Summary
Syntes och tillverkning av elektrospunna långa fibrer som spänner över en större insättning området via en nydesignad samlare från en ny biologiskt nedbrytbar polymer som heter poly (glycerol-dodekanoat) (PGD) rapporterades. Fibrerna kunde understödja tillväxten av celler härledda från mus pluripotenta stamceller.
Abstract
För vävnadstekniska tillämpningar, är framställningen av biologiskt nedbrytbara och biokompatibla byggnadsställningar den mest önskvärda men utmanande uppgift. Bland de olika tillverkningsmetoder, är electro den mest attraktiva en på grund av dess enkelhet och mångsidighet. Dessutom elektrospunna Nanofiber likna storleken på naturliga extracellulärmatrix säkerställa ytterligare stöd för cellöverlevnad och tillväxt. Denna studie visade att lönsamheten för tillverkning av långa fibrer som spänner över en större insättning område för en ny biologiskt nedbrytbar och biokompatibla polymer som heter poly (glycerol-dodekanoat) (PGD) 1 med hjälp av en nyutvecklad uppsamlare för electro. PGD uppvisar unika elastiska egenskaper med liknande mekaniska egenskaper till nervvävnader, därför är det lämpligt för neurala vävnadstekniska tillämpningar. Det syntes och tillverkning set-up för att göra fiberställningsmaterial var enkel, mycket reproducerbar, och billig. I biokompatibilitettestning, celler från mus embryonala stamceller skulle kunna ansluta sig till och växa på elektrospunna PGD fibrerna. Sammanfattningsvis detta protokoll som en mångsidig tillverkningsmetod för att göra PGD elektrospunna fibrer för att stödja tillväxten av musen embryonala stamceller härledda neurala härstamning celler.
Introduction
Electro är en av de effektiva bearbetningsmetoder för att producera mikro till-nanometerstorlek fiber ställningar. Den grundläggande principen för electro involverar en Taylor-konen av lösning som hålles vid mynningen av en nål genom att applicera hög spänning mellan nålspetsen och en jordad kollektor. När den elektrostatiska repulsionen i lösningen övervinner ytspänningen är en laddad vätskestråle sprutas ut ur kanylspetsen, färdas genom luften med lösningsmedelsindunstning, och slutligen deponeras på jordad kollektor. Sprutpumpen tillhandahåller ett kontinuerligt flöde av lösningen som kommer ut från spinndysan och sålunda multipla kopior av elektrospunna fibrer kan tillverkas inom en kort tidsperiod. Under lämnar munstycket för att komma fram till samlare, kommer den laddade jet genomgå stretching och piska enligt ett antal parametrar som inkluderar viskositeten och ytspänningen av polymerlösningen, de electrostatic kraft i lösning, och interaktionen av den yttre elektriskt fält, etc. 2.
I electro och tjänar en samlare som en ledande substrat där mikro-till-nanometer fibrer kan deponeras. I denna studie var en ny typ av fibersamlare som syftar till att få fibermattor med önskad storlek (längd x bredd). Traditionellt är aluminiumfolie som används som en kollektor, men det är svårt att överföra fibrerna från den plana ytan till ett annat substrat. Svårigheten att skörda en intakt fibermatta från en traditionell samlare beror främst på det faktum att elektrospunna fibrerna fäster starkt till samlare yta. Därför modifierades vi kollektorn genom vikning av en bit aluminiumfolie i en rektangulär remsa och kopplar den vinkelrätt mot en plan metallplatta. De elektrospunna fibrerna sträcks över området mellan spetsen av remsan och metallplattan, som lätt kan överföras till en annan Substrate.
Intresset för termiskt tvärbundna elastpolymerer växer snabbt på grund av det banbrytande arbetet av Robert Langers grupp, som introducerade poly (glycerol sebacat) (PGS), en polyester som är analog med vulkaniserat gummi 2002 3. Liknar PGS, har vi framgångsrikt utvecklat poly (glycerol-dodekanoat) (PGD) genom termisk kondensation av glycerol och dodekandioinsyra och visat sin unika form minne egendom 1. Till skillnad styvare syntetmaterial poly (hydroxyl-butyrat) eller poly (L-laktid) (elasticitetsmodul av 250 MPa och 660 MPa, respektive), uppvisar PGD elastomera egenskapen som gummi, med en Youngs modul av 1,08 MPa när temperaturen är över 37 ° C, vilket är en nära matchning till in situ perifer nerv (0,45 MPa). Dessutom är PGD bionedbrytbara och nedbrytningstiden kan finjusteras genom att variera förhållandet av glycerol och dodekandisyra. Dodekandisyra är en tolv-kol-subhållning med två terminala karboxylgrupper, HOOC (CH 2) 10 COOH. Även numrerade dikarboxylsyror såsom sebacinsyra och dodekandisyra kan metaboliseras till acetyl-CoA och ange trikarboxylsyra (TCA) / (citronsyra) cykel. Den metabola produkten enligt dikarboxylsyror, succinyl-CoA, är en gluconeogenetic prekursorn och intermediär med TCA-cykeln 4. Sålunda föreslog vissa studier att de skulle kunna användas som ett alternativt bränsle substrat för enteral och parenteral näringstillförsel, särskilt i de patologiska tillstånden. Dessutom uppvisar PGD unik formminne därför att dess glasövergångstemperatur är 31 ° C, vilket visar det distinkta mekaniska egenskaper vid rumstemperatur och vid kroppstemperatur. Sammanfattningsvis är PGD biologiskt nedbrytbar, biokompatibla, uppvisar unika elastiska egenskaper med mekaniska egenskaper som liknar nervvävnader; därför är det ett lämpligt material för nervvävnad tekniska tillämpningar. I detta protokoll, den electrospunlånga fibrer som spänner över en stor insättning område tillverkades via nydesignade samlare från PGD. Fiber ställningar kan stödja mus pluripotenta stamceller tillväxt och differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Electro Collector Setup
- Skär av aluminiumfolie till ett rektangulärt stycke.
- Vik rektangulär bit in i en rektangulär remsa, och bifoga den vinkelrätt mot en plan metallplatta med tejp (Figur 1). Obs: Storleken på fibermattan beror på längden och bredden av remsan. Sålunda kan de banddimensioner justeras efter behov.
2. Polymera lösningen Framställning
- Blanda glycerol och dodekandisyra (DDA) i 1:1-molförhållande i en bägare vid 120 ° C under 100 h för att erhålla PGD polymer.
- Lös poly (etylenoxid) (PEO) och gelatin i 65% etanol med ett viktförhållande av 1.5:3:95.5 i ett 15 ml rör, dra åt locket och upphetta blandningen i en ugn vid 60 ° C under 1 h med omröring tills den blir en homogen lösning (Basal lösning).
- För electro, blanda PGD polymer och basal lösning i 04:06 viktförhållande. OBS: PGD koncentration har en big effekt på fiberdiametern. 30% -50% procent PGD är acceptabelt att producera fibrer längre än 5 cm med ökad fiberdiameter.
- Lägg 0,1% riboflavin till den polymera lösningen och blanda väl.
3. Electro
- Mata polymera lösningen i en 5 ml standardspruta med en 18 G trubbiga nål av rostfritt stål.
- För in sprutan i en sprutpump.
- Fäst jordad ledning av en högspänningskälla på metallplattan och den positivt laddade ledningen till nålen.
- Justera avståndet mellan nålen och aluminiumfolieremsa till 15 cm.
- Placera sprutpump i en vinkel av ca 15 ° med horisontalplanet för att förhindra aggregation av de fibrer som på framsidan av remsan.
- Slå på sprutpumpen och justera flödeshastigheten hos pumpen till 0,6 ml / timme.
- Slå på högspänningskällan och ställ in driftspänningen till 14,6 kV.
4.Fiber Processing
- Efter insamlingen är klar utsätta fibermattan för UV-ljus under 60 min för tvärbindning.
- Överför den fibermatta från aluminiumfolie bandet till en 100 mm petriskål, och utsätta det för UV-ljus under ytterligare 20 min för sterilisering.
- I en biosäkerhet skåp, skär fibermattan till runda bitar av samma storlek med ett kirurgiskt blad och placera bitar i en 24-brunnsplatta.
- För cell pre-seeding behandling, sänk fiberprover i en ml av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkubera vid 37 ° C över natten.
- Följande dag, aspirera PBS försiktigt, tillsätt 1 ml av differentiering medium (DMEM/F12, N2, och FGF2) (se recept i Material tabell) till varje brunn och inkubera vid 37 ° C i 3 timmar.
- Aspirera differentieringsmedium noggrant, tillsätt 0,2 ml Matrigel till varje fiberprov och inkubera vid 37 ° C under 30 min. OBS: Laminin kan också användas för fiberbeläggning. Lägg till 0,2 ml av 20 mikrogram / ml laminintill fibern och inkubera vid rumstemperatur under 3 timmar.
- Avlägsna noga överskotts matrigel från varje brunn. Skölj med 2 ml differentieringsmedium gång. Anmärkning: De fiberproverna är klara för cellodling.
5. Cell sådd på Fibrer
- Tillsätt 1 ml Accutase till MES cellodlingsskål och inkubera i 10 min vid 37 ° C.
- Efter 10 minuter, är MES cellerna lossnar från odlingsskålen. Tillsätt 4 ml av differentiering medium till plattan. Samla de flytande MES-celler i ett 15 ml rör och pipettera cellerna upp och ner för att bryta kolonier (ungefär 15x).
- Centrifugera vid 400 x g under 5 min och återsuspendera celler i 4 ml av differentieringsmedium.
- Räkna celler med användning av en hemocytometer. Överför 200 | il av cellsuspensionen i ett 15 ml rör och späda ut det 10x med differentieringsmedium. För över 15 l av den utspädda cellsuspensionen till en kammare på hemocytometer med en cover-slip på plats. Countcellerna i 1 mm centrum torget och de fyra hörn torg i hemocytometer i mikroskop. Obs: Cell per ml = den genomsnittliga antal per kvadrat x spädningsfaktorn x 10 4
- Placera cirka 5 x 10 4 MES celler till varje brunn. Långsamt släppa cellsuspensionen på mitten av fiberprover, i stället för att glida åt sidan av brunnen, för att förhindra lösningen från att dränera bort fibermattan.
- Tillsätt 1 ml av differentiering medium till varje brunn, och hålla plattan i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2 för att tillåta celler fastsättning, tillväxt och differentiering.
- Sug upp det gamla mediet från varje brunn och ersätta med en ml färskt differentieringsmedium varannan dag.
6. Cellviabilitet
- Sug upp det gamla mediet från varje brunn.
- Blanda 1/10 volym av Resazurin fluorescens reagens med odlingsmedium och tillsätt 1 ml till varje brunn.
- Incubåt vid 37 ° C och 5% CO 2 i 4 timmar, skyddad från direkt ljus.
- Efter 4 h, överför 100 pl 3x av reagenset från varje brunn till en 96-brunnars platta och sedan proven redo att mätas på en fluorescens-spektrofotometer med användning av 560EX nm/590EM filterinställningar.
7. Real Time PCR
- Efter 14 dagars odling, till lysbuffert till proverna och isolera totalt RNA från cellerna på fiberprover.
- Använd 4 l av total RNA för att syntetisera cDNA i 20 pl reaktion skalor genom omvänd transkription.
- Bered PCR-reaktionsblandningen i varje optisk rör: 10 ^ il huvudblandning (2x), 0,2 | il färgämne, 8 pl nukleasfritt vatten, 1 pl cDNA, och 1 | il primer (primers användes i denna studie listas i Tabell 1).
- Ställ in PCR-programmet: en. 95 ° C 2:20 min, 1 cykel b.. 95 ° C 3 sek → 60 ° C 1 min, 40 cykel c. 95 ° C 15 sek, 1 cykel d.. 60 ° C 1min, 1 cykel e. 95 ° C 15 sek, 1 cykel. Välj jämförande C T-metoden för att bestämma relativ genuttryck nivåer.
- Efter PCR är klar analysera realtids PCR-resultat med StepOne mjukvara och exportera resultatet till Excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De viktigaste komponenterna i den electro visas i Figur 1. En stor storlek fibermatta var normalt erhålls genom vinkelrätt fäst aluminiumfolieremsa och en plan metallplatta. Figur 2 visar uppsamlaren designen och electrofibermattan. Bredden och längden kan justeras för olika tillämpningar. Längden på fiber gjord med PGD polymer och basal lösning blandning är upp till 10 cm. Morfologin hos elektrospunna fibrer visas i Figur 3. Diametrarna för fibrer framställda av 40% PGD koncentration är i mikrometerområdet. Konfokalmikroskopi bilder av differentierade celler härledda från MES-celler odlade under 3 och 6 dagar på fibrerna visas i Figur 4. De gröna fluorescerande signalerna kom från överuttryck av grönt fluorescerande protein (GFP) i cellerna. Resultatet av Resazurin fluorescens reagens i figur 5 visade att MES celler växern på PGD fibrerna beläggning med matrigel och laminin hade motsvarande cellernas livskraft och hade relativt högre proliferation jämfört med obelagda gruppen. Genuttrycket av pluripotens och neurala celler markörer kvantifierades genom realtids-PCR (Figur 6). Majoriteten av MES celler odlade på fibrer uttryckte pluripotens markörer Oct4, Nanog och Sox2 medan minoriteten av cellerna uttryckte neurala stamceller markerar PAX6 och Nestin. Efter två veckors kultur, MES odlas på fibrerna visade ökade expressionsnivåer av neurala cellmärken såsom MAP2 och DCX samt oligodendrocyt markör Oligo1 och astrocyt markör GFAP.
Figur 1. Electro inrättas. Polymerlösningen ut från en trubbig nål. En högspänningseffektkäll grunder en platt metallplatta and en aluminiumfolie remsa mellan vilka mikro-till-nano meter fibrer deponeras (blå).
Figur 2. Collector design och electrospun fibermatta. Bredden och längden av fibermattan kan lätt ändras genom att justera storleken av aluminiumfolieremsa. Det finns ingen gräns för mattbredd, och de längsta fibrerna kan vara upp till 10 cm lång.
Figur 3. SEM-bilder av electrospun av PGD och basal lösning 04:06 (vikt / vikt). Den genomsnittliga diametern av fibrerna är cirka 2 um. När PGD koncentrationen minskar till 30%, den genomsnittliga diametern på fibrerna faller i nanometer. Den vitaskala stapel representerar 10 mikrometer.
Figur 4. Konfokalmikroskopi bilder av differentierade MES celler på fibrer. Cellerna bär GFP uppvisa ljust grön fluorescens när den utsätts för ljus i blått för ultravioletta området. Det ökade antalet gröna fluorescerande celler på Dag 6 visar att fiber ställningar kan stödja vidhäftningscell och spridning. Den vita skalan stapel representerar 100 ìm. (Dag 3 och dag 6).
Figur 5. Cellviabiliteten MES celler på PGD fibrer beläggning med Matrigel och laminin vid 1, 3 och 5 dagar som bestämdes genom Resazurin fluorescence reagens. celler odlade på de obelagda fibrerna som användes som kontroll (p <0,05).
Figur 6. QRT-PCR-analys av genuttryck i differentierade MES celler på PGD fibrer. De neurala cellmarkörer uppenbara efter 2 veckor visade att MES cellerna på byggnadsställningar har differentieras till neurala celler.
| mGAPDH-L | AACTTTGGCATTGTGGAAGG |
| mGAPDH-R | ACACATTGGGGGTAGGAACA |
| mOct4-L | CACGAGTGGAAAGCAACTCA |
| mOct4-R | AGATGGTGGTCTGGCTGAAC |
| mNanog-L | AAGTACCTCAGCCTCCAGCA |
| mNanog-R | GTGCTGAGCCCTTCTGAATC |
| mSox2-L | CACAGTTCAGCCCTGAGTGA |
| mSox2-R | AGGCCACAACAACAACAACA |
| mPax6-L | AACAACCTGCCTATGCAACC |
| mPax6-R | ACTTGGACGGGAACTGACAC |
| mNestin-L | CCAGAGCTGGACTGGAACTC |
| mNestin-R | ACCTGCCTCTTTTGGTTCCT |
| mMAP2-L | CTTATGGGAATGTGGGATGG |
| mMAP2-R | AAAAAGTGGGCCTTGGAACT |
| mDCX-L | ATGCAGTTGTCCCTCCATTC |
| mDCX-R | ATGCCACCAAGTTGTCATCA |
| mOligo1-L | CTTGCTCTCTCCAGCCAAAC |
| mOligo1-R | GCGAGCCTGAAAAACAGAAC |
| mGFAP-L | CACGAACGAGTCCCTAGAGC |
| mGFAP-R | ATGGTGATGCGGTTTTCTTC |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Begränsningarna av enkla samlare eller komplexiteten av roterande samlare som för närvarande används för electro öka begränsningen att få önskad längd och storlek på fibermatta för vissa tillämpningar. Dessutom överför fibrer från markkollektorn till odlingsskålen eller andra substrat är en utmaning 5. I denna rapport, en nydesignad samlare, gjorde helt enkelt genom att fästa en aluminiumfolie band till den jordade samlare, kunde få stora storlek fibermattor upp till 10 cm med 20 cm i taget. Figurerna 1 och 2 visar den schematiska inställning utformad för tillverkning av upp till 10 cm långa elektrospunna fibrer med kontrollerad matta bredd. Påverkat av det elektrostatiska fältet mellan nålspetsen och kollektor ades elektrospunna fibrerna sträckte över området mellan aluminiumfolieremsa och den jordade kollektor för att bilda en slät fibermatta, som lätt kan överföras till en annan substrate. Electrospun fibrer ger porösa fiberstrukturer som gör att celler att överbrygga och bifoga till flera fibrer i en verkligt tredimensionell miljö. De fibermattor som genererats i denna studie är tillräckligt stora för att göra dem idealiska kandidater för ett brett spektrum av tillämpningar, såsom sårläkning och neural regenerering.
Fiberdiametrar kan justeras genom styrning av flera variabler i electroförfarandet. Dessa variabler innefattar polymerkoncentrationen, magnituden av pålagd spänning, polymer leveranshastigheten, avståndet från nålen till kollektorn, etc 6-8. I denna studie var de testa lösningar som var sammansatt med 50% PGD och 50% BS, 40% PGD och 60% BS, 30% PGD och 70% BS, och 20% PGD och 80% BS, respektive, förberedd för gör elektrospunna fibrer. De fibrösa ställningar undersöktes med SEM för att bestämma diametrarna och morfologier hos fibrerna (fig 3). Som väntat högre PGD koncentrationer producerad större diametrar av elektrospunna fibrer. Dessutom är det viktigt att justera bandlängd enligt de olika PGD koncentrationer. En lägre PGD koncentration kräver en kortare remsa längd för att säkerställa fiberbildning.
Många ansträngningar har gjorts för att undersöka biokompatibilitet av elektrospunna fibrösa byggnadsställningar genom studier av cellkultur 9-13. De konfokalmikroskopi bilder i Figur 4 visar att de bifogade celler med de starka gröna fluorescerande signaler indikerade cellöverlevnad på PGD fibrer. Dessutom celltätheten ökar från dag 3 till dag 6 föreslog också cellproliferation på PGD fibrer. Cellviabiliteten testet i figur 5 bekräftar också detta resultat. Genuttrycket av neurala cell märken MAP2 och DCX visade att MES cellerna kunde differentiera till neurala celler på byggnadsställningar (Figur 6). Sammanfattningsvis kunde PGD fibrösa byggnadsställningar stödja cell adhesion och proliferation och följaktligen uppvisar potentialen för neural vävnadstekniska tillämpningar.
Här är några generella riktlinjer för felsökning: Om fibern kommer ut ur nålen är diskontinuerliga, värma upp den polymera lösningen igen och blanda det väl eller om fibern är att hålla sig till den aluminiumfolieremsa utan attraktion till metallplattan, minskar remsan längd eller öka PGD koncentrationen. Ibland stora polymer Globs bildas vid nålspetsen, slå av högspänningskällan, torka av den med en pappershandduk, och minska leveranshastigheten för pumpen. Dessutom ibland fibrer samlade på den övre kanten av aluminiumfolieremsa försöka justera vinkeln på sprutpump.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete genomfördes med hjälp av faciliteterna på Biomedical Engineering Department vid Florida International University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| Dodecanedioic acid | Sigma-Aldrich | D1009 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | D1890 | |
| Poly(ethylene oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 182028 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | 132350250 | 0.10% |
| Mouse embryonic stem cells | GlobalStem | GSC-5002 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | SH30272.02 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | 1% |
| FGF2 | Stemgent | 03-0002 | 10 ng/ml |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-031 | |
| Resazurin fluorescence dye | Sigma-Aldrich | 62758-13-8 | |
| SV Total RNA Isolation System | Promega | Z3100 | |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5000 | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| Syringe pump | Fisher scientific | 14-831-200 | |
| High voltage power source | Spellman High Voltage Electronics Corporation | SL30 | |
| UV light | Philips | 308643 | 15W/G15T8 |
| Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | ||
| Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 | Perkin Elmer | 8488 | |
| StepOne Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 |
References
- Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R.
- Panunzi, S., De Gaetano, A., Mingrone, G. Approximate linear confidence and curvature of a kinetic model of dodecanedioic acid in humans. American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism. 289, (2005).
- Park, S., et al. Apparatus for preparing electrospun nanofibers: designing an electrospinning process for nanofiber fabrication. Polymer Internationa l. 56, 1361-1366 (2007).
- Barnes, C. P., Sell, S. A., Boland, E. D., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Nanofiber technology: designing the next generation of tissue engineering scaffolds. Advanced drug delivery reviews. 59, 1413-1433 (2007).
- Li, W. -J., Mauck, R. L., Tuan, R. S. Electrospun nanofibrous scaffolds: production, characterization, and applications for tissue engineering and drug delivery. Journal of Biomedical Nanotechnology. 1, 259-275 (2005).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review. Tissue engineering. 12, 1197-1211 (2006).
- Lim, S. H., Mao, H. -Q. Electrospun scaffolds for stem cell engineering. Advanced drug delivery reviews. 61, 1084-1096 (2009).
- Lowery, J. L., Datta, N., Rutledge, G. C. Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly (epsilon-caprolactone) fibrous mats. Biomaterials. 31, 491-504 (2010).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30, 583-588 (2009).
- Ju, Y. M., Choi, J. S., Atala, A., Yoo, J. J., Lee, S. J. Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels. Biomaterials. 31, 4313-4321 (2010).
- McCullen, S. D., et al. In situ collagen polymerization of layered cell-seeded electrospun scaffolds for bone tissue engineering applications. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1095-1105 (2010).
