिंग पर दो चरणों में अलग होगा कि इस तरह के. दो चरणों में एक बहुत ही पतला ELP छोटा गोला चरण और एक ELP अमीर तलछट चरण से बना रहे हैं. ELP अमीर तलछट बाद में संगठित होना कि माइक्रोन आकार के कणों में ELP श्रृंखला के एकत्रीकरण पर एक छोटी timescale पर बनाई है. यह व्यवहार कुछ डिग्री सेल्सियस की एक सीमा से अधिक होता है और एक सजातीय समाधान टी टी नीचे के तापमान को लौटने पर बरामद किया है, जैसा कि आम तौर पर पलटवाँ है.

ELPs आमतौर पर fro Escherichia कोलाई (ई. कोलाई) में संश्लेषित कर रहे हैंएक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में ligated है कि एक कृत्रिम जीन एम. यह प्लाज्मिड तो एक ई. में तब्दील हो जाता है प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इष्टतम है कि कोली सेल लाइन. हम विशेष रूप से ई. में ELPs की एक विशाल विविधता की अभिव्यक्ति के लिए T7-लाख पीईटी वेक्टर प्रणाली का इस्तेमाल किया है कोलाई, खमीर 2-4, कवक 5, और पौधों 6-8 में अन्य अभिव्यक्ति सिस्टम भी अन्य जांचकर्ताओं द्वारा उपयोग किया गया है. दृष्टिकोण की संख्या आनुवंशिक रूप से पुनरावर्ती दिशात्मक बंधाव (RDL) 9, प्लाज्मिड पुनर्निर्माण (पूर्व RDL) 10 से पुनरावर्ती दिशात्मक बंधाव सहित दोहराए ELP जीन का निर्माण करने के लिए मौजूद हैं, और विस्तार रोलिंग चक्र प्रवर्धन (OERCA) 11 ओवरलैप. आनुवंशिक स्तर पर ELPs इंजीनियर की क्षमता आगे कार्यात्मक के साथ संलग्न किया जा सकता है जो आर्किटेक्चर की एक किस्म (जैसे, monoblocks, diblocks, Triblocks, आदि) के साथ ELPs बनाने के लिए पुनः संयोजक डीएनए तकनीक का उपयोग करने का अवसर देता हैपेप्टाइड्स और प्रोटीन. आनुवंशिक स्तर पर नियंत्रण भी प्रत्येक ELP पूरी monodisperse biopolymer उत्पाद उपलब्ध कराने, सटीक लंबाई और इसकी आनुवंशिक प्लाज्मिड टेम्पलेट से तय रचना के साथ व्यक्त किया है कि यह सुनिश्चित करता है.

प्रत्येक ELP के तापीय गुणों ऐसी अपनी आणविक वजन (मेगावाट) और अनुक्रम, साथ ही इसके समाधान में एकाग्रता और लवण जैसे अन्य cosolutes, की उपस्थिति सहित बाह्य कारकों के रूप में biopolymer को आंतरिक मापदंडों पर निर्भर करते हैं. ELP 12 और उसके अतिथि अवशेषों रचना की लंबाई 1, 13, 14 हाइड्रोफोबिक अतिथि अवशेषों और अब श्रृंखला लंबाई कम टी टी एस में परिणाम जहां टी टी, नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ELP डिजाइन में दो orthogonal मापदंडों, जबकि हाइड्रोफिलिक हैं अतिथि अवशेषों और छोटे श्रृंखला लंबाई उच्चतर टी टी एस में परिणाम. ELP एकाग्रता inversely टी टी, जीआर की जहां समाधान से संबंधित हैभक्षक ELP एकाग्रता कम टी टी एस 12 है. नमक के प्रकार और एकाग्रता भी लवण का असर Hofmeister श्रृंखला 15 इस प्रकार है जहां ELP टी टी, प्रभावित करते हैं. Kosmotropic anions (CL - और Hofmeister श्रृंखला पर उच्च) ELP टी टी कम और बढ़ती नमक एकाग्रता इस प्रभाव को बढ़ाता है. इन आंतरिक और बाह्य मापदंडों एक ELP की एक विशेष आवेदन के लिए आवश्यक है कि एक लक्ष्य तापमान सीमा के भीतर थर्मल व्यवहार प्राप्त करने के लिए देखते जा सकता है.

ELPs की उत्तेजना जिम्मेदार व्यवहार biosensing 16, 17, ऊतक इंजीनियरिंग 18, और दवा वितरण 19, 20 सहित आवेदन की एक विविध रेंज के लिए उपयोगी है. ELPs आनुवंशिक स्तर पर पेप्टाइड्स या प्रोटीन के लिए जुड़े हुए हैं ही, जब ELP पुनः संयोजक पीईपी की शुद्धि के लिए एक सस्ती बैच विधि प्रदान करने के लिए एक सरल शुद्धि टैग के रूप में सेवा कर सकते हैंकोई क्रोमैटोग्राफी 21 की आवश्यकता है कि ज्वार या प्रोटीन. शुद्धिकरण की प्रक्रिया के संशोधन ELP के लिए जुड़े हुए पेप्टाइड या प्रोटीन की गतिविधि को बनाए रखा है कि यह सुनिश्चित करता है. पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions ELP टैग 22, 23 या वैकल्पिक रूप से, मुफ्त पेप्टाइड या प्रोटीन की आवश्यकता होती है, जब एक प्रोटीज मान्यता साइट पेप्टाइड या प्रोटीन और ELP के बीच डाला जा सकता है उपयोगी है जिसमें अनुप्रयोगों के लिए शुद्ध किया जा सकता है. ELP टैग को हटाने की प्रक्रिया मुक्त प्रोटीज या बाद के लक्ष्य पेप्टाइड या से ELP टैग और प्रोटीज ELP फ्यूजन अलग नहीं कर सकता ELP शुद्धि के अंतिम दौर के रूप में प्रसंस्करण के अतिरिक्त आसानी प्रदान करता है, जहां एक प्रोटीज ELP संलयन, साथ पाचन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है एक भी कदम 24, 25 में प्रोटीन. निम्नलिखित प्रोटोकॉल उनके तापीय गुणों के माध्यम से ELPs और पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions के लिए शोधन प्रक्रिया का वर्णन और निस्र्पक के लिए बुनियादी तकनीकों की चर्चाELP उत्पादों की थर्मल प्रतिक्रिया.

Protocol

1. ELP अभिव्यक्ति

  1. एक DMSO के शेयर या ई. की अगर प्लेट कॉलोनी साथ बाँझ भयानक रसा मीडिया के 3 मिलीलीटर टीका लगाना T7-लाख प्रमोटर के नियंत्रण में वांछित ELP एन्कोडिंग प्लाज्मिड होता है कि प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त कोलाई. उचित एंटीबायोटिक जोड़ें और निरंतर 200 rpm पर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात (ओ / एन) में सेते हैं.
  2. एक 4 एल कुप्पी में भयानक रसा बाँझ मीडिया का 1 एल ओ / एन संस्कृति के 1 मिलीलीटर जोड़ें. उचित एंटीबायोटिक जोड़ें और निरंतर 200 rpm पर झटकों के साथ 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. नोट: संस्कृति 24 घंटे के लिए incubated है अगर T7-लाख प्रमोटर के साथ देखा "टपका हुआ" आधारभूत अभिव्यक्ति कई ELPs के उच्च स्तर अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त है. संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व 0.6 तक पहुँच जाता है जब प्रोटीन अभिव्यक्ति आगे 0.2-1 मिमी isopropyl बीटा-D-thiogalactoside (IPTG) के अलावा द्वारा प्रेरित है जिसमें हालांकि, एक अधिक परंपरागत दृष्टिकोण, इस्तेमाल किया जा सकता है. 2,000 x जी पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 1 एल अपकेंद्रित्र बोतल और अपकेंद्रित्र से 4 एल कुप्पी से संस्कृति स्थानांतरण.
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें. नोट: संस्कृति का अधिक से अधिक 1 एल उगाया जाता है, तो वे गोली संस्कृति का एक अन्य लीटर जोड़ने और 1.3 चरण दोहरा द्वारा सघन किया जा सकता है. संस्कृति के ऊपर से 2 एल एक एकल कक्ष गोली में सघन किया जा सकता है.
  4. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब सेल निलंबन और स्थानांतरण की 45 मिलीलीटर तक पहुँचने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), पानी, या अन्य वांछित बफर में गोली Resuspend.

2 ELP शुद्धीकरण:. प्रारंभिक कदम और उलटा संक्रमण साइकिलिंग के पहले दौर

  1. बर्फ पर नमूना रखते हुए, 10 'पर' सेकंड और 85 डब्ल्यू की एक बिजली उत्पादन में 20 सेकंड 'बंद' के चक्र में 9 मिनट की कुल के लिए resuspended सेल गोली Sonicate. संक्षेप नमूना बर्फ पर शांत और तब एक बार फिर 9 मिनट चक्र को दोहराने के लिए अनुमति देते हैं. नोट: ELP एक बहुत कम टी टी करने के लिए प्रत्याशित है टी ऊपर समाधान के ताप से बचने के लिए 40 सेकंड तक बढ़ाया जा सकता है.
  2. नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूब दौर एक 50 मिलीलीटर lysate स्थानांतरण.
  3. संस्कृति की प्रत्येक लीटर के लिए 10% की 2 एमएल (w / v) polyethyleneimine (पी) जोड़ें और मिश्रण को हिला. नोट: पी नकारात्मक आरोप लगाया आनुवंशिक प्रदूषणों से संक्षेपण में एड्स कि एक सकारात्मक आरोप लगाया बहुलक है. पी भी गाढ़ा और ELP उत्पाद निकाल सकते हैं के रूप में ELP नकारात्मक चार्ज किया जाता है, तो इस चरण को पूरा नहीं करते हैं.
  4. 16,000 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र.
  5. नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूब दौर एक साफ 50 मिलीलीटर स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और गोली त्यागें.
  6. वैकल्पिक कदम "बाहर सेंकना": प्रोटीन contaminants denature और फिर ELP पूरी तरह से resolubilized होने तक 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ के लिए स्थानांतरण करने के लिए 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं. अपकेंद्रित्र 16,000 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना. एक सीएल स्थानांतरण सतह पर तैरनेवालादौर EAN 50 मिलीलीटर नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूब और गोली त्यागें. नोट: एक पेप्टाइड या प्रोटीन ELP से जुड़े हुए है और ऊंचा गर्मी की हालत में denature की उम्मीद है, तो इस चरण को पूरा नहीं करते हैं. इस ELP संक्रमण गर्मी अपरिवर्तनीय हो जाते हैं या आपस में जुड़े आधा भाग की गतिविधि को नष्ट कर सकता है कारण हो सकता है.
  7. क्रिस्टलीय NaCl के अलावा (नहीं 3 एम से अधिक) के साथ ELP संक्रमण प्रेरित. वैकल्पिक रूप से, (नहीं 0.3 एम से अधिक) सोडियम साइट्रेट उच्च टी टी एस या कम पैदावार है कि ELPs के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नोट: नमक भंग कर दिया है समाधान समाधान से ELP के चरण जुदाई का संकेत है, बादल बारी चाहिए. उच्च टी टी एस के साथ बहुत हाइड्रोफिलिक ELPs ELP संक्रमण के इस प्रारंभिक प्रेरण में ELP के चरण जुदाई प्रेरित करने के लिए, नमक के अलावा के साथ संयोजन में, हीटिंग के कुछ डिग्री की आवश्यकता हो सकती.
  8. 16,000 XG (गर्म स्पिन) पर 10 मिनट के लिए कमरे temperatue (आर टी) पर अपकेंद्रित्र. ध्यान दें: एक ELP गोली ख चाहिएई जिसका आकार ELP की अभिव्यक्ति उपज पर निर्भर करता है, मनाया. इस ELP गोली पर पहले अपारदर्शी दिखाई दे सकता है, लेकिन ठंडा करने के बाद यह पारदर्शी दिखाई देगा और रंग में भूरे रंग का हो सकता है. शुद्धि आय और contaminants हटा रहे हैं ELP गोली अधिक बेरंग हो जाएगा.
  9. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और गोली के लिए वांछित बफर 1-5 मिलीलीटर जोड़ें. Pipetting द्वारा गोली Resuspend या 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाने के लिए ट्यूब की स्थापना नोट: बफर की मात्रा ELP गोली के आकार पर निर्भर करते हैं, और इस प्रकार बफर के लिए पर्याप्त मात्रा ELP गोली की resolubilization के लिए अनुमति देने के लिए जोड़ा जाना चाहिए जहां ELP अभिव्यक्ति की उपज. Contaminating प्रोटीन के साथ डाइसल्फ़ाइड बातचीत समाप्त करने के लिए 7 पीएच में 10 मिमी Tris (2 carboxyethyl) phosphine हाइड्रोक्लोराइड (TCEP-एचसीएल) के साथ पानी में शुद्धि से उच्च सिस्टीन सामग्री लाभ के साथ ELPs. समायोजित पीएच में शुद्धि से उच्च आरोप सामग्री लाभ के साथ ELPs उनके आरोप बेअसर और हाथी को कम करने के लिएcontaminating प्रोटीन के साथ ctrostatic बातचीत.
  10. साफ 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में 1 एमएल aliquots में resuspended ELP समाधान स्थानांतरण.
  11. 16,000 XG (ठंड स्पिन) पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र. अघुलनशील contaminants की एक छोटी सी गोली मनाया जाना चाहिए.
  12. एक स्वच्छ ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और गोली त्यागें.

3. ELP शुद्धीकरण: उलटा संक्रमण साइकिलिंग के बाद के दौर

  1. गर्मी और / या NaCl के अलावा के साथ ELP संक्रमण प्रेरित. नमूने टी टी ऊपर एक के तापमान पर 15 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक पर या एक पानी के स्नान में incubated किया जा सकता है. हालांकि, ELP (गर्मी का उपयोग precluding) एक प्रोटीन से जुड़े हुए है या ELP अकेले गर्मी के साथ पहुँच नहीं किया जा सकता है कि एक उच्च टी टी, NaCl के एक 5 मीटर समाधान है अगर प्रेरित करने के लिए ड्रॉप के लिहाज से जोड़ा जा सकता है, तो ELP संक्रमण. नोट: समाधान समाधान से ELP के चरण जुदाई का संकेत है, बादल बारी चाहिए.
  2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें वांछित बफर के 500-750 μl जोड़ने, और pipetting द्वारा गोली resuspend या 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाने के लिए ट्यूब की स्थापना
  3. 16,000 XG (ठंड स्पिन) पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र. अघुलनशील contaminants की एक छोटी सी गोली मनाया जाना चाहिए.
  4. एक स्वच्छ ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और गोली त्यागें.
  5. कोई संदूषक गोली 3.4 कदम के दौरान मनाया जाता है जब तक दोहराएँ 3.1-3.5 कदम.

4. बाद शुद्धि प्रोसेसिंग (वैकल्पिक)

  1. अगर वांछित, शुद्ध ELP समाधान से अधिक नमक निकालने के लिए एक उपयुक्त बफर के खिलाफ नमूना dialyze. नोट: lyophilized होने के लिए ELPs होना चाहिए4 डिग्री सेल्सियस पर DDH 2 ऊ / एन खिलाफ dialyzed
  2. अगर वांछित, पूर्व ओ / एन lyophilizing को 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर समाधान ठंड से लंबी अवधि के भंडारण के लिए ELP lyophilize नोट: lyophilization संलग्न प्रोटीन के साथ ELPs के लिए नहीं किया जाना चाहिए.
  3. अगर वांछित, ELP टैग हटाने के द्वारा एक पेप्टाइड या प्रोटीन ELP संलयन से मुक्त पेप्टाइड या प्रोटीन की वसूली:
    1. (प्रोटीज आपूर्तिकर्ता की सिफारिश के अनुसार) biotinylated प्रोटीज साथ या आनुवंशिक रूप से पेप्टाइड या प्रोटीन और ELP के बीच बनाया गया प्रोटीज साइट को इसी प्रोटीज ELP फ्यूजन के साथ पेप्टाइड या प्रोटीन ELP फ्यूजन डाइजेस्ट.
    2. यदि लागू हो, (प्रोटीज आपूर्तिकर्ता की सिफारिश के अनुसार) streptavidin संशोधित मोती का उपयोग biotinylated प्रोटीज को हटा दें.
    3. एक 5 एम NaCl समाधान की बूंद के लिहाज से इसके द्वारा cleaved ELP और / या प्रोटीज ELP संलयन के संक्रमण प्रेरित.
    4. 16,000 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए आरटी पर अपकेंद्रित्र. नोट: किसी ELP गोली मनाया जाना चाहिए.
    5. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और ELP गोली त्यागें. एक वांछित बफर के खिलाफ सतह पर तैरनेवाला dialyze या शुद्ध पेप्टाइड या प्रोटीन समाधान से उच्च नमक एकाग्रता को दूर करने के क्रम में एक बफर विनिमय प्रदर्शन करने के लिए एक केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग करें.
    6. सोडियम सल्फेट dodecyl polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) से ELP टैग से मुक्त पेप्टाइड या प्रोटीन की पूरी दरार की पुष्टि करें.

5 विशेषता:. एसडीएस पृष्ठ

  1. 2-mercaptoethanol युक्त नमूना बफर के 10 μl के साथ पानी में पतला ELP के 10 μl मिश्रण से एसडीएस पृष्ठ के लिए ELP नमूने तैयार करते हैं. नोट: ELP की 40 ग्राम अक्सर ELP उत्पाद का आकार और पवित्रता का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त है.
  2. 2 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं और फिर एक उचित आकार प्रोटीन सीढ़ी के साथ एक polyacrylamide जेल पर लोड.
  3. डाई जेल (लगभग 45 मिनट) के नीचे दृष्टिकोण तक 180 वी पर जेल चला.
  4. दागकमाल है, जबकि 5 मिनट के लिए एक 0.5 एम CuCl 2 समाधान के साथ जेल. नोट: कुछ ELP दृश्यों इस डाई के साथ बातचीत नहीं करते हैं ELPs आम तौर पर, Coomassie खूब ब्लू दाग द्वारा कल्पना नहीं कर रहे हैं. Coomassie खूब ब्लू arginine अवशेषों के साथ मुख्य रूप से सूचना का आदान प्रदान और अन्य बुनियादी अवशेषों हिस्टडीन और लाइसिन और खुशबूदार अवशेषों-tryptophan, tyrosine, और फेनिलएलनिन 26 के साथ दुर्बलता से सूचना का आदान प्रदान. इस प्रकार ELPs और पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions उनके प्राथमिक अनुक्रम इन विशिष्ट अवशेषों के लिए पर्याप्त संख्या में शामिल केवल अगर Coomassie खूब ब्लू के साथ दाग जा सकता है.
  5. ELP बैंड मेगावाट ELP जीन से और कोई बाहरी संदूषक बैंड मौजूद हैं कि उम्मीद सैद्धांतिक मेगावाट की है कि मेल खाती है की जाँच करें. नोट: कुछ ELPs उनकी उम्मीद मेगावाट 9, 27 से ऊपर के लिए 20% अधिक एक स्पष्ट मेगावाट साथ विस्थापित.

6 विशेषता:. मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर /आयनीकरण समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOF-एमएस)

  1. लगभग 25 माइक्रोन की एक ELP एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए 0.1% trifluoroacetic एसिड युक्त 50% जलीय acetonitrile में एक ELP समाधान तैयार करें. नोट: ELP शुद्धि के बाद एच 2 ओ के खिलाफ dialyzed किया जाना चाहिए ताकि यह समाधान, नमक से मुक्त होना चाहिए.
  2. 0.1% trifluoroacetic एसिड युक्त 50% जलीय acetonitrile में संतृप्त sinapinic एसिड की एक मैट्रिक्स समाधान तैयार करें.
  3. लगभग 2.5 pmol / μl की एक ELP एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए मैट्रिक्स समाधान के 9 μl को ELP समाधान के 1 μl जोड़ें. नोट: इस मिश्रण को आगे MALDI-TOF संकेत अनुकूलन करने के लिए मैट्रिक्स समाधान के साथ पतला किया जा सकता है.
  4. जमा 1-2 एक धातु MALDI थाली पर ELP मैट्रिक्स मिश्रण के μl और स्थान पूरी तरह से सूखी.
  5. ELP का अनुपात (मी / z) शुल्क नहीं है और इसकी मापा मेगावाट अनुमान करने के लिए बड़े पैमाने निर्धारित करने के लिए MALDI-TOF साथ 5-10 स्पेक्ट्रा प्राप्त करते हैं.

7. CharacterizatioN: तापमान क्रमादेशित turbidimetry और गतिशील लाइट छितराया

  1. तापमान क्रमादेशित turbidimetry से ELP की टी टी का निर्धारण करते हैं:
    1. वांछित बफर में ELP समाधान की (5-100 माइक्रोन से जैसे,) एक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करें.
    2. एक तापमान नियंत्रित यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग, 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट की एक हीटिंग दर पर तापमान (जैसे, 20-80 डिग्री सेल्सियस) की एक सीमा से अधिक 350 एनएम ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने. नोट: आयुध डिपो में कोई वृद्धि देखी है, तो टी टी साधन के ऊपरी तापमान सीमा को पार कर सकता है. स्पष्ट टी टी NaCl के अलावा द्वारा कम किया जा सकता है. 1 एम NaCl पर आरंभ और ELP संक्रमण एक औसत दर्जे का तापमान सीमा के भीतर का पता चला है जब तक 0.5 एम के चरणों में वृद्धि हुई है.
    3. 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट की एक शीतलन दर पर तापमान की एक ही सीमा पर आयुध डिपो में कमी को मापने के द्वारा ELP संक्रमण के उलटने की जाँच करें.
    4. होमो के टी टी निर्धारण करेंबहुलक ELP मैलापन प्रोफ़ाइल के मोड़ बिंदु की पहचान करके (आयुध डिपो तापमान प्लॉट बनाम). नोट: यह तापमान आसानी से व्युत्पन्न की अधिकतम करने के लिए इसी तापमान टी टी के रूप में परिभाषित किया गया है, जहां आयुध डिपो वक्र, के व्युत्पन्न से परिभाषित किया जा सकता है. अधिक जटिल ELP आर्किटेक्चर अधिक जटिल मैलापन प्रोफाइल को प्रदर्शित करेगा और धारा 7.2 में वर्णित के रूप में आगे विश्लेषण किया जाना चाहिए.
  2. अधिक जटिल थर्मल गुण (गोलाकार मिसेल्स में स्वयं को इकट्ठा कि जैसे, ELP diblock सहपॉलिमरों) प्रदर्शित करने वाले ELPs की अतिरिक्त लक्षण वर्णन गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) द्वारा हासिल की है:
    1. वांछित बफर में एक ELP समाधान तैयार है और एक 20-450 एनएम छेद के आकार के साथ एक फिल्टर के माध्यम से नमूना गुजरती हैं. नोट: फिल्टर छेद के आकार का चुनाव समाधान में किसी भी ELP विधानसभाओं की उपस्थिति, आकार, और स्थिरता पर निर्भर करेगा. छोटी से छोटी संभव फिल्टर छेद के आकार जैसे contaminants, खत्म करने के लिए पसंद किया जाता हैDLS माप की गुणवत्ता कम है कि धूल,. छोटे फिल्टर ताकना आकार के माध्यम से एक ELP समाधान गुजर जब महत्वपूर्ण प्रतिरोध का अनुभव है जब एक बड़ा फिल्टर ताकना आकार इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    2. मैलापन प्रोफाइल में पहचान ब्याज की एक क्षेत्र से मेल खाती है कि तापमान की एक सीमा से अधिक hydrodynamic त्रिज्या (आर एच) उपाय. नोट: ELP युनिमर्स आम तौर पर एक आर एच <10 एनएम, nanoparticle विधानसभाओं एक आर एच ~ 20-100 एनएम है, और समुच्चय एक आर एच> 500 एनएम है. आर एच में प्रत्येक वृद्धि कण के आकार के लिए आनुपातिक है जो तापमान के एक समारोह के रूप में यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा मापा 350 एनएम पर आयुध डिपो में वृद्धि के अनुरूप होना चाहिए.

Representative Results

यहाँ हम एक ELP homopolymer और एक ELP diblock copolymer की शुद्धि और लक्षण वर्णन के लिए प्रतिनिधि परिणामों का वर्णन. ई. में अभिव्यक्ति की 24 घंटे के बाद कोली, कोशिकाओं centrifugation द्वारा एकत्र की है और sonication द्वारा lysed रहे हैं. आमतौर पर, रंग में एक सूक्ष्म परिवर्तन पर्याप्त सेल (चित्रा 1 ए) की पुष्टि, sonication के बाद होता है. पी के अलावा के बाद, जीनोमिक घटकों और सेलुलर मलबे सतह पर तैरनेवाला में घुलनशील ELP (चित्रा 1 बी) से अघुलनशील contaminants की एक बड़ी गोली को अलग करने, centrifugation द्वारा एकत्र कर रहे हैं. ELP आगे घुलनशील और अघुलनशील दोनों contaminants (चित्रा 2) 28 से ELP अलग करने के लिए LCST व्यवहार कारनामे जो उलटा संक्रमण साइकिल चालन (आईटीसी) द्वारा शुद्ध होता है. ELP के चरण संक्रमण गर्मी और / या नमक के अलावा द्वारा शुरू हो रहा है. ELP एक के होते हैं कि ट्यूब के नीचे एक गोली के गठन में केन्द्रापसारण परिणामएन डी कुछ अघुलनशील contaminants (चित्रा 1C). ELP गोली बनाए रखा और ठंड बफर में resuspended है, जबकि इस पर तैरनेवाला में एक गर्म स्पिन छोड देता घुलनशील contaminants कदम करार दिया. resolubilized ELP 4 डिग्री सेल्सियस पर फिर centrifuged है घुलनशील ELP युक्त सतह पर तैरनेवाला को बरकरार रखा है, जबकि यह एक महज स्पिन छोड देता अघुलनशील प्रदूषणों से गोली कदम करार दिया. गर्म और ठंडे spins बारी का चक्र दोहरा ELP की शुद्धता बढ़ जाती है, लेकिन अवशिष्ट ELP अपकेंद्रित्र ट्यूबों में और पिपेट सुझावों पर प्रत्येक आईटीसी दौर के दौरान खो दिया है के रूप में थोड़ा उपज को कम करने की कीमत पर.

ELPs और पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions के सफल शुद्धि एसडीएस पृष्ठ से इसकी पुष्टि की है. शुद्धिकरण की प्रक्रिया के दौरान लिया छोटे aliquots ई. से ELP के प्रगतिशील शुद्धि का प्रदर्शन कोलाई lysate. ELP कच्चे ई. में overexpressed है कोलाई lysate और contaminants बुद्धि कमीआईटीसी (चित्रा 3) के घंटे लगातार राउंड. शुद्ध ELP भविष्यवाणी की सैद्धांतिक मेगावाट के पास एक बैंड के रूप में प्रकट होता है.

ELP टी टी तापमान क्रमादेशित turbidimetry की विशेषता है. एक ELP homopolymer का मैलापन प्रोफाइल (लगभग 2.0 इकाइयों 25 माइक्रोन की एक ELP एकाग्रता के लिए आधारभूत ऊपर) 350 एनएम पर आयुध डिपो में एक भी तेजी से वृद्धि (चित्रा -4 ए) दर्शाती है. आयुध डिपो तापमान टी टी (चित्रा 4 बी) से नीचे उतारा है जब आधारभूत करने के लिए रिटर्न के रूप में ठंडा मैलापन स्कैन ELP संक्रमण की प्रतिवर्ती प्रकृति की पुष्टि करें. ELPs Homopolymer की तुलना में ELP diblock सहपॉलिमरों, एक अधिक जटिल मैलापन प्रोफाइल दिखा रहे हैं. आयुध डिपो आमतौर पर पहले आधारभूत ऊपर 0.1-0.5 इकाइयों के लिए बढ़ जाती है, जिसके बाद आधारभूत ऊपर 2.0 इकाइयों के लिए तेजी से ओवर ड्राफ्ट बढ़ जाती है (चित्रा 5A). DLS माप तापमान, सह करने के लिए सम्मान के साथ आर एच में परिवर्तन के बारे में जानकारी प्रदान जानकारी rroborating मैलापन प्रोफाइल (चित्रा 5 ब) से प्राप्त की.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रारंभिक ELP शुद्धि. अभिव्यक्ति, ई. के 24 घंटे के बाद कोली कोशिकाओं centrifugation द्वारा एकत्र की है और पीबीएस में resuspended हैं. ए) कक्ष lysate डीएनए contaminants गाढ़ा करने के लिए पी के अलावा के बाद sonication. बी) के बाद काला हो कि इस तरह के, lysate है रंग में एक सूक्ष्म परिवर्तन के साथ है जो sonication द्वारा lysed रहे हैं centrifuged और अघुलनशील मलबे का एक बड़ा गोली ELP संक्रमण गर्मी और / या नमक और centrifugation रूपों एक पारदर्शी ELP गोली के अलावा के साथ प्रेरित किया है सतह पर तैरनेवाला. सी) में घुलनशील ELP से अलग है.ANK "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. उलटा संक्रमण साइकिल चलाना. ELP घुलनशील और अघुलनशील दोनों contaminants से अपने LCST व्यवहार के माध्यम से शुद्ध होता है. (1) ELP संक्रमण गर्मी और / या नमक और ELP के अलावा के साथ प्रेरित किया है ELP युक्त lysate साथ शुरू centrifugation (गर्म स्पिन) से अलग है (2). घुलनशील contaminants युक्त सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया है, जबकि ELP गोली (3) को बरकरार रखा है (3 बी). ELP ठंड बफर (4) में resuspended और 4 डिग्री सेल्सियस (ठंड स्पिन) पर फिर centrifuged है (5). घुलनशील ELP युक्त सतह पर तैरनेवाला को बरकरार रखा है, जबकि अघुलनशील contaminants युक्त गोली (6a) खारिज कर दिया है (6b). साथ निर्धारित के रूप में वांछित पवित्रता, पहुँच जाता है जब तक गर्म और ठंडे spins बारी की साइकिल दोहराया जाता हैएसडीएस पृष्ठ. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
ELP शोधन उत्पादों की चित्रा 3. एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण. एक ELP के सफल शुद्धि एसडीएस पृष्ठ से इसकी पुष्टि की है. Overexpressed ELP कच्चे ई. में स्पष्ट है sonication के बाद कोलाई lysate (2). कुछ ELP अघुलनशील प्रदूषणों से खारिज गोली में खो जाता है, हालांकि पी के अलावा और Centrifugation के बाद घुलनशील ELP मोटे तौर पर, सतह पर तैरनेवाला (3) में बनाए रखा है (4). पहले गर्म स्पिन निम्नलिखित सतह पर तैरनेवाला घुलनशील contaminants के महत्वपूर्ण स्तर पर होता है (5). पहले ठंड स्पिन निम्नलिखित सतह पर तैरनेवाला अघुलनशील contaminants से ELP का अच्छा जुदाई इंगित करता है (6). गर्म (7) और सी के अतिरिक्त चक्रपुराने अंतिम गर्म (9) और ठंड स्पिन (10) supernatants कोई बाहरी संदूषक बैंड प्रदर्शन तक (8) ELP उत्पाद का संतोषजनक शुद्धता की पुष्टि, क्रमशः, अवशिष्ट घुलनशील और अघुलनशील को दूर घूमती है. SKGPG-(VGVPG) के एक दृश्य के साथ इस ELP homopolymer, 80-Y, 33.37 केडीए की एक उम्मीद आणविक भार है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. तापमान क्रमादेशित turbidimetry से ELP homopolymer की विशेषता. ELP टी टी 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट. ए) ELP homopolymers निशंक की दर में एक भी तेजी से वृद्धि में तापमान में वृद्धि करते हुए 350 एनएम पर आयुध डिपो की निगरानी के द्वारा निर्धारित किया जाता है आयुध डिपो कि डेफइनेस एक दिया एकाग्रता. बी में अपने टी टी) ELP संक्रमण के उलटने उलटने आधारभूत की ओवर ड्राफ्ट की वापसी की पुष्टि की है, जहां तापमान, कटौती करते हुए एक 25 μ एम समाधान की 350 एनएम पर आयुध डिपो की निगरानी के द्वारा सत्यापित है. इस ELP homopolymer अनुक्रम SKGPG-(VGVPG) 80-y है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
तापमान क्रमादेशित turbidimetry और गतिशील प्रकाश बिखरने से ELP diblock copolymer के चित्रा 5. विशेषता. ऐसे गोलाकार मिसेल्स में स्वयं को इकट्ठा कि ELP diblock सहपॉलिमरों, प्रदर्शन और अधिक जटिल मैलापन प्रोफाइल के रूप में नैनो पैमाने पर आत्म - विधानसभा से गुजरना है कि ELPs,. बी) DLS माप एक के लिए मैलापन प्रोफ़ाइल से inferred व्यवहार की पुष्टि माइक्रोन पैमाने समुच्चय में ELP की पूरी एकत्रीकरण इंगित करता है कि आयुध डिपो में तेजी से वृद्धि करने के लिए युनिमर्स से मिसेल्स के लिए संक्रमण, इंगित करता है तापमान के लिए सम्मान के साथ आर एच में परिवर्तन के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने के द्वारा 25 माइक्रोन पर समाधान. यहाँ ELP UNIMER एक आर एच ~ 8 एनएम है और मिसेल एक आर एच ~ 25 एनएम है. इस ELP diblock copolymer अनुक्रम है GCGWPG-(VGVPG) 60 - (AGVPGGGVPG) 30 PGGS. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

ELPs उनके प्रोत्साहन संवेदनशील चरण व्यवहार के शोषण से शुद्धि का एक सस्ता और क्रोमैटोग्राफी मुक्त साधन प्रदान करते हैं. यह दृष्टिकोण ई. में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग ELPs की अभिव्यक्ति के बाद दोनों घुलनशील और अघुलनशील contaminants को खत्म करने ELPs और पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions की LCST व्यवहार का लाभ लेता है कोलाई. शुद्धि का यह आसानी आवेदनों की एक किस्म के लिए ELPs निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या ELP बाद शुद्धि प्रसंस्करण के साथ हटाया जा सकता है कि एक शुद्धि टैग के रूप में कार्य कर सकते हैं जिसमें पुनः संयोजक पेप्टाइड या प्रोटीन की शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता.

ELP शुद्धि ई. lyse करने के लिए प्रारंभिक चरण शामिल कोली और आईटीसी द्वारा अवशिष्ट घुलनशील और अघुलनशील प्रदूषणों से हटाने (चित्रा 2) के बाद कच्चे तेल की संस्कृति lysate (चित्रा 1), से जीनोमिक और अघुलनशील सेल मलबे को हटा दें. केन्द्रापसारण addi द्वारा ELP संक्रमण ट्रिगर के बादगर्मी या नमक की tion के एक कदम के लिए एक हॉट स्पिन करार में, सतह पर तैरनेवाला में घुलनशील contaminants से ELP अलग करती है. ELP resolubilizing के बाद, समाधान, अघुलनशील संदूषक गोली को निकालने के लिए टी टी नीचे के तापमान पर फिर centrifuged है एक कदम में एक ठंड स्पिन करार दिया. गर्म और ठंडे spins बारी उपज के लिए एक छोटी सी कीमत पर, प्रत्येक चक्र के साथ ELP समाधान की शुद्धता में सुधार. शोधन पैदावार ELP टी टी, लंबाई, और इनकार पेप्टाइड या प्रोटीन पर निर्भर है. आमतौर पर, इस प्रोटोकॉल ई. प्रति लीटर शुद्ध किया ELP की 100 मिलीग्राम की पैदावार कोली संस्कृति, हालांकि पैदावार 500 मिलीग्राम / एल तक पहुंच सकता है ELP उत्पाद की अंतिम पवित्रता एसडीएस पृष्ठ (चित्रा 3) द्वारा की पुष्टि की है. शुद्ध ELP मेगावाट ELP जीन द्वारा इनकोडिंग सैद्धांतिक मेगावाट के साथ मिलकर मैच चाहिए. हालांकि, कुछ ELPs उनकी उम्मीद मेगावाट 9, 27 से ऊपर के लिए 20% अधिक एक स्पष्ट मेगावाट साथ एसडीएस पृष्ठ में चले जाते हैं. ELP के और अधिक सटीक विश्लेषणमेगावाट भी इस तरह के उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) के रूप में ओर्थोगोनल विश्लेषणात्मक तकनीकों के साथ ELP उत्पाद की शुद्धता पर अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं जो MALDI-TOF-एमएस, के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.

शुद्धि के बाद, ELP टी टी तापमान क्रमादेशित turbidimetry से मापा जाता है. तापमान में वृद्धि हुई है, जबकि इस तकनीक को एक ELP समाधान के आयुध डिपो का निरीक्षण करता है. यह ELP का इरादा आवेदन के लिए प्रासंगिक एक एकाग्रता श्रृंखला चिह्नित करने के लिए सलाह दी जाती है ताकि टी टी एकाग्रता निर्भर है. ELP मैलापन प्रोफाइल UNIMER को माइक्रोन पैमाने समुच्चय से ELP संक्रमण से मेल खाती है कि एक भी तेजी से वृद्धि (चित्रा -4 ए) प्रदर्श homopolymers लिए. टी टी ठीक तापमान के संबंध में आयुध डिपो के पहले व्युत्पन्न के रूप में अधिकतम निर्धारित मैलापन प्रोफाइल में मोड़ बिंदु को इसी तापमान के रूप में परिभाषित किया गया है. के उलटनेELP चरण संक्रमण तापमान टी टी (चित्रा 4 बी) से नीचे उतारा है के रूप में आधारभूत आयुध डिपो में कमी से इसकी पुष्टि की है. तापमान रैंप वृद्धि और कमी के साथ मैलापन प्रोफाइल की वजह से ELP coacervates और ELP resolubilization के चर हिस्टैरिसीस के निपटाने के लिए परिमाण और कैनेटीक्स में अलग होगा. पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions इसी ELP के लिए जुड़े हुए पेप्टाइड या प्रोटीन टी टी को प्रभावित करता है, जहां इस तरह से, में LCST व्यवहार दिखा रहे हैं. प्रोटीन के लिए ELP संक्रमण प्रोटीन के पिघलने तापमान नीचे प्रतिवर्ती है fusions. तापमान क्रमादेशित turbidimetry ऐसे अंतर स्कैनिंग calorimetry (डीएससी) के रूप में ELP उत्पादों, वैकल्पिक तकनीकों के प्रारंभिक थर्मल लक्षण वर्णन के लिए एक शानदार तरीका है, वहीं यह भी ELP टी टी मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

भी तापमान कार्यक्रम के द्वारा होती जा सकता है कि और अधिक जटिल आर्किटेक्चर प्रदर्शनी अधिक जटिल थर्मल व्यवहार के साथ ELPsMMed turbidimetry. ELP diblock सहपॉलिमरों, उदाहरण के लिए, उनके महत्वपूर्ण micellization तापमान पर गोलाकार मिसेल्स में अपने तापमान ट्रिगर विधानसभा स्वयं को इसी विशेषता मैलापन प्रोफाइल दिखा रहे हैं. ऐसे ELP diblock सहपॉलिमरों के लिए ओवर ड्राफ्ट आम तौर पर पहले एक उच्च तापमान पर आयुध डिपो में तेजी से वृद्धि (अप करने के लिए 2.0 इकाइयों आधारभूत ऊपर) माइक्रोन पैमाने के गठन को इंगित करता है, जिसके बाद मिसेल्स को युनिमर्स से संक्रमण का संकेत आधारभूत ऊपर 0.1-0.5 इकाइयों बढ़ जाती है समुच्चय (चित्रा 5A). तापमान ट्रिगर आत्म इकट्ठे ELP संरचनाओं के बारे में अतिरिक्त जानकारी DLS, समाधान में ELP विधानसभाओं के आर एच उपाय है कि एक तकनीक के साथ प्राप्त की है. आर एच में परिवर्तन turbidimetry (चित्रा 5 ब) के साथ मापा आयुध डिपो में परिवर्तन के साथ मिलकर सहमत हैं. Nanoparticle विधानसभाओं एक आर एच प्रदर्शन एक आर एच ~ 20-100 एनएम और समुच्चय का प्रदर्शन करते हुए ELP युनिमर्स आम तौर पर एक आर एच <10 एनएम का प्रदर्शन 17, 23, 29 के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.

कारण ELP तापीय गुणों की tunability के लिए, टी टी एस की एक सीमा के विभिन्न ELP डिजाइन द्वारा प्राप्त की है. यह निहित टी टी बेहद कम या उच्च टी टी एस इस मानक प्रोटोकॉल के लिए सबसे संशोधन की आवश्यकता होगी, जहां प्रत्येक ELP, के लिए शुद्धि प्रोटोकॉल का अनुकूलन को प्रभावित करती है कि मन में रखने के लिए महत्वपूर्ण है. अत्यंत उच्च संक्रमण तापमान के साथ ELPs इस दृष्टिकोण के साथ शुद्धि के लिए अनुपयुक्त हो सकती है. उपन्यास ELPs और पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions के डिजाइन ELP के थर्मल प्रतिक्रिया समझौता हो सकता है, एक साधारण हिस्टडीन टैग immobilized धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी द्वारा वैकल्पिक शुद्धि के लिए शामिल किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त,अतिथि अवशेषों का आरोप लगाया है अगर ELP अनुक्रम की विशेषताओं इस प्रोटोकॉल के संशोधन की आवश्यकता हो सकती है. बफर पीएच के हेरफेर contaminants 17 के साथ बातचीत electrostatic को खत्म करने के प्रयास में ELP के समग्र प्रभारी बदलने के लिए एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल पेप्टाइड्स और उचित उपाय शुद्धिकरण की प्रक्रिया में जुड़े हुए आधा भाग की गतिविधि उपद्रव नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाता है जब प्रोटीन के साथ ELP fusions की विशेष परिस्थितियों के लिए उपयुक्त है. ऐसे संशोधनों पर प्रोटोकॉल भर नोट्स टी टी, प्रभारी, या संलयन चिंताओं के संबंध में इन चुनौतियों उपस्थित हो सकता है कि ELPs की शुद्धि निर्देशित करने के लिए काम करते हैं.

उनके LCST व्यवहार के माध्यम से ELPs की शुद्धि ई. में व्यक्त ELPs का बहुमत और पेप्टाइड या प्रोटीन ELP fusions शुद्ध करने के लिए एक सरल और क्रोमैटोग्राफी मुक्त दृष्टिकोण प्रस्तुत कोलाई. यहाँ संक्षेप प्रोटोकॉल शुद्धि ओ परमिटF सबसे जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए आम है कि उपकरण का उपयोग कर एक ही दिन में ELPs. ELPs और उनके fusions की शुद्धि में आसानी, हम आशा है, पदार्थ विज्ञान, जैव प्रौद्योगिकी, और चिकित्सा के क्षेत्र में नए अनुप्रयोगों के लिए ELP डिजाइन की एक बढ़ती विविधता को प्रोत्साहित करेंगे.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Acknowledgments

यह काम NSF के अनुसंधान त्रिभुज MRSEC (DMR-1121107) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET-24a(+)
pET-25b(+)		 Novagen 69749-3
69753-3		 T7-lac expression vectors with resistance to kanamycin (pET-24) or ampicillin (pET-25).
Ultra BL21 (DE3) competent cells Edge BioSystems 45363 Competent E. coli for recombinant protein expression.
Terrific Broth (TB) Dry Powder Growth Media MO BIO Laboratories 12105 Media is reconstituted in DI H2O and autoclaved before use.
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C IPTG is reconstituted in DI H2O, sterile filtered, and added to cultures to induce enhanced expression.
Phosphate buffered saline (PBS) tablet Calbiochem 524650 These PBS tablets, when dissolved in 1 L of DI H2O, yield a 10 mM phosphate buffer with 140 mM NaCl, and 3 mM KCl with a pH of 7.4 at 25 °C.
Polyethyleneimine (PEI) Solution (~50% w/v) MP Biomedicals 195444 PEI is prepared as a 10% (w/v) solution in deionized H2O.
Nalgene Oak Ridge high-speed centrifuge tubes, 50 ml Thermo Scientific 3138-0050 These round-bottom tubes withstand high-speed centrifugation of 30-50 ml.
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP-HCl) Thermo Scientific 20491 A stock solution of TCEP-HCl is prepared at 100 mM in DI H2O and adjusted to pH 7.0. For ELPs with a high cysteine content the stock solution of this reducing agent is added to the ELP pellet to reach 10 mM in H2O.
Ready Gel Tris-HCl gel, 4-20% linear gradient polyacrylamide gel, 10 well, 30 μl Bio-Rad Laboratories 161-1105 These linear gradient gels offer good visualization of ELPs with a range of MWs.
Cupric chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) Fisher Scientific C454-500 A filtered 0.5 M solution is prepared for negative staining of Tris-HCl polyacrylamide gels.
Anotop 10 syringe filter:
0.02 μm
0.1 μm
0.2 μm		 Whatman 6809-1002
6809-1012
6809-1022		 These 10-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes for DLS measurements.
Millex-HV filter:
0.45 μm		 EMD Millipore SLHVX13NK These 13-mm diameter syringe filters allow preparation of small volumes of solutions with large nanoparticle assemblies for DLS measurements.

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References

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MacEwan, S. R., Hassouneh, W., Chilkoti, A. Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli. J. Vis. Exp. (88), e51583, doi:10.3791/51583 (2014).

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