Protocol
הערה: כל הנהלים הקשורים בבעלי החיים שתוארו בפרוטוקול זה אושרו בעבר על ידי ועדת אוניברסיטת דיוק מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש (DUIACUC).
תרבית תאי 1. סרטן והזרקה
- לטפח תאי סרטן גרורתי שכותרתו fluorescently (למשל תאי סרטן שד MDAMB231-GFP אנושיים, מתנת מד"ר פטרישיה Steeg, NCI, ותאי סרקומה עכבר כותרת YFP, מתנה מד"ר דוד קירש, המרכז הרפואי של אוניברסיטת דיוק, המחלקה לקרינת אונקולוגיה) במדיום המתאים תרבות (הנשר בינוני השתנה למשל של Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור עוברי ו -1% פניצילין / streptavidin) על 37 מעלות צלזיוס עד מחוברות כ -90%.
- Trypsinize תאים, לשטוף אותם 2 פעמים עם PBS, לספור, ואז מזריק אותם לורידי הזנב של חולדות מורדמת-isoflurane 10 שבועות ישנות עירום נשי ב5 מיליון תאים לכל בעלי חיים, באמצעות מזרק עם מחט 27 G. anesthes רמת כירורגיIA מאומת על ידי חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן.
2. ניטור של microCT שימוש גרורות
- לבחון חולדות פעם בשבוע באמצעות מיקרו-CT / מיקרו-irradiator, כדי לזהות את הנוכחות של גרורות מעל כ 2 מ"מ קוטר בקוטר. מיקרו-CT הוא בהזמנה כפי שתואר קודם לכן 12.
- חולדות בכפוף ל-3% הרדמה isoflurane לפני ההדמיה. לאשר הרדמה עמוקה על ידי קמצוץ הבוהן.
- לאחר תחילתה של הרדמה, להעביר במהירות חולדות לעריסת ההדמיה בחדר ההדמיה ולהתחבר דרך האף-קונוס לתערובת isoflurane-אוויר ב2.5-3%. להתאים את המיקום של החולדה בעריסה באופן שבית החזה שלה ממוקם בקרן הפוטונים של סורק microCT, באמצעות פקדי עמדה החיצוניים ומפריד לייזר על ערש ההדמיה. להבטיח את הדלת לחדר ההדמיה סגורה, כדי להגן על החוקר מקרן גמא.
- לשלוט על המיקום של החיה באמצעות שובמצלמת וידאו הצבעוני. לבצע ריצת בדיקת ההדמיה CT ברזולוציה נמוכה, ולהשתמש בתמונה וכתוצאה מכך להתאים את שדה הראייה לממדי xyz של חלל בית החזה.
- תמונת בית חזה העכברוש באמצעות מסנן אל 2 מ"מ ב 40 KVP, 2.5 mA, ו0.008 voxel בשעה 7 FPS ולהחזיר את בעלי החיים לכלוב שלה. הדמיה של בעל חיים אחד צריכה לקחת לא יותר מ -15 או 20 דקות. אל תחזרו לבעלי חיים שעברו ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור על כיבה sternal.
- לאשר גרורות ידי הופעתו של אובייקטים יחסית רדיו-אטום שלא יכול להיות מוסברת על ידי כלי דם intrathoracic (איור 1 א)
כירורגיה 3. חלון הלשכה
- הרדמה, סימנים חיוניים וצנתור וריד הזנב
- בחר בעלי חיים עם נוכחות של מחלה גרורתית. הזרק חיה עם ד intraperitonealOSE של 50 מ"ג / קילוגרם pentobarbital. לאשר הרדמה ברמה כירורגית על ידי צביטת הבוהן לפני שתמשיך.
הערה: פרוטוקולי הרדמה צריכים להיות מתאימים להגדרת ניסוי בהתאמה. Pentobarbital נבחר כאן כחומר הרדמה ארוך פועל, על מנת לגרום להרדמה עמוקה לנהלים ארוכים, תוך שהיא מציעה את האפשרות מחדש מינון קליל. עם זאת, הפסד של בעלי חיים למינון יתר היא בעיה נפוצה בהרדמה pentobarbital. אפשרות נוספת ששומרת על רפלקסים אוטונומיים במידה גדולה יותר מאשר pentobarbital היא קטמין בשילוב עם תרופות הרגעה כגון xylazine או medetomidine, אשר עם זאת מתירה רק למחזור המינון מחדש אחת. - לגלח בעלי חיים בצד של הגוף שיש לו את המחלה גרורתית, ובאזור הצוואר, באמצעות קליפר. נגב את כל השיער הפזור שנותר מהעור. לאחר שיער רופף הוסר, תחול משחה וטרינרים לעיניים, כדי למנוע מהם מהתייבשות.
הערה: ייתכן שיש לי חולדות בעירום athymic שיער שיורית שrequiהסרת מיל לפני שתמשיך עם פרוצדורות כירורגיות. חשוב מאוד להסיר את כל השיער ביסודיות, כפי שהוא עלול להפריע לנהלים והדמיה כירורגית. - תקן את החיה במצב שכיבה על לוחית מתכת שמונחת על כרית חימום שהופץ מים 37 מעלות צלזיוס. הגפיים הקדמיים ואחוריים קבועים על הצלחת עם קלטת.
הערה: כדאי לשלוט ולהקליט סימנים חיוניים, כגון קצב לב וחמצון דם עורקים באמצעות oximeter דופק, בכל הליכים כירורגיים וניסיוניים.
- בחר בעלי חיים עם נוכחות של מחלה גרורתית. הזרק חיה עם ד intraperitonealOSE של 50 מ"ג / קילוגרם pentobarbital. לאשר הרדמה ברמה כירורגית על ידי צביטת הבוהן לפני שתמשיך.
- אינטובציה לקנה הנשימה
- על מנת למקם קטטר לאוורור של בעלי החיים, ראשון לעשות חתך רוחבי בצוואר הרחם עור, ואחריו את ההפרדה החציוני של הגחון שרירי האורך לקנה הנשימה.
- שימוש חוזר פעולת פתיחה לסגירה עם מלקחיים חדים ליצור מעבר לתפר באמצעות צד הגב של קנה הנשימה.
- לעשות חתך קטן לתוך קנה הנשימה על tצד שהוא הגחון, לא יותר מחצי עגול, כ בין הטבעת לקנה הנשימה השנייה ושלישית. השאר חלק של קנה הנשימה החשוף על פני השטח הגב ארוך מספיק, כדי לאפשר קיבוע של הצנתר לקנה הנשימה.
- הכנס 2.5-3.0 מ"מ "Y" צינורית לקנה הנשימה לתוך קנה הנשימה, ולהדק עם תפר 4-0 monofilament. להבטיח את הצינורית מחוברת למכונת נשמה באופני לחץ עם בקבוק מחובר לצינור התפוגה כי הוא מלא עם 6 סנטימטר של מים, כדי לשמור על לחץ ריאתי חיובי. גז Inflowing צריך להיות 100% חמצן, אלא אם כן רצוי בניסוי אחר.
- הכנס קטטר עם מחט G 25-27, ומלא מלוח heparinized לאחד מורידי הזנב של החולדה, ולתקן במקום עם קלטת.
הערה: ודא patency של הקטטר וריד זנב לאורך כל ההליך על ידי הזרקת כמות קטנה של מלח heparinized שוב ושוב לוריד הזנב. כמו כן, אינטובציה oro-קנה הנשימה, כלומר הדרכתו של קנה הנשימהצינור דרך הפה של החיה המורדמת ועבר הגרון לתוך קנה הנשימה, הוא אלטרנטיבה אפשרית להליך tracheotomy שמתואר כאן. עם זאת, שיטה זו דורשת הכשרה וניסיון מיוחדים, כדי למנוע נזק לקנה הנשימה, וגם כדי למנוע את cannulation המקרי של הוושט.
- יישום של חלון ריאתי
- הסר את העור מהצד של החזה שבו המחלה גרורתית ממוקמת, על ידי יצירת חתך, ולאחר מכן ניתוק העור באמצעות לנתיחה בוטה.
הערה: העור ניתן נכרת והוסר לאחר ההתרחקות - המשך על ידי לנתח שתי שכבות של שרירים שכיסה (pectoralis, serratus, וdorsi latissimus), אבל משאיר את השרירים הבין- ללא פגע. צור ניקוב בחלל החזה של כ 1.5 סנטימטרים קוטר, על ידי הסרת חלקים מבדרך כלל שתי צלעות סמוכות. באופן אידיאלי, לאתר את הניקוב באזור של r שישית והשביעיתסמונת המעי הרגיז.
- Osteotomy:
- כדי למזער את הדימום ונזק למשטח הריאות, בחוזקה להחזיק את הצלעות ללחתוך עם מלקחיים כירורגיים שיניים במהלך חיתוך. בעזרת מספריים כירורגיות, לחתוך בצד המדיאלי של הצלע ראשונה, בזווית של 45 מעלות כ, עוזב את הצד המחודד של עצם הצלע שנותר מחוץ מצביע.
- בהמשך לכך, לחתוך בצד הלטרלי של עצם הצלע באופן דומה, שוב עוזב את הצד המחודד של עצם הצלע מצביע כלפי חוץ, כדי למנוע נזק למשטח הריאות.
- חזור על התהליך עבור הצלעות הסמוכות, ואז לחתוך את שרירי הצלע ולהסיר את החתיכה נכרתה. במהלך הליך זה, לשמור על לחץ ריאה באופן שאינטראקציה מכאנית בין משטח הריאות וכלוב הצלעות ממוזערת. עושה זאת על ידי כראוי ויסות לחץ השראה במכונת ההנשמה.
- החדרה של החלון:
- הכנס חלון ריאות בהתאמה אישית, בהיקף של coverglass שהואמחובר לשקע פרספקס (איור 1). צרף את החלון לשקע ידי הדבקה, או על ידי מריחת כמות קטנה מאוד של שומן ואקום. הכנס את החלון באופן שגרורות משטח נמצאות קרוב למרכז של החלון. במידת צורך, להתאים את החור הוכנס להביא micrometastasis למרכז החלון על ידי להגדיל את החור מעט לצד, בהתאמה.
הערה: מחלה גרורתית על פני השטח pleural יכולה להיות מזוהה כנקודות מזוהות בבירור לבנה או אזורים בתוך החלקים אחרים הוורודים לסלמון בצבע הבריא של פני השטח ריאות המופיעים בעיקר לאורך הסדקים. בעוד micrometastases יכול להתרחש באזורים אחרים של חיצוני pleural, שורות תאים נחקרו כמעט תמיד להציג חיפוי micrometastases באזור המחורר, פעם מחלה גרורתית יכולה להתגלות radiologically. - לאחר הכנסת השקע לניקוב, ויצירת קשר ישיר עם אדר הקרביים של lung, תפר את הקצוות של מסגרת החלון לשריר הצלע שמסביב, באמצעות תפר 4.0 monofilament (איור 1 ג). השתמש בעלייה קלה של לחץ השראה במכונת ההנשמה כדי לעזור אוויר שייר לברוח וליצור חותם.
הערה: קצב הנשימה של חולדות יכול להשתנות במידה רבה, בהתאם למצב של הרדמה, מצב של התרגשות או חרדה, ריכוז חמצן באוויר השראה (FiO 2), וכו 'זה recommendable כדי להתאים את קצב הנשימה בין 70 ל -90 פעימות לדקה. לחץ ההשראה צריך להיות מותאם בזהירות ולא להיות מוגדר יותר מ כ. 8 סנטימטרים H 2 O (0.6 מ"מ כספית), כדי למנוע נזק למשטח הריאות.
- הכנס חלון ריאות בהתאמה אישית, בהיקף של coverglass שהואמחובר לשקע פרספקס (איור 1). צרף את החלון לשקע ידי הדבקה, או על ידי מריחת כמות קטנה מאוד של שומן ואקום. הכנס את החלון באופן שגרורות משטח נמצאות קרוב למרכז של החלון. במידת צורך, להתאים את החור הוכנס להביא micrometastasis למרכז החלון על ידי להגדיל את החור מעט לצד, בהתאמה.
- מקם את החיה בעוצר נועד מותאם אישית שנועד לחסל את תנועת Z-כיוונית (1D איור) על צלחת פלדה שממוקמת על שמיכת חימום תרמוסטטי (חשמל), תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לשלוט בגופו של בעל החייםטמפרטורה באמצעות thermistor רקטלית. התאם את הברגים של עוצר בעלי החיים, ולחץ ההשראה במכונת ההנשמה להשיג שליטה אופטימלית של תנועה לרוחב.
הערה: נשימה טבעית ביונקים כוללת את כל שלושת כיוונים של תנועת ריאות והארכת חזה: וקרניו-הזנב בין שתי המדינות, dorso- גחון,. על מנת לשמר את תנועת הנשימה הטבעית ככל האפשר, חשוב למזער דחיסת Z-כיוונית במידת הצורך. בגלל האיפוק Z-ממדי יש הפוטנציאל להציג חפצים שעשויים להשפיע על זרימת דם ופרמטרים נוספים, רצוי לשמור על תנאים קבועים בסדרה של מדידות חוזרות ונשנות באותה החיה.
- הסר את העור מהצד של החזה שבו המחלה גרורתית ממוקמת, על ידי יצירת חתך, ולאחר מכן ניתוק העור באמצעות לנתיחה בוטה.
4. הדמיה ומדידה של זרימת דם microcirculatory
- איסוף תאי דם אדומים באמצעות לנקב לב ולתייג אותם עם DiI (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 פרכלורט =, 3 = -tetramethyl-indocarbocyanine), כפי שתואר לעיל <sup> 10.
- להזריק 300 μl של תאי דם אדומים שכותרתו לוריד הזנב של העכברוש לפני ניתוח חלון התא נעשה, כדי למנוע תופעות הידבקות הראשונות לעבור לחלון הזכוכית. לחסל את כל בועות אוויר במזרק או צנתר, כמבוא של אוויר לתוך הווריד ימנע כל זריקות נוספות.
- זרימת דם תמונה עם מצלמת CCD מיקרוסקופ בשבב -40 ° C קירור טמפרטורה, וכ 100X רזולוציה כוללת (כלומר עם מטרת מיקרוסקופ 10X, 10X ועיני לפני מצלמה). השתמש במערכות סינון Rhodamine / TRITC סטנדרטיים (ננומטר 450-490 עירור, פליטה> 515 ננומטר). רשום את הרזולוציה מסגרת הדולר ופיקסל בפועל של רצפי תמונה המתקבלות. שיא לפחות 200 (רצוי סביב 300) תמונות לערימה, כדי להבטיח ניתוח מוצלח של מהירות זרימה.
- לחדש אובדן נוזלים בבעלי החיים על ידי הזרקה כ 1 מיליליטר של ip מלוח כל שעה.
הערה: הגדרות ניסויית שכרוכות בהתערבות, למשלתרופה שמשנה את מהירות זרימת דם בגרורות סרטן ריאה, דורשת מדידות חוזרות ונשנות של זרימת דם במהירות הסרטן גרורתי ריאתי. בניסויים מורחבים אלה, חשוב לחדש את החיה עם נוזל מספיק. - להרדים בעלי החיים על ידי עירוי של 3 מיליליטר של 3N KCl לתוך וריד הזנב
- להעריך את ערימות תמונה באמצעות אלגוריתם שפורסם, זמין בפומבי מבוסס Matlab מחשב שייצור בגווני אפור מהירות זרימה ומפות בצבע המקודדת לכל זרימת הדם עוקב 10,11. בהמשך לכך להעריך את התמונות בגווני אפור וכתוצאה מכך על ידי שימוש בתוכנת ניתוח תמונה מסחרית או זמינה לציבור, כגון התמונה J, לאחר thresholding את ערכים המצביעים על שום תנועה של תאי דם, כלומר אין כלי דם פעילים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כלי הדם בגידולים מוצקים ידוע שונה באופן משמעותי מאספקת דם נורמלית, מראים דרגות גבוהות יותר של tortuosity, ומרחקי intervascular גבוהים יותר 13. בהתאם לכך, יש לי זרימת דם במסלולי גרורות סרטן השד וסרקומה ריאה ניסיונית צורות חריגות ופערים intervascular גדולים (איור 2 א, שני לוחות נמוכים) בהשוואה לזרימת דם ריאתי הנורמלית (איור 2 א, פנל עליון). במחקר קודם, את היכולת של שיטת חלון הריאות הודגמה לבצע מדידות אוטומטיות של שינויים בזרימת דם במהירות ריאות נורמליות 10. על מנת לבדוק האם שיטת החלון ריאתי גם יכולה למדוד עלייה בזרימת דם במהירות גרורות ריאתי, שילוב של תרופת אפדרין הסמים sympathomimetic וambrisentan חוסם אנדותלין לאחרונה כי כבר נמצא להגביר את זרימת כלי הדם לריאות בריאה,יושם כאן (הנתונים בבדיקה במקום אחר). במחקר זה, את היכולת של השיטה מוצגת לזהות עלייה בזרימת דם במהירות גרורות ריאות של סרקומה עכבר, שנגרמה על ידי מינון עם שילוב של אפדרין (20 מ"ג / קילוגרם) וambrisentan אנטגוניסט לרצפטור אנדותלין (0.5 מ"ג / קילוגרם, שתי תרופות intraperitoneally, איור 2). כל נקודת נתונים מייצגת את ממוצעי פרט המשולבים של שלוש מדידות בחמש דקות בממוצע בנתונים שנרכשו בחמישה בעלי חיים. הזריקה הראשונה באופן משמעותי (p <0.01) זרימת דם מהירות מוגברת באזור הגידול מ0.61 ± 0.12 מ"מ / sec ל0.74 ± 0.19, ואילו הזריקה השנייה שמרה על מהירות זרימה הגבוהה ב0.74 ± 0.19 מ"מ / sec (). הזריקה השנייה לא לעורר עלייה נוספת כלשהי בזרימת דם מהירות. N = 5, כל הנתונים הסטטיסטיים: צעדים חוזרים ונשנים ANOVA.
איור 1:. פרוצדורה כדי להכין עכברוש ריאות גרורות נושאות הדמיה מיקרוסקופית חי (א) תמונת microCT של גרורות ריאות נושא עכברוש (חץ) מסגרת חלון ריאתי (B) חולדה (C) עם חזה ניקוב וחלון ריאתי.. מצורף. מכשיר הרחקה (ד ') כדי להגביל את תנועת חזה Z-כיוונית. עכברוש (E) עם חלון תא ומכשיר ריסון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הערה: C הפנל ושיער תכנית E נושאות חולדות ספראג Dawley, לא athymic חולדות בעירום.
איור 2: כימות של עליות בזרימת דם ריאתי גרורות. (א) את זרימת דם לכיוון ומהירות בנורמליריאות, וגרורות סרטן מMDAMB-231 וסרקומה עכבר. העמודה בצד השמאל מכילה יריות הצמד סדרת תמונה של micrographs הקרינה מ. Alveolae יכול להיות מזוהה כחלק מדפוס הקרינה רקע בריאות נורמליות (פנל עליון). גרורות יכולות להיות ממוקמות על ידי הקרינה הנגרמת על ידי חלבוני fluorescing אנדוגני של התאים המוזרקים הסרטן (קו מקווקו). עמודות מימין:. מפות בקידוד צבע של זרימת דם לכיוון (גלגל מחוון צבע מסמן את הכיוון שאליו תאי זרימה) ומהירות זרימה, נמדדו במ"מ / שני (B) שינויים בזרימת דם microcirculatory לאחר הזרקה חוזרת ונשנית של אפדרין בשילוב ו ambrisentan (20 ו 0.1 מ"ג / קילוגרם להזרקה). גידול משמעותי במהירות זרימה כוללת (מדידות החוזרות ANOVA, p <0.01) נצפה לאחר הזריקה הראשונה, אבל לא אחרי השנייה (N = 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל מוצג שאינו ריאלי לשינויים בזרימת דם תמונת microcirculatory ותהליכים דינמיים אחרים בגרורות ריאות של חולדות, באמצעות מיקרוסקופ intravital וזרימת דם אנליזה חישובית. בעוד שיטות אחרות קיימות כדי לבצע מיקרוסקופיה על ריאות שנחשפו בבית החזה פתוח של מכרסמים, מודל זה הוא גם ראשון שגרורות ריאתי תמונה דרך קיר חזה ניקוב בסביבה סגור חזה. באמצעות שיטה זו, ההיתכנות מוצגת למדוד שינויים מושרה פרמקולוגית בזרימת דם microcirculatory של גרורות ריאתי.
שתי שיטות בסיסיות קיימות לתמונת הריאות של מכרסמים חיים שperfused על ידי זרימת דם ספונטנית, עם קשר ישיר אל פני השטח הריאה: מודלים חזה פתוחים לחסל את הבעיה של תנועה המתמדת של הריאה עקב פעילות נשימה ולב על ידי יישום חלון יניקה על פני השטח של הריאה, ובמקביל לאפשר את שאר מורכבת לב-הריאה לexpוחוזה בתוך 7,14 חלל חזה פתוח. בעוד ששיטה זו מספקת גישה ניסיונית מצוינת, תנאי החזה הפתוחים וחלון היניקה להציג את הממצאים בהשוואה לתנאים של ריאה שלמה 8. לחלופין, נהלים סגור חזה שישאירו את כלוב הצלעות שלמים ברובו לשאת את ההבטחה של שמירה על התנאים המקוריים בחלל החזה שלם, כגון ההשפעה ההדדית של תנועת לב וריאות בזרימת הדם אחד של השני דינמית. מודלים אלה בדרך כלל כרוכים במסגרת עם חלון שנתפר לקיר החזה 15, או קרום שקוף כי הוא הביא במגע ישיר עם משטח הריאות כדי למנוע התייבשות של הרקמה 9. הקושי של משא ומתן תנועת הלב-הריאה כדי להכיל ולאפשר הדמיה מיקרוסקופית הוא אתגר גדול טכני של נהלים סגורים חזה, וכנראה אחראי להתפשטות הכוללת הנמוכה של טכניקה זו. במקרה שלנו, השילוב שלמסגרת מחזיק חלון מוצק והתקן ריסון Z-כיוונית הוכיחה יעילים במידה מספקת כדי למנוע תנועה לרוחב של הריאות על מנת לאפשר זרימת דם מדידות אוטומטיות של מחזור הדם הריאתי בחלון סגור חזה 10.
שיטה נפוצה למדידת זרימת דם מהירות מארובות תמונה מיקרוסקופית intravital הוא השימוש בהתאמה המרחבית של זרימת דם דפוסים בתמונות רצופות של קטע של כלי דם ניתנו 14. על מנת להקטין את מאמץ הזמן הקשורים לניתוח של כלי דם בודדים, אלגוריתם הדמיה זרימת דם כבר הציג שמייצרת זרימת דם מפות מהירות של השדה האופטי כל 11. מלבד יתרון הזמן, שיטה זו גם מאפשרת ניתוח מרחבי בו זמנית של זרימת דם בכל תחום האופטי, ללא קשר למורפולוגיה של כלי דם או נקודות הסתעפות. הדבר חשוב במיוחד כאשר לומדים מייקרו-הסביבה של הגידול, שבו כלי דם מרובים contriביוט למעמד אספקת אזור גידול נתון 13,16,17. ואכן, tortuosity הידוע של כלי דם של גידול וקיומם של פערי intervascular גדולים ניתן לראות בבירור בשני סוגי הסרטן גרורתי שנחקרו, (איור 2 א). שיטת החלון ריאתי גם נבדקה ביכולתה לדווח על שינויים בזרימת דם במהירות הנגע גרורתי, על ידי מדידת ההשפעה של טיפול תרופתי לאחרונה כי כבר מצא כדי להגביר את זרימת דם המהירות במחזור דם ריאתי: אפדרין הסמים יתר לחץ הדם מגביר את תפוקת לב, ואילו ambrisentan חוסם קולטני אנדותלין מפחית את טון arteriolar מראש נימים, שתוצאתה, כאשר ניתנות תרופות בשילוב, בזרימת דם מוגברת מהירות בנימי ריאה. אף שנתונים אלה הם כעת בבדיקה במקום אחר, את היכולת של השילוב של תרופות יתר לחץ דם ואנטגוניסט לרצפטור אנדותלין להגדיל שרירים היקפייםזלוף כבר פורסם באופן עצמאי 18. בעוד בתנאים רגילים, עלייה תלוית מינון של זרימת דם מהירות ניתן לצפות לאחר שני הזריקות, העובדה שהזריקה השנייה לא תביא לגידול נוסף של מהירות זרימה בגרורות סרקומה עשויה לנבוע מכך שהתרחבות כלי גידול מקסימאלי הושג כבר לאחר ההזרקה המשולבת הראשונה של אפדרין וambrisentan.
המגבלות הבאות חלות על הטכניקה שהוצגה כאן: פרוטוקול זה חל על חולדות (ובאופן תיאורטי, יונקים בגודל דומים) מכ 180-300 גר 'או יותר. יונקים קטנים כגון עכברים ידרשו שינוי מיוחד כדי להתאים את האנטומיה ופיזיולוגיה שבירות יותר של כלוב הצלעות. הרזולוציה מרחבית המקסימלי שניתן להשיג עם הטכניקה המוצגת באופן תיאורטי מוגבלת רק על ידי הצמצם המספרי של המטרה ואת העובי של שקופית הכיסוי המשמשת (~ 0.08-.1 מיקרומטר במותגים סטנדרטיים), למטרות 100X, עם השימוש בטבילת שמן. בפועל עם זאת, התנועה הנותרת של הריאות עשויה להגביל את השימוש ביעדים ברזולוציה גבוה מעבר 20X. אם כל התנועה האוטונומית של הריאה מסולקת, ההחלטה הזמנית של הטכניקה מוגבלת רק על ידי קצב הפריימים של המצלמה, ואת עוצמת האות של תווית הניאון, הקובעת את זמן החשיפה, לכ -100 מסגרות לשנייה. המגבלות נוספות הבאות חלות על הטכניקה שהוצגה: מחד, ההגדרה המיקרוסקופית וחישובית הנוכחית מאפשרת רק הניתוח של פני השטח של גרורות נתון. השימוש במיקרוסקופ חודר לעומק, כגון אסטרטגיות הדמיה מיקרוסקופית confocal מתקדמות, עשוי בעתיד לאפשר מדידה של זרימת דם מהירות ב 3 ממדים. כמו כן, הטכניקה שהוצגה לא יכולה, בצורתה הנוכחית, לשמש כדי לחזות נגעים נוספים בתוך parenchyma הריאות. שלישית, החדרת בשטח בנויחלון ss במגע ישיר עם כלי דם פעילים יש כמה פוטנציאל להפריע את זרימת כלי דם על ידי עצמו, באמצעות דחיסה המרחבי של כלי דם, או על ידי המשפיע טמפרטורת locoregional. רביעית, השימוש בהנשמה חיצונית ולחץ חיובי בריאות יש גם פוטנציאל לשנות את זרימת דם ריאתי microcirculatory. יתר על כן, רק באזורים מוגבלים של כלוב הצלעות הם כמעט נגישים להליכים כירורגיים, יחסית מסובכים שתוארו. תחומים אחרים של פני השטח הריאה, כגון גישה המדיאלי-הגחון או גב ידרשו טכניקות כירורגיות משוכללות יותר, יחד עם הפרעות עמוקות של ביומכניקה של כלוב הצלעות. בגלל היעדר האלטרנטיבות במיקרוסקופ הדמיה ללמוד את זרימת דם microcirculatory, ניתן לצפות התפתחויות עיקריות בעתיד הקרוב ללהתגבר על מכשולים אלה וללמוד ממאירות ברזולוציה של זמן-מרחב גבוהה בכל חלקי הריאות מכרסמים.
לסיכום, שיטה היא פרהented למדוד דפוסים, ושינויים ב, כלי דם זרימת דם במהירות גרורות של ריאות עכברוש פני השטח. שילוב מודל כירורגית סגור חזה חריף עם שיטה אוטומטית למדידת זרימת דם מהירות בתחום האופטי המיקרוסקופי כל, טכניקה זו מציעה שימור יחסי של הסביבה הפיזיולוגית של הריאה, מסוגלת לזהות שינויים בזרימת הדם כללית microcirculatory מהירות וכיוון , והוא יחסית קל לשימוש. ניתן לצפות כי טכניקה זו תהיה תועלת רבה לכל הקבוצות שלומדות את זרימת דם ריאתי של גרורות ותהליכים דינמיים אחרים בהגדרת מחלה זו במודלים של מכרסמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude rats | Charles River | Strain code 316 | Female 10 week-old athymic nude rats |
| micro-CT/micro-Irradiator | Precision X-ray Inc. | Xrad 225Cx | Use MicroCT to detect metastases |
| DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | TOPO Small Animal Ventilator | Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax |
| Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright | Zeiss | Axioskop | Microscope for intravital imaging |
| Andor CCD camera | Andor | iXonEM 885 | CCD camera for live imaging of blood flow |
| Pulse oximeter | StarrLife | MouseOx | Pulse oximeter |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop | Fluorescence microscope |
References
- Billingsley, K. G., et al. Pulmonary metastases from soft tissue sarcoma: analysis of patterns of diseases and postmetastasis survival. Ann Surg. 229, 602-610 (1999).
- Rashid, O. M., Takabe, K. The evolution of the role of surgery in the management of breast cancer lung metastasis. J Thorac Dis. 4, 420-424 (2012).
- Mayer, A., Vaupel, P. Hypoxia, lactate accumulation, and acidosis: siblings or accomplices driving tumor progression and resistance to therapy. Advances in experimental medicine and biology. 789, 203-209 (2013).
- Okunieff, P., O'Dell, W., Zhang, M., Zhang, L., Maguire, D. Tumor oxygen measurements and personalized medicine. Advances in experimental medicine and biology. 765, 195-201 (2013).
- Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nature protocols. 6, 1355-1366 (2011).
- Palmer, G. M., et al. Optical imaging of tumor hypoxia dynamics. Journal of biomedical optics. 15, (2010).
- Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59, 361-367 (2000).
- Kuebler, W. M. Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses. Proc Am Thorac Soc. 8, 458-465 (2011).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. Am J Respir Crit Care Med. 188, 474-481 (2013).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304, 86-91 (2013).
- Fontanella, A. N., et al. Quantitative mapping of hemodynamics in the lung, brain, and dorsal window chamber-grown tumors using a novel, automated algorithm. Microcirculation. , (2013).
- Newton, J., et al. Commissioning a small-field biological irradiator using point, 2D, and 3D dosimetry techniques. Medical physics. 38, 6754-6762 (2011).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in radiation oncology. 14, 198-206 (2004).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57, 385-393 (1994).
- Manzoor, A. A., Schroeder, T., Dewhirst, M. W. One-stop-shop tumor imaging: buy hypoxia, get lactate free. The Journal of clinical investigation. 118, 1616-1619 (2008).
- Evans, S. M., et al. Imaging and analytical methods as applied to the evaluation of vasculature and hypoxia in human brain tumors. Radiation research. 170, 677-690 (2008).
- Radiloff, D. R., et al. The combination of theophylline and endothelin receptor antagonism improves exercise performance of rats under simulated high altitude. Journal of applied physiology. 113, 1243-1252 (2012).
