Summary
Сообщалось Синтез и изготовление electrospun длинных волокон, охватывающих большую месторождения через новый дизайн коллектора от нового биоразлагаемого полимера под названием поли (глицерин-додеканоат) (ПГД). Волокна были способны поддерживать рост клеток, полученных из мышиных плюрипотентных стволовых клеток.
Abstract
Для тканевой инженерии, подготовка биоразлагаемых и биосовместимых лесов является наиболее желательным, но сложной задачей. Среди различных методов изготовления, электропрядения является наиболее привлекательным благодаря своей простоте и универсальности. Кроме того, нановолокна имитировать размер естественной внеклеточного матрикса, обеспечивающего дополнительную поддержку за выживание и рост клеток. Это исследование показало, жизнеспособность изготовления длинных волокон, охватывающих большую депозит область для нового биоразлагаемого и биосовместимого полимера под названием поли (глицерин-додеканоат) (PGD) 1 с помощью новой конструкции коллектора для электропрядения. PGD демонстрирует уникальные упругие свойства с подобными механическими свойствами в нервной ткани, таким образом, она подходит для нейронных тканевой инженерии. Синтез и изготовление установка для изготовления волокнистых строительных лесов материалов был прост, легко воспроизводимым, и недорого. В биосовместимоститестирование, клетки, полученные из мышиных эмбриональных стволовых клеток может придерживаться и растут на electrospun ПГД волокон. Таким образом, этот протокол предоставляет универсальный способ изготовления для изготовления ПГД electrospun волокна для поддержки роста эмбриональных стволовых клеток мыши, полученных нейронального происхождения клеток.
Introduction
Электропрядения является одним из эффективных методов обработки для получения микро-к-нанометра каркасов размер волокна. Основной принцип электроформования включает в себя Taylor конус раствором, который проходит в отверстие иглы с применением высокого напряжения между кончиком иглы и заземленной коллектора. Когда электростатическое отталкивание в растворе преодолевает поверхностное натяжение, заряженная струи жидкости выбрасывается из кончика иглы, проходит через воздух с испарения растворителя, и, наконец, осажденный на заземленной коллектора. Шприцевой насос обеспечивает непрерывный поток выходящего из фильеры растворе и, таким образом, несколько копий electrospun волокон может быть изготовлен в течение короткого периода времени. В ходе выходе из фильеры прибыть на коллекторе, взимается струя будет пройти растяжения и битья по ряду параметров, которые включают вязкости и поверхностного натяжения полимерного раствора, в electrostatiс силой в решении, и взаимодействие внешнего электрического поля, и т.д. 2.
В процессе электропрядения, коллекционер служит подложкой, где микро-до-нм волокна могут быть депонированы. В этом исследовании, новый тип волокна коллектора был разработан для получения волокнистых матов с нужного размера (длина х ширина). Традиционно, алюминиевая фольга используется в качестве коллектора но трудно передать волокна от плоской поверхности на другую подложку. Трудность сбора нетронутыми фибролит от традиционного коллектора в основном за счет того, что electrospun волокна придают сильно к поверхности коллектора. Таким образом, мы модифицированный коллектор путем складывания кусок алюминиевой фольги в прямоугольной полосе и присоединение его перпендикулярно плоской металлической пластины. В electrospun волокна растягиваются по всей области между концом полосы и металлической пластиной, которые могут быть легко переданы другой Substratэ.
Интерес к термически сшитых эластомерных полимеров стремительно растет из-за новаторской работе группы Роберта Лангера, который представил поли (глицерин себацат) (PGS), полиэстера, который является аналогом вулканизированной резины в 2002 году 3. Подобно PGS, мы успешно разработали поли (глицерин-додеканоат) (ПГД) по термической конденсации глицерина и додекандикарбоновой кислоты и продемонстрировала свою уникальным свойством памяти формы 1. В отличие от жесткой синтетических материалов поли (гидроксил бутирата) или поли (L-лактида) (модули Юнга 250 МПа и 660 МПа, соответственно), ПГД проявляет эластомерного недвижимость как резина, с модулем Юнга 1,08 МПа, когда температура выше 37 ° С, что является близким матч на на месте периферического нерва (0,45 МПа). Кроме того, ПГД является биологически и время деградация может быть доработаны путем изменения соотношения глицерина и додекандикарбоновой кислоты. Додекандикарбоновой кислота является двенадцатилетний углерода субпозиция с двумя концевыми карбоксильными группами, HOOC (CH 2) 10 COOH. Четные дикарбоновые кислоты, такие как себациновая кислота и додекандикарбоновой кислоты может быть метаболизируется до ацетил-КоА и введите трикарбоновых кислот (ТСА) / (лимонная кислота) цикла. Метаболический продукт из дикарбоновых кислот, сукцинил-КоА, является предшественником gluconeogenetic и промежуточное соединение TCA цикле 4. Таким образом, некоторые исследования показали, что они могут быть использованы в качестве альтернативного субстрата топлива для энтерального и парентерального питания, особенно в патологических состояниях. Кроме того, PGD обладает уникальной памятью формы, так как его температура стеклования 31 ° C, при этом он показывает различные механические свойства при комнатной температуре и при температуре тела. В целом, ПГД является биологически, биосовместимых, демонстрируя уникальные упругие свойства с механическими свойствами, аналогичными нервных тканей; следовательно, является подходящим материалом для нервной ткани машиностроении. В этом протоколе, electrospunдлинные волокна, охватывающие большую площадь для хранения были изготовлены с помощью новой конструкции коллектора от ПГД. В леса волокна могут поддержать рост мыши плюрипотентных стволовых клеток и дифференцировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Настройка Электропрядения коллектор
- Разрежьте алюминиевую фольгу в прямоугольный кусок.
- Сложите прямоугольный кусок в прямоугольную полосу, и приложите его перпендикулярно плоской металлической пластины с лентой (рис. 1). Примечание: Размер волокнистого мата зависит от длины и ширины полосы. Таким образом, размеры полосы можно регулировать по мере необходимости.
2. Полимерные Подготовка решения
- Смешайте глицерин и додекандикарбоновую кислоту (ДВР) в молярном соотношении 1:1 в химическом стакане при температуре 120 ° С в течение 100 ч, чтобы получить PGD полимера.
- Растворить поли (этиленоксид) (ПЭО) и желатин в 65%-ном этаноле с весовом соотношении 1.5:3:95.5 в 15 мл пробирку, затянуть крышку и нагревают смесь в печи при 60 ° С в течение 1 часа при перемешивании пока она не станет однородной решение (базальной раствор).
- Для электропрядения, смешать PGD полимер и базальную решение в 4:06 весовом соотношении. Примечание: ПГД концентрация имеет биг эффект от диаметра волокна. 30% -50% процентов PGD является приемлемым для производства волокон более 5 см с увеличением диаметра волокна.
- Добавить 0,1% рибофлавин, чтобы полимерного раствора и хорошо перемешать.
3. Электропрядения
- Поток полимерного раствора в 5 мл стандартного шприца с 18 G притупляются иглы из нержавеющей стали.
- Вставьте шприц в шприцевой насос.
- Прикрепите заземленный провод источника питания высокого напряжения на металлическую пластину и положительно заряженной приводят к игле.
- Отрегулируйте расстояние между иглой и фольги полосы алюминия до 15 см.
- Поместите шприцевой насос под углом около 15 ° к горизонтальной для предотвращения агрегации волокон в передней части полосы.
- Включите шприцевой насос и регулировать расход насоса до 0,6 мл / час.
- Включите источник питания высокого напряжения и установить рабочее напряжение до 14,6 кВ.
4.Волоконно Обработка
- После сбора завершена, подвергать фибролит к ультрафиолетовому излучению в течение 60 мин для сшивания.
- Передача волокнистый мат из фольги алюминиевой полосы в 100 мм чашки Петри, и подвергать его воздействию ультрафиолетового света течение еще 20 мин для стерилизации.
- В кабинете биологической безопасности, разрезать волокнистый мат в круглые куски такого же размера с хирургическим скальпелем и поместить части в 24-луночный планшет.
- Для клеточной терапии предварительно посева, погрузить образцы волокон в 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) и инкубировали при 37 ° С в течение ночи.
- На следующий день, аспирации PBS тщательно, добавить 1 мл дифференциации среды (DMEM/F12, N2, и FGF2) (см. рецепт в материалах таблице) в каждую лунку и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 3 часов.
- Аспирируйте дифференциация среднего осторожно, добавьте 0,2 мл Матригель к каждому образцу волокна и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Примечание: Laminin также могут быть использованы для покрытия волокна. Добавить 0,2 мл 20 мкг / мл ламининна волокно и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 часов.
- Осторожно снимите излишки Матригель из каждой лунки. Промойте 2 мл дифференциации среды один раз. Примечание: Образцы волокна готовы к клеточной культуре.
5. Сотовый Посев на волокна
- Добавьте 1 мл Accutase к клеточной блюдо культуры MES и инкубировать в течение 10 мин при 37 ° С
- Через 10 мин МОН клетки отделяют от культуры блюдо. Добавить 4 мл дифференциации среды к пластине. Соберите плавающие ЭСК в 15 мл трубки и пипетки клеток вверх и вниз, чтобы сломать колонии (около 15x).
- Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин и повторно приостанавливать клеток в 4 мл среды дифференцировки.
- Граф клеток с помощью гемоцитометра. Передача 200 мкл клеточной суспензии в 15 мл пробирку и разбавить его с 10x дифференцировки среды. Трансфер 15 мкл разбавленного клеточной суспензии в камеру на гемоцитометре с покровным стеклом на месте. Считатьклетки в 1 мм площади центра и четырех угловых квадратов гемоцитометре под микроскопом. Примечание: Сотовый на мл = среднее значение в квадрате х на коэффициент разбавления х 10 4
- Поместите примерно 5 х 10 4 ЭСК в каждую лунку. Медленно падение клеточной суспензии на середине образцов волокна, а скольжение в сторону скважины, чтобы предотвратить решение от спуске Волокнистый мат.
- Добавить 1 мл дифференцировки среды в каждую лунку, и планшет держать в инкубаторе при 37 ° С и 5% СО 2, чтобы позволить прикрепления клеток, рост и дифференциацию.
- Аспирируйте старый субстрат из каждой лунки и заменить 1 мл свежего дифференциации среды через день.
6. Жизнеспособность клеток
- Аспирируйте старую среду из каждой лунки.
- Смешайте 1/10 объема резазурин флуоресценции реагента с культуральной среды и добавляют 1 мл в каждую лунку.
- Incubели в 37 ° С и 5% CO 2 в течение 4 часов, защищенном от прямых солнечных лучей.
- Через 4 часа, передача 3 раза 100 мкл реагента из каждой лунки в 96-луночный планшет, а затем образцы готовы быть измерена на флуоресцентном спектрофотометре с использованием параметров 560EX nm/590EM фильтра.
7. Настоящее ПЦР Время
- Через 14 дней культивирования добавить лизирующего буфера для образцов и изолировать общей РНК из клеток на образцах волокна.
- Использование 4 мкл тотальной РНК, чтобы синтезировать кДНК в 20 мкл реакционной масштабах путем обратной транскрипции.
- Подготовка реакционной смеси ПЦР в каждой оптической трубы: 10 мкл Master Mix (2x), 0,2 мкл красителя, 8 мкл нуклеазы без воды, 1 мкл кДНК, и 1 мкл праймера (праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 1).
- Установите программу ПЦР: а. 95 ° C 2:20 мин, 1 цикл б. 95 ° C 3 сек → 60 ° C 1 мин, 40 цикл с. 95 ° С 15 сек, 1 цикл г. 60 ° C 1мин, 1 цикл э. 95 ° С 15 сек, 1 цикл. Выберите сравнительный метод C T для определения уровней экспрессии относительно генов.
- После ПЦР закончена, анализировать в режиме реального времени результаты ПЦР с StepOne программного обеспечения и экспортировать результаты в Excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основными компонентами электроформования показаны на рисунке 1. Большой размер коврик волокна обычно получают путем перпендикулярно прикрепленной полосы алюминиевой фольги и плоской металлической пластины. Рисунок 2 показывает конструкцию коллектора и мат электропрядения волокна. Ширина и длина может регулироваться для различных приложений. Длина волокна, изготовленного с PGD полимера и базальной Раствор смеси до 10 см. Морфология electrospun волокон показан на рисунке 3. Диаметры волокон, изготовленных из 40%-ной концентрации PGD находятся в диапазоне микрометра. Конфокальной микроскопии изображения дифференцированных клеток, полученных из ЭСК культивировали в течение 3 и 6 дней на волокна показаны на рисунке 4. Зеленые сигналы флуоресцентные пришел из сверхэкспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) в клетках. Результатом резазурин флуоресценции реагента на рисунке 5 показано, что ЭСК клетки растутн на PGD волокон покрытия с матригеле и ламинином было эквивалентную жизнеспособность клеток и имели относительно более высокую пролиферацию по сравнению с непокрытой группы. Экспрессия гена из плюрипотентности и нервных клеток маркеров количественно ПЦР в реальном времени (рис. 6). Большинство ЭСК культивировали на волокнах выразил OCT4 маркеров плюрипотентности, Nanog и Sox2 в то время как меньшинство клеток выразил нейронная стволовых клеток отмечает PAX6 и нестин. Через 2 недели культуры, MES, выращенные на волокна показали повышенные уровни экспрессии нервных клеток, таких марок как МАР2 и DCX, а также олигодендроциты маркера Oligo1 и астроцитов GFAP маркера.
Рисунок 1. Электроформования создана. Полимерный раствор выбрасывается из затупленного иглы. Источника питания высокого напряжения основания плоская металлическая пластинай фольга полоса алюминия, между которыми микро-до-нано метр волокна осаждаются (синий).
Рисунок 2. Конструкция коллектора и мат electrospun волокна. Ширина и длина мата может быть легко изменена путем регулировки размера фольги полосы алюминия. Там нет предела для ширины мат, и самые длинные волокна могут быть длиной до 10 см.
Рисунок 3. СЭМ изображения electrospun из PGD и базальных раствором 4:06 (вес / вес). Средний диаметр волокна составляет около 2 мкм. Когда концентрация PGD уменьшается до 30%, средний диаметр волокон попадает в нанометровом диапазоне. БелыйМасштабная линейка составляет 10 мкм.
Рисунок 4. Конфокальной микроскопии образы дифференцированных ЭСК на волокна. Клетки, несущие GFP обладают яркой зеленую флуоресценцию при воздействии света в синий с ультрафиолетовом диапазоне. Увеличение числа зеленый флуоресцентный клеток на 6-й день показывает, что леса волокна может поддерживать адгезию и пролиферацию клеток. Белая масштабная линейка представляет 100 мкм. (3-й день и День 6).
Рисунок 5. Ячейка жизнеспособность ЭСК на ПГД волокон покрытие с Матригель и ламинином на 1, 3, и 5 дней, как определено резазурин fluoreСЦЕНА реагент. Клетки культивировали на непокрытых волокон, используемых в качестве контроля (р <0,05).
Рисунок 6. Qrt-ПЦР анализ экспрессии генов в дифференцированных ЭСК на ПГД волокон. Нервные маркеры очевидные клеток после 2 недель показали, что ЭСК клетки на каркасах дифференцировали в нервные клетки.
| mGAPDH-L | AACTTTGGCATTGTGGAAGG |
| mGAPDH-R | ACACATTGGGGGTAGGAACA |
| mOct4-L | CACGAGTGGAAAGCAACTCA |
| mOct4-R | AGATGGTGGTCTGGCTGAAC |
| mNanog-L | AAGTACCTCAGCCTCCAGCA |
| mNanog-R | GTGCTGAGCCCTTCTGAATC |
| mSox2-L | CACAGTTCAGCCCTGAGTGA |
| mSox2-R | AGGCCACAACAACAACAACA |
| mPax6-L | AACAACCTGCCTATGCAACC |
| mPax6-R | ACTTGGACGGGAACTGACAC |
| mNestin-L | CCAGAGCTGGACTGGAACTC |
| mNestin-R | ACCTGCCTCTTTTGGTTCCT |
| mmap2-L | CTTATGGGAATGTGGGATGG |
| mmap2-R | AAAAAGTGGGCCTTGGAACT |
| mDCX-L | ATGCAGTTGTCCCTCCATTC |
| mDCX-R | ATGCCACCAAGTTGTCATCA |
| mOligo1-L | CTTGCTCTCTCCAGCCAAAC |
| mOligo1-R | GCGAGCCTGAAAAACAGAAC |
| mGFAP-L | CACGAACGAGTCCCTAGAGC |
| mGFAP-R | ATGGTGATGCGGTTTTCTTC |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ограничения простых коллекционеров или сложностей вращающихся коллекционеров, которые в настоящее время используются для электропрядения увеличить ограничение получения желаемой длины и размер мата для некоторых приложений. Кроме того, передача волокна из основного коллектора к чашке культуры или других поверхностей является вызовом 5. В этом докладе, недавно разработанный коллектор, сделал просто путем присоединения фольги полоску алюминия к заземленной коллектора, смог получить большие размеры маты до 10 см на 20 см за один раз. Рисунки 1 и 2 иллюстрируют принципиальную установку, предназначенный для изготовления до 10 см в длину electrospun волокон с контролируемой шириной мат. Под влиянием электростатического поля между кончиком иглы и коллекционера, то electrospun волокна растянулись по всей площади между полосой алюминиевой фольги и заземленной коллектора, чтобы сформировать гладкую коврик волокна, которые могут быть легко переданы другому сubstrate. Electrospun волокна обеспечивают пористые волокнистые структуры, которые позволяют клеткам преодолеть и приложите на несколько волокон в действительно трехмерной среде. В маты, полученные в этом исследовании, достаточно велики, чтобы сделать их идеальными кандидатами для широкого диапазона приложений, таких как заживление ран и регенерации нервной.
Диаметры волокон можно регулировать путем регулирования несколько переменных в процедуре электроформования. Эти переменные включают концентрацию полимера, величину приложенного напряжения, скорость доставки полимер, расстояние от иглы к коллектору, и т.д. 6-8. В этом исследовании, тестирования решения, которые были составлены с 50% ПГД и 50% БС, 40% ПГД и 60% БС, 30% ПГД и 70% BS, и 20% ПГД и 80% БС, соответственно, были подготовлены к делая electrospun волокна. Волокнистые леса были изучены с помощью сканирующего электронного микроскопа, чтобы определить диаметр и морфологии волокон (рис. 3). Как и ожидалось, более высокие концентрации PGD рroduced большие диаметры electrospun волокон. Кроме того, очень важно, чтобы отрегулировать длину полосы в соответствии с различными концентрациями PGD. Более низкая концентрация ПГД требуется более короткую длину полосы, чтобы обеспечить формирование волокна.
Многочисленные усилия были предприняты для изучения биосовместимости electrospun волокнистых каркасов на основе изучения клеточной культуре 9-13. Конфокальные изображения микроскопии на рисунке 4, показывают, что прикрепленные клетки с сильными зеленых сигналов люминесцентных указанные выживаемость клеток на ПГД волокон. Кроме того, плотность клеток увеличивается от 3-й день до 6-й день также предложил пролиферацию клеток по PGD волокон. Тест жизнеспособность клеток на рисунке 5 также подтвердили этот результат. Экспрессия гена из нервных клеток марок МАР2 и DCX показали, что ЭСК клетки способны дифференцироваться в нервные клетки на каркасах (рис. 6). В заключение PGD волокнистые леса может поддержать клеток adhesioн и пролиферации, и, таким образом, обладают потенциалом для нервной ткани машиностроении.
Вот некоторые общие рекомендации по устранению неполадок: если волокно выходит из иглы не является непрерывным, разогреть полимерного раствора снова и хорошо перемешать или если волокно придерживаясь фольги полосы алюминия, не привлечения к металлической пластине, уменьшить полосу длина или увеличить концентрацию PGD. Иногда крупные полимерные шарики образуют на кончике иглы, выключите высокую источник питания напряжения, протрите его бумажным полотенцем, и уменьшить скорость доставки насоса. Кроме того, иногда волокна агрегат на верхней кромке фольги алюминиевой полосы попробовать регулировки угла шприцевого насоса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была проведена с использованием объектов-технологический факультет биомедицинской на Международного университета Флориды.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| Dodecanedioic acid | Sigma-Aldrich | D1009 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | D1890 | |
| Poly(ethylene oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 182028 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | 132350250 | 0.10% |
| Mouse embryonic stem cells | GlobalStem | GSC-5002 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | SH30272.02 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | 1% |
| FGF2 | Stemgent | 03-0002 | 10 ng/ml |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-031 | |
| Resazurin fluorescence dye | Sigma-Aldrich | 62758-13-8 | |
| SV Total RNA Isolation System | Promega | Z3100 | |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5000 | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| Syringe pump | Fisher scientific | 14-831-200 | |
| High voltage power source | Spellman High Voltage Electronics Corporation | SL30 | |
| UV light | Philips | 308643 | 15W/G15T8 |
| Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | ||
| Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 | Perkin Elmer | 8488 | |
| StepOne Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 |
References
- Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R.
- Panunzi, S., De Gaetano, A., Mingrone, G. Approximate linear confidence and curvature of a kinetic model of dodecanedioic acid in humans. American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism. 289, (2005).
- Park, S., et al. Apparatus for preparing electrospun nanofibers: designing an electrospinning process for nanofiber fabrication. Polymer Internationa l. 56, 1361-1366 (2007).
- Barnes, C. P., Sell, S. A., Boland, E. D., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Nanofiber technology: designing the next generation of tissue engineering scaffolds. Advanced drug delivery reviews. 59, 1413-1433 (2007).
- Li, W. -J., Mauck, R. L., Tuan, R. S. Electrospun nanofibrous scaffolds: production, characterization, and applications for tissue engineering and drug delivery. Journal of Biomedical Nanotechnology. 1, 259-275 (2005).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review. Tissue engineering. 12, 1197-1211 (2006).
- Lim, S. H., Mao, H. -Q. Electrospun scaffolds for stem cell engineering. Advanced drug delivery reviews. 61, 1084-1096 (2009).
- Lowery, J. L., Datta, N., Rutledge, G. C. Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly (epsilon-caprolactone) fibrous mats. Biomaterials. 31, 491-504 (2010).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30, 583-588 (2009).
- Ju, Y. M., Choi, J. S., Atala, A., Yoo, J. J., Lee, S. J. Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels. Biomaterials. 31, 4313-4321 (2010).
- McCullen, S. D., et al. In situ collagen polymerization of layered cell-seeded electrospun scaffolds for bone tissue engineering applications. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1095-1105 (2010).
