Introduction
Den menneskelige stemmebånd fold, som består av en epitellaget, lamina propria (LP) og vocalis muskel, er en spesialisert mykt vev som konverterer luftstrøm fra lungene til akustiske bølger for god produksjon. Ett Stemme folder svinge regelmessig under normal phonation, oppviser stammer av opp til 30% ved fundamentale frekvenser som strekker seg 100 til 300 Hz. 2. Voksen stemmebånds LP er et gradient struktur sammensatt av et overfladisk (SLP), et mellomprodukt (ILP) og en dyp (DLP) lag. Ytterligere klassifiseringsgrupper epitel og SLP som slimhinnen lag, og kombinerer ILP og DLP inn vokalligament. 3 The SLP laget inneholder først og fremst en amorf matrise med tynt spredt collagenous fibre, mens ligament er beriket med modne kollagen og elastin fiber å gi tilstrekkelig styrke. 4 Strukturen og mekanikk av nyfødte stemmebåndene varierer betydelig fra sine modne kolleger. Selv om mekanismens regulerer vokal fold utvikling og modning er ennå ikke fullt ut forstått, eksperimentelle bevis har pekt på de definerende roller vokalisering-avledet mekanisk stress.
Flere medisinske tilstander, inkludert tale misbruk, infeksjoner, kjemiske irritanter og kirurgiske prosedyrer, kan skade vokal fold. Vokal fold lidelser påvirker anslagsvis 3-9% av den amerikanske befolkningen. Aktuelle behandlingsmetoder for vokal fold lidelser er begrenset fem og en stamcelle-baserte tissue engineering tilnærming har dukket opp som en lovende strategi for å gjenopprette vokal fold funksjon. Mesenchymale stamceller (MSCS) er et egnet alternativ til de primære vokal fold fibroblaster for vokal fold tissue engineering. 6-9 Stamcelle skjebne spesifikasjon og påfølgende vev utvikling er mediert av den spesifikke nisje de bor i, som den mekaniske tilstanden er en avgjørende faktor. 10 Mekaniske krefter er viktige regulatorer av vev morphogenesis ennd homeostase, spesielt for vev som er rutinemessig utsatt for belastning. 11. Fra et vevsteknologi perspektiv, har det blitt demonstrert at eksponering for fysiologisk relevante mekaniske stimuler fremmer stamcelledifferensiering og vev-spesifikk matrise ombygging. 12-15
Tissue culture bioreaktorer er utformet til å simulere det ønskede fysiologisk miljø for celle eller vev vekst in vitro. For vokal fold tissue engineering, er det spesielt viktig å gjenskape den mekaniske miljøet av phonating stemmebåndene. En ideell vokal fold bioreaktor bør effektivt levere vibrerende signaler til kultur celler, slik at lettvinte kontroll over frekvens, amplitude og varighet av vibrasjoner. Titze og kolleger utviklet en vokal fold bioreaktor (T1 bioreaktor) 16 som kombinerer statisk strekk med høy frekvens (20-200 Hz) svingninger å stimulere celleproduksjon av matrix proteiner. Using dette bioreaktor, Webb og kolleger 17 studert virkningen av 10-dagers 100-Hz vibrasjoner på dermale fibroblaster dyrket i en hyaluronsyre (HA)-baserte hydrogel. Konstruksjoner som er utsatt for vibrasjon oppviste en forhøyet ekspresjon av HA-syntase-2 (has2), decorin, fibromodulin and matrix metalloproteinase-1 (MMP1), i forhold til de statiske kontroller. De stimulerende effekt ble funnet å være tidsavhengig. Mer nylig vår gruppe 18 montert en stemmebånds bioreaktor (J1 bioreaktor) ved hjelp av en kraftforsterker, en funksjonsgenerator, et lukket høyttaler og en omkretsmessig forankret silikonmembran som overfører oscillerende luft til de festede celler. Neonatal forhud fibroblaster dyrket i J1 bioreaktoren ble utsatt for en time for vibrasjon ved 60, 110 eller 300 Hz, med en in-plane belastning på opp til 0,05%. De qPCR Resultatene antydet at ekspresjonen av enkelte ECM gener var moderat endres i respons til de varierte vibrasjonsfrekvenserog amplituder.
Disse bioreaktor design, mens spennende, har flere begrensninger. For eksempel krever T1 systemet et stort antall av kontakter og stenger for mekanisk kopling, som begrenser den maksimale oppnåelige frekvenser. Videre kan cellene være utsatt for uønsket mekanisk agitasjon og fluid perturbasjon som komplisere tolkningen av data. Den J1 bioreaktor, på den annen side oppviser relativt lav energikonverteringseffektiviteten og er ikke brukervennlige. I tillegg vibrasjoner ofte løsner celle-laden konstruksjoner fra den underliggende silikonmembranen. Den J2 vokal fold bioreaktor rapportert her, designet basert på samme prinsipp som J1-versjonen er optimalisert for konsistens og reproduserbarhet. De phonation-etterligne vibrasjoner genereres aerodynamisk i individuelt montert vibrasjons kamre der MSC-befolket fiber poly (ε-kaprolakton) (PCL) stillasene er effektiviely sikret. Laser Doppler Vibrometry (LDV) lar brukeren kontrollere vibrasjons profil av membran / stillas montering. I vår demonstrasjonen blir MSCS eksponert for 200 Hz sinusformede svingninger med en 1-timers-on-1-t-av (OF) mønster for totalt 12 timers daglig i 7 dager. Cellulære responser til de pålagte vibrerende signaler er undersøkt systematisk. Totalt er den J2 vokal fold de mest brukervennlige funksjoner, slik at dynamiske cellekulturstudier som skal utføres i en høy gjennomstrømning og reproduserbar måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Bioreaktor Assembly (Video 1)
- Foreta en aluminiumsform (sirkulær die + spacer-pin) med forutbestemte indre og ytre dimensjoner (fig. 1).
- Ved hjelp av formen fra trinn 1.1, fremstille en silikonmembran (diameter: 42 mm, tykkelse: 1,5 mm, figur 1) med en fastlåst hylse (diameter: 12 mm, tykkelse ~ 0,25 mm, formet av avstandsbolten i figur 1) i på midten ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig silikon-elastomer kit.
- Gjør et par av akryl blokker (Figur 2 (4, 5)) med en sirkulær åpning (diameter: 24 mm) i midten, gravere toppen (1,8 cm tykk) og bunn (0,9 cm tykk) blokker med matchende rygger og spor . 10
- Sandwich silikon membran mellom de sammenkoblede akryl blokker. Fest monteringen med fire hjørne skruene med en mikro dreiemoment skrutrekker satt til en konstant kraft (35 cN · m). Som et resultat av en vann-tett, 24 mm bred og 18 mm dype vibrasjoner kammeret er opprettet (figur 2C).
- Monter en 3 "utvidet rekkevidde mini-woofer (figur 2D, 8 Ω/20 W) under vibrasjon kammeret gjennom et annet sett med hjørne skruer på bunnen akrylkloss. På dette punktet, er en individuell vibrasjon modul montert.
- Replikere ytterligere syv vibrasjons moduler. Fest fire av dem til en av to stasjonære aluminiumsskinner (40 cm x 10 cm x 2,5 cm) ved å plassere høyttaler baser i jevnt fordelt sirkulære hull (diameter: 7 cm, tykkelse: 2 cm) skåret i barene. Stabil hver høyttaler ved å sette inn en skrue gjennom siden av aluminiumsstang i hver sirkulære hull.
- Individuelt kontrollere høyttalerne med en høyttaler velger. Koble enkelte høyttalere til velgeren ved å koble ledninger til de positive og negative innganger på høyttaleren organ deretter til de tilsvarende utganger på velger. Høyttaleren for valg tillater signalet fra than funksjon generator, etter å ha passert gjennom en effektforsterker, for å nå alle de åtte høyttalere på en gang (figur 2E).
- Plasser de to kammer arrays, høyttalervelger og tilhørende elektronikk i en anti-fuktighet kabinett. Huse hele forsamlingen i en kommersiell cellekultur inkubator.
- Strøm fra hovedkablene (gjennom en medisinsk kvalitet PVC-slanger) som forbinder effektforsterkeren og høyttaler velgeren gjennom filterenheten på baksiden av inkubatoren.
2. Stillas Fabrikasjon og karakterisering
- Oppløs PCL-pellets i kloroform ved en konsentrasjon på 15 vekt%. Load løsningen inn i en 10 ml sprøyte avkortet med en 21 G buttendet nål.
- Låse sprøyten mot en programmerbar sprøytepumpe og innstilt strømningshastighet på 1 ml / time.
- Plasser aluminiumsfolie dekket samleren over fra nålen horisontalt, med en nål tip-to-samleren avstand på ~ 18 cm.
- Klem positive alligator klippet til midten av nålen, og bakken alligator klipp til aluminiums solfangeren, så sette spenningen på høyspent strømforsyning på 15 kV. FORSIKTIG: høy spenning, holde avstand fra nålen.
- Sekvensielt slå på sprøytepumpen og strømforsyning; raskt ren / fjerne det gjenværende polymer-løsning som omgir spissen av nålen ved hjelp av en tørr papirhåndkle før stabil fiberstråler og Taylor konusen 19 er dannet.
- Tillate fibrene å samle seg på samleren Al til en tykkelse på 250-300 mikrometer ~ (~ 7 timer under de gjeldende spinnebetingelser). Lagre resulterende stillas i en vakuum-eksikator i 1-2 dager for å fjerne eventuelt resterende oppløsningsmiddel.
- Bilde stillasene, frese belagt med gull, ved hjelp av en scanning elektronmikroskop for å vise konsekvent fiber morfologi. 10
Tre. Bioreaktor Assembly og karakterisering
- Punch et sylindrisk disk (diameter: 8 mm) med fire armer (lengde: 2mm) ut av den som-spunnet PCL matte (figur 2A) ved først å bruke en 12 mm diameter biopsi dor for å kutte den ytre diameter av skiven. Bruk deretter en andre, 8 mm biopsi punsj å lage fire 2 mm lange hakk jevnt fordelt rundt skjæretrinsa å score hvor armene er å bli kuttet. Etter scoring med 8 mm hull, bruke en skalpell blad til å kutte kantene på armene utover. Sett stillaset i sporet av silikonmembran via forlengede armer (Video 1). Flat ut den innsatte stillaset ved å trykke forsiktig på overflaten ved hjelp av flathead pinsett.
- Fest et lite stykke tynn Al-folie (8 mm x 2 mm, rettvinklet form, figur 2B) til PCL stillas for å hjelpe til med laser refleksjon.
- Fest montert silikonmembran / PCL stillas (som beskrevet i trinn 1.4) i vibrasjon kammeret. Tilsett 1,5 ml vann i kammeret for å hydrere PCL stillaset før vibrasjon.
- Ved hjelp av funksjonsgenerator, introdusere vibrasjon tegnals (f.eks 200 Hz sinusbølger med en peak-to-peak spenning, Vpp, på 0,1 V) til klemt akryl kammeret. Bruk et voltmeter for å måle spenningen ved hver inngang høyttaler. Merk: Vpp avlesning fra funksjonsgenerator vil avvike fra det endelige spenningen levert til høyttaleren.
- Monter single-point LDV og sikre den fiberoptiske lasersensor hodet til en pan-tilt hodet stativ. Vinkelsensorhodet, slik at den peker loddrett på bordplaten. Koble LDV sensorhodet til datainnsamling modulen via koaksialkabel deretter modulen til den bærbare datamaskinen via USB.
- Fokusere laserstrålen loddrett på forskjellige forutbestemte punkter på silikonmembran (figur 2B og figur 3).
- Ved hjelp av datainnsamlingsprogramvare, registrerer mid-membranforskyvningen. Klikk "Oppkjøp Settings" fra "Alternativer"-menyen; deretter endre målemodus til "FFT221;. Deretter klikker du på "Kontinuerlig måling" i hovedverktøylinjen klikk deretter på toppen som danner på valgt frekvens (Figur 6D) for å spille inn fortrengning.
- Plott den normale midt-membran forskyvning (w 0) som en funksjon av den relative stilling på tvers av substratet. Konstruer en 3D fargekart av overflaten vibrasjons profil ved hjelp av Origin 8,5 dataanalyse programvare.
4. Vibrator Cell Culture
- Sub-kultur humane benmargs-avledet MSC i T150 vevskulturflasker med en initial seeding tetthet av 4000-5000 celler / cm 2 i MSC vedlikehold media.
- Etter 7-8 dager etter cellekultur (til ~ 85% konfluens), trypsinize celler med en celle dissosiasjon reagens slik som accutase, teller ved hjelp av et hemocytometer, sentrifuge (440 xg 5 min), og re-suspendere cellepelleten i frisk MSC opprettholdelsemedia i en konsentrasjon på 4,5 x 10 6 celler / ml.
- Fordyp PCL scaffold i 70% etanol O / N. Etter at løsningsmiddelet inndampes, eksponere begge sider av stillaset til bakteriedrepende UV-lys (254 nm) etter 5-8 min.
- Bløt PCL stillaset i en 20 pg / ml fibronectin-løsning ved 37 ° C i 1 time. Sett fibronek-belagt stillaset inn i silikonmembran. Monter bioreaktor som beskrevet i trinn 1.
- Fordel 40 ul av cellesuspensjonen jevnt på det sikrede PCL stillaset. Tillate cellene å feste til 1-1,5 timer før tilsetning ytterligere 1,5 ml friskt media til vibrasjonskammeret.
- Kultur MSC-laden PCL stillas statisk for tre dager og oppdatere media ved gjennomføring av statisk kultur.
- Pålegge utvalgte vibrasjons regimer til de cellulære konstruksjoner. Merk: Som et eksempel, blir cellene utsatt for en en-hr-on-1-t-av (OF) vibrasjon på 200 Hz med en w 0 til ~ 40 mikrometer i 12 timer per dag i opp til 7 dager. Konstruksjoner utsatt for vibrasjonsstimuleringer er utpekt som vib prøver og disse Culturød statisk i identiske vibrasjons kamre tjene som statiske kontroller (Stat).
5. Biologiske Evalueringer
- Samle 200 pl cellekulturmedier fra hvert kammer hver dag (dag 1, 3, 5 og 7), og benytte de alikvoter av den samme prøve sammen (800 mL hver).
- Kvantifisere den cellulære produksjon av matriksmetalloproteinase-en (MMP1) og HA bruker en MMP1 ELISA Utvecklingspaket og en hyaluronan konkurranse ELISA kit, henholdsvis, etter produsentens prosedyre. I mellomtiden analysen produksjonen av oppløselig elastin-forløper etter den tidligere rapportert ELISA-prosedyre. Åtte
- Ved fullføring av den siste vibrasjonssyklus ved dag 7, raskt å fjerne de cellulære konstruksjoner fra vibrasjons kamre ved hjelp av skarpe pinsetter og raskt skylles med kaldt fosfatbufret saltvann (PBS, 4 ° C).
- For live / døde flekker, ruge konstruerer med propidium iodide (1:2,000 i PBS) ogSyto-13 (1:1.000 i PBS) samtidig i 5 min ved RT. Bilde farget konstruerer med en multiphoton konfokalmikroskop.
- Separat, snap-fryse PBS-skylt cellulære konstruerer på tørris og trekke den totale mobil RNA etter en tidligere rapportert protokoll for genet analyse. 9
- Kontroller mengden og kvaliteten på den utpakkede RNA ved hjelp av en UV-Vis-spektrofotometer. RNA-prøver med A260/A280 og A260/A230 forhold på 1,8 til 2,2 anvendes for etterfølgende qPCR analyse.
- Omvendt transkribere RNA (500 ng / prøve) til cDNA ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig revers transkripsjon kit.
- Utfør PCR-reaksjonen på en sanntids-sekvens detektorsystem ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig PCR konsentrat-blanding som følge av tidligere beskrevet prosedyre. Åtte
- Analyser qPCR resultater ved hjelp av kommersielle qPCR dataanalyse programvare. For å sikre påliteligheten av dataanalyse, er flere referanse gener (YWHAZ, TBP, PPIA) ansatt som internal kontroller, og variansen til spesifikke primer effektivitet er tatt hensyn til. 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PCL-stillasene fabrikkert av elektrospinning inneholde mikrometerstørrelse interstitielle porer og tilfeldig viklet fibre med en gjennomsnittlig diameter på 4,7 um (figur 4A). På et høyere forstørrelse, nanoskala grooves og porene er synlig på enkelte fibrene (Figur 4B). Belegg av stillasene med fibronektin forbedrer hydrophilicity og letter den første celle adhesjon / spre på PCL stillas (upublisert observasjon).
Sinusformet bølgeformer med ønsket frekvens (f, 100 til 300 Hz) og spenning (Vpp: 0 til 0,125 V) blir introdusert til høyttaleren under hver vibrasjonskammeret, og luft innesperret mellom bunnen av silikonmembranen og papiret kjegle av en mini-woofer er drevet i oscillasjon. Luften svingning leveres til PCL stillas med eller uten celler. LDV brukes til å analysere svingningsatferden til stillaset ved en gitt f og Vpp,tar hensyn til brytningsindeks av vann (1,33). 20. Figur 5 viser den normale forskyvning (w 0) i senter av PCL-stillas som en funksjon av Vpp og f. De vibrasjonsfrekvenser velges i henhold til de grunnleggende humane talende frekvenser. 21. Det er et lineært forhold mellom w 0 og Vpp i området fra 0 til 0,125 V for alle de frekvenser som ble testet. På et gitt Vpp, w 0 avtar når t øker 100-300 Hz.
En bestemt vibrasjonstilstand (f = 200 Hz, Vpp = 0,1 V) er valgt for videre analyse. Hastigheten profil som en funksjon av tid (Figur 6A) viser at sinusformet signal introdusert til høyttaleren er tatt til fange av den PCL stillas med high fidelity. Midten av PCL stillaset oscillerer i lengderetningen med en topphastighet på 52 mm / sek, en topp akselerasjon av 66 m / sek 2 (~ 6.7g) og ennormal forskyvning av ~ 40 mikrometer. De harmoniske signaler ved 100, 300, 400 og 500 Hz er minst en størrelsesorden lavere enn de på den fundamentale frekvens (200 Hz). Imidlertid, hvis den Vpp-verdien er for høy (0,15 V), er flere harmoniske topper av tilsvar intensiteten til den fundamentale frekvensen påvist (figur 7). Vibrasjonen profil på tvers av stillaset er skapt ved å overvåke den normale forskyvning fra totalt 73 representative punkter på de radiale retninger av PCL flaten (figur 3). Den 3D fargekart (fig. 8) viser at det detektert på overflaten av membranen vibrasjon er axisymmetrical i forhold til midten og dets hvilestillinger. Den normale forskyvning er funnet å avta monotont fra midten mot kanten, hvor membranen er festet.
MSC dyrket på PCL stillaser dyrkes under Valgt vibrasjonsforhold. Celler utsatt for en 7-day AV stimulering opprettholde levedyktighet og lignende spredningsegenskaper som de statiske kontroller (figur 9), noe som bekrefter at den fibrøse stillasene var cytocompatible og vibrasjons anvendt resulterte i noe tap av levedyktighet. Cellulære responser på vibrasjonsstimuleringer er undersøkt på mRNA nivåer i form av uttrykket av essensielle vokal fold ECM proteiner, slik som elastin (ELN), hyaluronan synthase-en (has1), Col3A1 og MMP1 (Figur 10). Den vibrasjon fører til en 2,3 ganger økning i ELN ekspresjon på dag 7 i forhold til de statiske kontroller. De vibrerende stimulering også økt Col3A1 uttrykket moderat. Det er verdt å merke seg at uttrykket av store ECM remodeling enzymer, has1 og MMP1, er betydelig utvidet med vibrasjonssignalene. Nærmere bestemt, resulterte det dynamiske behandling i en fold økning på ~ 1,7 og ~ 16,3 for has1 og MMP1 Uttrykket (både p <0,05) henholdsvis over sine statiske kontroll ved dag 7. Total, den induktive effekten av vibrasjonene på has1 og MMP1 ble forbedret fra dag 3 til dag 7.
For å underbygge resultatene qPCR ytterligere, blir den cellulære produksjon av HA, oppløselig elastin og MMP1 kvantifisert ved ELISA på det translasjonelle nivå (fig. 11). De dynamisk dyrkede celler produsere 4,2 ± 0,1 mg / mg (per tørr stillas vekt) løselig elastin etter syv dager med vibrasjoner, mens de statiske kontroller bare akkumulere 2,7 ± 0,2 mg / mg) elastin. I gjennomsnitt, 7-dagers AV vibrasjoner resultere i 2,2-og 4,7-ganger økning i HA og MMP1 sekresjon, i forhold til de tilsvarende statiske kontroller.
Video 1: En 3D-simulering som viser hvorledes en J2 bioreaktor. Videoen ble laget av Autodesk 3ds Max Design (Courtesy of Congfei Xie).
"Fo: keep-together.within-page =" always ">
. Figur 1 Photograph illustrere dimensjonen av Al mold som brukes for å fabrikkere silikonmembran med forskanset ermet Ø:. Diameter, d: tykkelse / dybde, h:. Høyde Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
.. Figur 2 flytskjema som viser bioreaktoren sammenstillingen (A) Et fotografi av en fire-arm-formet PCL stillaset, (B) Et fotografi som viser PCL stillaset sikret i vibrasjonskammeret og vibrometer laser fokusert på bunnen av kammeret, ( C) Et tverrsnittal visning av vibrasjon kammeret. 1: PCL stillas (red); 2: silikonmembran (cyan); 3: Al stasjonær bar; 4: topp akryl blokk; 5: bunn akryl blokk; 6: mini-woofer, (D) side-visning av vibrasjon modul; (E) Et fotografi som viser hele forsamlingen. Dette tallet har blitt forandret fra Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3.. Illustrasjon radialt merket silikonmembran for single point LDV målinger. Dette tallet har blitt forandret fra Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.
Fig. 4. SEM bilder av PCL-stillasene ved forskjellige forstørrelser. (A) 600X, (B) 7,000 X. Dette tallet har blitt forandret fra Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Den normale forskyvning i sentrum av silikonmembran (w 0) som en funksjon av det påtrykte frekvens (100, 200 og 300 Hz), og drivspenning (Vpp = 0 til 0,125 V). Dette tallet er modifisert fra Tong et al. 10 Copyright 2013, Ma ry Ann Liebert, Inc.
Figur 6. Vibrasjonsegenskaper detekteres på midten av silikonmembran med f = 200 Hz og en Vpp = 0.1 V. (A) hastighetsprofil som funksjon av tiden. (B) hastighetsprofil som funksjon av frekvens. (C) Akselerasjon som en funksjon av frekvens. (D) Normal forskyvning (w 0) som en funksjon av frekvens. Dette tallet har blitt forandret fra Tong et al. 10. Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
/ 51594fig7highres.jpg "/>
Figur 7. Normal forskyvning detekteres på midten av membranen (w 0) som en funksjon av frekvensen når en 200 Hz sinusbølge blir introdusert til den mini-bass ved en Vpp = 0,15 V.
Figur 8. 3D fargekart konstruert av overflaten slipe med de normale fortrengning data samlet inn fra alle steder som er merket på PCL stillaset. Dette tallet har blitt forandret fra Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.
Figur 9. Cell levedyktighet, visualisert av levende / døde flekker, etter syv dager med vibrasjoner. Dette tallet har blitt forandret fra Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10. Cellular svar på de vibrasjonsstimuleringer i form av uttrykket av vokal fold relevant, ECM gener. Den relative genuttrykk (fold change) er normalisert til de respektive statiske kontroller på dag 3 og dag 7 (stiplet baseline). **: Signifikant forskjell (p <0,05) mellom dag 3 og 7, #: signifikant endret (p <0,05) i forhold til grunnlinjen. Data representerer gjennomsnitt ± standardfeil av middelverdien (SEM, n = 4). Tosidige Student t-test brukes for statistisk analyse, med p <0,05 blir vurdert som vesentlig difference (samme som nedenfor). Dette tallet har blitt forandret fra Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.
Figur 11. Biochemical kvantifisering av HA (A), kan oppløses ELN (B) og MMP1 (C) fremstilt ved MSCS dyrket på PCL-stillaset i henhold til statistiske og vib betingelser i 7 dager. Total mengde av ECM-molekyler pr tørr stillaset vekt (mg) er representert som gjennomsnitt ± SEM, n = 4 fra representanten rettssaken #:. betydelig forbedret (p <0,05) sammenlignet med de statistiske kontroller. Dette tallet har blitt forandret fra Tong et al. 10 Copyright 2013, Mary Ann Liebert, Inc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vellykket engineering av funksjonelle vokal fold vev in vitro krever rekreasjon av en vokal fold-lignende mikromiljøet å megle atferd av multipotente celler. Det er generelt akseptert at vevs-eller organ-strukturer reflektere de funksjoner som er nødvendige for å utføre. 22. For stemmebånds vev, blir de høyfrekvente vibrasjoner som oppstår under phonation foreslått å være viktig for vev modning. I vår studie, er PCL stillasene brukes til å gi et ligament-lignende strukturell støtte mens vokal fold bioreaktor er laget for å introdusere fysiologisk relevante mekaniske signaler til de dyrkede MSC. Bioreaktoren beskrevet her (J2) skaper vibrasjoner electromagnetically gjennom individuelle høyttalere og overfører energi aerodynamisk til de dyrkede celler. Sammenlignet med vår forrige design, flytter 18 dagens system kilden til vibrasjonen stimulering rett under hver prøve også, slik at fora mer effektiv energikonvertering. Som et resultat, blir en betydelig større normal forskyvning og en høyere akselerasjon oppnås ved hjelp av det aktuelle system. Den modulære utformingen minimerer også systemvarianter og mekanisk forstyrrelse på tvers av ulike vibrasjons kamre.
Vår utforming er avhengig av en silikonmembran for å levere de vibrasjonssignaler. Det er derfor viktig å opprettholde membranintegritet og homogenitet. Når forløperen løsningen helles i aluminium formen, er det ønskelig å fjerne den overskytende væske ved å dra en glass-slide på tvers av overflaten av formverktøyet. Konsekvent membraner uten noen innesperrede luftbobler kan produseres ved å senke herding temperatur samtidig øke herdetiden. I tillegg kan en 70% etanol-løsning anvendes for midlertidig å svelle membranen på aluminium-grensesnitt for å tillate enkel fjerning av det herdede silikon. For å imøtekomme de cellulære konstruerer for 3D dynamisk kultur, en sentralt plassert tynn groove is støpt inn i silikonmembranen, slik at PCL-stillasene kan perifert forankret i vibrasjonskammeret. Geometrien av sporet er justerbar; således formen av den cellulære konstruktet kan være innstilt tilsvarende for å bedre etterligner geometrien innfødte stemmebåndene. 23. Dersom PCL stillaset ikke er tett festet i silikonmembran, LDV signaler detekteres på PCL og ved det ytre området på silikon membranen vil ikke overlapper perfekt. Ved montering av bioreaktoren, er det kritisk at samtlige deler er festet, og strammes i samme grad slik at man unngår uønskede bevegelser, og for å minimalisere kammer til kammer-variasjoner.
For å validere nytten av bioreaktor, er MSC dyrket på PCL stillaser og utsettes for intermitterende (OF) vibrasjoner i 7 dager. The AV vibrasjoner i en periode på flere timer per dag er ansatt for å reprodusere de talende betingelsene for tunge stemmen brukere, for eksempel, profesjonell synge ers og lærere. 23 motsetning til tidligere rapportert vokal fold bioreaktorer, ours ikke forårsake noen skadelig effekt eller fysiske påkjenninger til cellene.
De 200-Hz vibrasjoner er funnet å differensielt regulere cellulære produksjon av viktige ECM-komponenter. Elastin er et viktig strukturelt protein som er funnet i løpet av stemmebånds LP, og gir fleksibilitet og elastisitet. 24 Interstitiell amorfe komponenter, som for eksempel HA-, bidra til opprettholdelse av riktig vev viskoelastisitet og forhindring av arrdannelse. 25,26 MSCS utsettes til 7-dagers behandlings produsere et betydelig høyere beløp av elastin enn den statisk kultiverte kolleger. HA biosyntesen er også følsomme for vibrasjoner, noe som bekreftes av qPCR resultater på has1 og ELISA-resultater på HA. Disse funn tyder på at vibrasjonsstimulering aktivert av bioreaktoren er som bidrar til produksjonen av anti-arrdannelse molekyler.
jove_content "> avhengig Balansert ECM omsetning på samtidige matrise deponering og degradering. 27 Type III kollagen er den viktigste retikulære kollagen fiber finnes i stemmebåndene, som gir vevet med bærende egenskaper. 28 De syv-dagers vibrasjoner anvendt heri forbedre genuttrykket av Col3A1, men på en størrelsesorden er mye lavere enn den til elastin. derfor anvendt vibrasjoner differensielt regulere cellulære maskineri som er involvert i syntesen av kollagen III og elastin. Interessant MMP1, en av de viktigste MMPs involvert i matrisedegradering og vevsremodelleringen 27 , er meget følsomme for de vibrasjons signaler. Resultatene stemmer godt overens med tidligere rapporter om vibrasjonsinduserte MMP1 oppregulering av celler innesperret i et HA-matrise. 29. Totalt sett er vibrasjonsstimuleringer generert av stemmebånds bioreaktor dypt mediere MSC funksjon ved å fremme homeostase av vokal fold-lignende matriser.Overalt, romanen vokal fold bioreaktor som presenteres her er modulbasert og brukervennlig, slik at dynamiske cellekultur som skal utføres i en reproduserbar måte. Imidlertid flere begrensninger som eksisterer i den aktuelle utforming. Først den vibrasjonsamplitude, selv om bedre fra J1-versjonen, er fremdeles liten sammenliknet med den stemmebånds vev. For det andre, ikke vår bioreaktor ikke simulere den bilaterale kollisjon av stemmebåndene under normal phonation. Tredje, ikke vår fiber PCL stillaset ikke nødvendigvis vevet anisotropi. Fremtidig arbeid er dedikert til å forbedre designen til bedre etterligne de innfødte phonation forhold. I mellomtiden, vil optimale regimer for 3D dynamisk kultur bli utforsket for den vellykkede funksjonelle vokal fold forsamlingen in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen konkurrerende økonomiske interesser eksisterer.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Jeffrey Caplan for sin opplæring og råd om confocal bildebehandling. Vi takker også Keck Elektronmikros Lab og Dr. Chaoying Ni for SEM assistanse. Dette arbeidet er finansiert av National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 og R01DC011377). ABZ erkjenner NSF Integrative Graduate Education & Research Praksisplass (IGERT) program for finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | Cure the membrane at 100 °C for 2 hr |
| PCL | Sigma Aldrich | 440744-500G | Mn ~80 kDa, dissolve O/N |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| Human bone marrow-derived MSCs | Lonza | PT-2501 | Received with passage 2 |
| MSC maintenance media | Lonza | PT-3001 | 10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin |
| Accutase cell dissociation reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-1MG | |
| MMP1 DuoSet ELISA kit | R&D systems | DY901 | |
| HA ELISA kit | Echelon Biosciences | K-1200 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | P1304MP | |
| Syto-13 | Life Technologies | S7575 | |
| QuantiTect reverse transcription kit | Qiagen | 205311 | |
| SYBR Green PCR master mix | Life Technologies | 4309155 | |
| Replacement speaker | DAYTON audio (via Parts Express) |
DS90-8 | Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB |
| Ergo Micro torque screwdriver | Mountz | # 020377 | Torque range: 20-120 cN·m |
| Stereo speaker selector | RadioShack | 40-244 | Maximum power handling 50 W |
| Function generator | Agilent | 33220A | Frequency range 1 µHz-20 MHz |
| Power amplifier | PYLE audio | PylePro PT2400 | Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Steri-Cult 3307 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE 1000R | Output voltage: 0-30 kV |
| Scanning electron microscope | JEOL-USA | JSM-7400F | |
| Desk gold sputter coater | Denton Vacuum | DSK00V-0013 | |
| Doppler laser vibrometer | Polytec | PDV-100 | Non-contact velocity measurement (0-22 kHz) |
| PCR sequence detection system | Applied Biosystems | ABI7300 | |
| Multiphoton confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510Meta NLO | |
| UV-VIS Spectrophotometer | NanoDrop Products via Thermo Scientific |
ND-2000 | |
| VibSoft Data Acquisition Software | Polytec | Acquisition bandwidth up to 40 MHz | |
| Origin 8.5 data analysis software | OriginLab | ||
| qbasePlus qPCR data analysis software | Biogazelle | V2.3 | |
| Aluminium alloy | McMaster-Carr | Alloy 6061 | |
| Acrylic blocks | McMaster-Carr | ||
| Polycarbonate anti-humidity chamber | McMaster-Carr | Impact-Resistant Polycarbonate | |
| screws | McMaster-Carr | ||
| Electronic cable/wire | |||
| Medical grade PVC tubing | US Plastic Corp. | Tygon S-50-HL | Clear, biocompatible |
| 10 ml Syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 21 G Blunt ended needle | Small Parts | NE-213PL-25 | 1-1/2" length |
| Alligator clip adapters | RadioShack | 270-354 | Fully insulated |
| 8 mm Biopsy punch | Sklar Surgical Instruments | 96-1152 | Sterile, disposable |
| 12 mm Biopsy punch | Acuderm (via Fisher Scientific) | NC9998681 | |
| Tissue culture flasks | Corning | Cell culture treated |
References
- Titze, I. R.
- Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
- Gray, S. D.
- Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring. J. Voice. 16, 96-104 (2002).
- Hansen, J. K., Thibeault, S. L. Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring. J. Voice. 20, 110-120 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Hanson, S. E., et al. Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts. Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).
- Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds. Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).
- Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor. Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).
- Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).
- Wang, J. H., Thampatty, B. P. Mechanobiology of Adult and Stem Cells. Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).
- Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
- Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).
- Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli. Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Kutty, J. K., Webb, K. Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).
- Farran, A. J. E., et al. Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).
- Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional. J. Voice. 5, 310-315 (1991).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. Faseb J. 20, 811-827 (2006).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Moore, J., Thibeault, S. Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease. J. Voice. 26, 269-275 (2012).
- Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar. J. Voice. 17, 377-383 (2003).
- Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. Vocal fold wound healing: A review for clinicians. J. Voice. 20, 432-442 (2006).
- Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).
- Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers. Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).
- Kutty, J. K., Webb, K. Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria. Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).
