Protocol
OBS: Alla djurrelaterade procedurer som beskrivs i detta protokoll har tidigare godkänts av Duke University Institutional Animal Care och användning kommittén (DUIACUC).
1. Cancer Cell Culture och Injektion
- Odla fluorescerande metastasercancerceller (t.ex. mänskliga MDAMB231-GFP bröstcancerceller, gåva från Dr. Patricia Steeg, NCI och YFP-märkta mus sarkomceller, gåva från Dr David Kirsch, Duke University Medical Center, Institutionen för strålnings Oncology) i lämpligt odlingsmedium (t ex Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptavidin) vid 37 ° C tills ca 90% konfluenta.
- Trypsinisera celler, tvätta dem två gånger med PBS, räkna och sedan spruta in dem i svansvenerna isofluran-sövd 10 veckor gamla kvinnliga naken råttor vid 5 miljoner celler per djur, med hjälp av en spruta med en 27 G nål. Kirurgiska level anesthesia verifieras av bristen på reaktion på tå nypa.
2. Övervakning av Metastaser Använda microCT
- Undersök råttor en gång i veckan med hjälp av en mikro-CT / mikro-bestrålare, för att upptäcka förekomst av metastaser ovan ca 2 mm i diameter i diameter. Mikro CT uppdrag som tidigare beskrivits 12.
- Ämnes råttor till 3% isoflurananestesi före avbildning. Bekräfta djup anestesi med tå nypa.
- Efter starten av anestesi, snabbt överföra råttor till bild vaggan i bildbehandling kammaren och ansluta via en noskonen till en isofluran-luftblandning vid 2,5-3%. Justera positionen på råttan i vaggan på ett sätt som dess Bröstkorgen placeras i fotonstråle av microCT scanner, med hjälp av externa positionskontroller och laser avgränsare på bild vaggan. Säker dörren till avbildningskammaren är stängd, för att skärma utredaren från gammastrålar.
- Styra positionen för djuret igen medden färgvideokamera. Genomför en lågupplöst CT provkörning, och använda den resulterande bilden för att justera synfältet till xyz dimensioner brösthålan.
- Bild råtta thorax med hjälp av en 2 mm Al-filter vid 40 kVp, 2,5 mA, och 0,008 voxel vid 7 FPS och tillbaka djuret till sin bur. Avbildning av ett djur bör ta högst 15 eller 20 minuter. Skicka inte tillbaka ett djur som har genomgått en operation för att bolaget av andra djur tills återhämtat sig helt. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräckligt medvetandet för att upprätthålla sternala VILA.
- Bekräfta metastaser genom uppkomsten av relativt radioopaka objekt som inte kan förklaras av intratorakala blodkärl (Figur 1A)
3. Fönster avdelningen Kirurgi
- Anestesi, vitala tecken och svansvenen kateterisering
- Välj djur med förekomst av metastaserad sjukdom. Injicera djur med en intraperitoneal dose av 50 mg / kg pentobarbital. Bekräfta kirurgisk-nivå anestesi genom tå nypa innan du fortsätter.
Obs: Anestesi protokoll bör anpassas till respektive experimentuppställning. Pentobarbital valdes här som en långverkande bedövningsmedel, för att framkalla djup anestesi för långdragna förfaranden, samtidigt som den erbjuder möjlighet till enkel re-dosering. Emellertid är förlust av djur till överdosering ett vanligt problem med pentobarbital anestesi. Ett annat alternativ som bevarar autonoma reflexer till en större grad än pentobarbital är ketamin i kombination med lugnande medel, såsom xylazin eller medetomidin, som dock endast tillåter för en enda återdoseringscykel. - Raka djur på den sida av det organ som har den metastatisk sjukdom, och i nackområdet, med användning av en klippmaskin. Torka bort alla återstående löst hår från huden. Efter lösa hår tas bort, tillämpa veterinär salva till ögonen, för att hindra dem från uttorkning.
OBS: Atymiska nakna råttor kan ha rest hår som behöver utförasres avlägsnande innan du fortsätter med kirurgiska ingrepp. Det är mycket viktigt att ta bort allt hår ordentligt, eftersom det kan störa kirurgiska ingrepp och bildbehandling. - Fäst djuret i ryggläge på en metallplatta som är placerad på en 37 ° C vatten cirkuleras värmedyna. De främre och bakre extremiteter är fixerade på plattan med tejp.
OBS: Det är nyttigt att kontrollera och registrera vitala tecken, såsom hjärtfrekvens och syresättning arteriellt blod med hjälp av en pulsoximeter, hela kirurgiska och experimentella procedurer.
- Välj djur med förekomst av metastaserad sjukdom. Injicera djur med en intraperitoneal dose av 50 mg / kg pentobarbital. Bekräfta kirurgisk-nivå anestesi genom tå nypa innan du fortsätter.
- Trakealintubation
- För att placera en kateter för ventilation av djuret, först göra en tvärgående cervikal hudsnitt, följt av mittseparering av longitudinella muskulaturen ventrala till luftstrupen.
- Använd upprepad öppning till stängning med en vass pincett för att skapa en passage för suturen genom ryggsidan av luftstrupen.
- Gör ett litet snitt i luftstrupen på than ventrala sida, inte mer än halvcirkulär, ungefär mellan den andra och tredje trakeal ringen. Lämna en tillräckligt lång del av luftstrupen exponeras på den dorsala ytan, för att möjliggöra fixering av trakeal katetern.
- Sätt i ett 2,5-3,0 mm "Y" trakealkanylen i luftstrupen, och dra åt med en 4-0 monofilamentsutur. Säker kanylen är ansluten till en tryck cyklade ventilator med en flaska som är ansluten till utgångskanalen som är fylld med 6 cm vatten, för att upprätthålla en positiv lungtrycket. Inströmmande gasen bör vara 100% syrgas, om inte experimentellt önskat annat.
- Sätt i en kateter med en 25 till 27 G nål, och fylldes med hepariniserad koksaltlösning i en av svansvenerna hos råtta, och fäst med tejp.
OBS: Se till öppenheten hos svansvenen katetern under hela förfarandet genom att upprepande injicera en liten mängd av hepariniserad saltlösning i svansvenen. Även oro-trakealintubation, dvs ledning av en trakealröret via mynningen av bedövade djuret och förbi struphuvudet i luftstrupen, är ett möjligt alternativ till den trakeotomi förfarande som beskrivs här. Emellertid kräver denna metod speciell utbildning och erfarenhet, för att undvika skada på luftstrupen, och även för att hindra oavsiktlig kanyle av matstrupen.
- Tillämpning av pulmonell fönster
- Ta bort skinnet från sidan av bröstet, där det metastatisk sjukdom är belägen, genom att skapa ett snitt, och sedan lösgöra huden med användning av trubbig dissektion.
Obs: Huden kan skäras och avlägsnas efter lösgör - Fortsätt genom att dissekera de två lagren av överliggande muskulatur (pectoralis, serratus och latissimus dorsi), men lämnar interkostalmuskulaturen intakt. Skapa en perforering i brösthålan på ca 1,5 cm i diameter, genom att ta bort delar av typiskt två närliggande ribbor. Helst lokalisera perforeringen i den region i sjätte och sjunde ribs.
- Osteotomi:
- För att minimera blödning och skador på lungytan, tätt hålla ribban som skall skäras med en tandad kirurgisk tång under skärning. Använda kirurgiska saxar, skär den mediala sidan av ribban första, med en vinkel på approximativt 45 °, vilket lämnar den spetsiga sidan av den återstående ribb ben pekar utanför.
- Därefter skär den laterala sidan av ribban ben på ett liknande sätt, åter lämnar spetsiga sidan av ribban ben riktade utåt, för att förhindra skador på lungytan.
- Upprepa proceduren för den intilliggande revben, klipp interkostal muskler och ta bort utskurna pjäs. Under denna procedur, upprätthålla lungtrycket på ett sätt som mekanisk växelverkan mellan lungytan och bröstkorgen minimeras. Gör detta genom att på lämpligt sätt reglera inspiration tryck på ventilatorn.
- Montering av fönstret:
- Sätt i en specialtillverkad lungfönster, som består av en coverglass som ärfäst till en plexiglas uttag (Figur 1B). Fäst fönstret till uttaget genom limning, eller genom att applicera en mycket liten mängd av vakuum fett. Sätt i fönstret på ett sätt som ytan metastaser ligger nära centrum av fönstret. Om det behövs, justera insatt hålet för att få mikrometastas till mitten av fönstret genom att förstora hålet något till respektive sida.
OBS: Metastatisk sjukdom på pleura ytan kan identifieras som tydligt igenkännliga vita prickar eller områden inom övrigt rosa-till-lax färgade friska delar av lungan ytan som visas främst längs sprickor. Medan mikrometastaser kan uppstå på andra områden av pleura exteriör, de undersökta cellinjer nästan alltid visa beläggningsarbeten mikrometastaser i perforerade området, när metastaserad sjukdom kan radiologiskt upptäckas. - Efter insättning av sockeln i perforeringen, och skapa direkt kontakt med den viscerala lungsäcken av lUng, sutur kanterna på fönsterramen till den omgivande interkostal muskel, genom att använda 4,0 monofilamentsutur (Figur 1C). Använd en lätt ökning av inandningstryck på ventilatorn att hjälpa kvarvarande luft att avgå och att skapa en tätning.
Obs: Respirationshastigheten av råttor kan variera kraftigt, beroende på statusen för anestesi, status av spänning eller ångest, syrekoncentration av inandad luft (FiO 2), etc. Det är rekommendabelt att justera andningsfrekvensen mellan 70 och 90 slag per minut. Inspirationen trycket bör justeras med försiktighet och inte ställas in på mer än ca.. 8 cm H2O (0,6 mm Hg), för att undvika skador på lungytan.
- Sätt i en specialtillverkad lungfönster, som består av en coverglass som ärfäst till en plexiglas uttag (Figur 1B). Fäst fönstret till uttaget genom limning, eller genom att applicera en mycket liten mängd av vakuum fett. Sätt i fönstret på ett sätt som ytan metastaser ligger nära centrum av fönstret. Om det behövs, justera insatt hålet för att få mikrometastas till mitten av fönstret genom att förstora hålet något till respektive sida.
- Placera djuret i en specialdesignad rainer som är utformad för att eliminera Z-riktad rörelse (figur 1D) på en stålplatta som är placerad på en termostatisk (elektrisk) värme filt, under ett fluorescensmikroskop. Styr djurets kropptemperatur med hjälp av en rektal termistor. Justera skruvarna av djuret rainer, och inspirationen trycket på ventilatorn för att uppnå optimal kontroll av sidorörelse.
Obs: Naturlig andning hos däggdjur involverar alla tre riktningar av lung rörelse och bröst förlängning: bilateralt, dorso-ventral, och kranio-caudal. För att bevara den naturliga andningsrörelsen så mycket som möjligt, är det viktigt att minimera Z riktad kompression i erforderlig omfattning. Eftersom Z-dimensionell återhållsamhet har potential att införa artefakter som kan påverka blodflödet och andra parametrar, är det tillrådligt att hålla förhållanden konstant under serier av upprepade mätningar i samma djur.
- Ta bort skinnet från sidan av bröstet, där det metastatisk sjukdom är belägen, genom att skapa ett snitt, och sedan lösgöra huden med användning av trubbig dissektion.
4. Imaging och Mätning av blodcirkulationens Blood Flow
- Samla röda blodkroppar via hjärtpunktur och märka dem med DII (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 =, 3 = -tetrametyl-indocarbocyanine perklorat), som beskrivits tidigare <sup> 10.
- Injicera 300 | il av märkta röda blodkroppar i svansvenen hos råttan innan fönstret kammaren operation görs, för att undvika första passage vidhäftningseffekter till glasfönstret. Eliminera eventuella luftbubblor i sprutan eller kateter, som införandet av luft i venen kommer att hämma ytterligare injektioner.
- Bild blodflöde med ett mikroskop CCD-kamera vid -40 ° C chip kyltemperatur, och cirka 100X övergripande upplösning (dvs med en 10X mikroskop mål, och 10X pre-kamera okulär). Använd standard Rodamin / TRITC filtersatser (excitation 450-490 nm, utsläpp> 515 nm). Spela den faktiska bildhastighet och upplösning av de resulterande bildsekvenser. Rekord minst 200 (helst omkring 300) bilder per stack, för att säkerställa ett framgångsrikt analys av flödeshastighet.
- Fyll vätskeförlust i djuret genom att injicera cirka 1 ml koksalt ip varje timme.
OBS: Experimentella inställningar som innebär ett ingrepp, t.ex.ett läkemedel som ändrar blodflödet hastighet i en lung cancermetastas, kräver upprepade mätningar av blodströmningshastighet i lungmetastaserande cancer. För dessa utvidgade experiment, är det viktigt att fylla på djuret med tillräcklig mängd vätska. - Euthanize djuren genom infusion av 3 ml av 3N KCl i svansvenen
- Utvärdera bildstaplar som använder en publicerad, allmänt tillgänglig Matlab-baserade datoralgoritm som kommer att skapa flödeshastighet gråskala och färg kodade kartor för alla blodflödet spår 10,11. Därefter utvärderar de resulte gråskala bilder med kommersiella eller allmänt tillgänglig bildanalys programvara, till exempel Bild J, efter att tröskel off värden som indikerar ingen rörelse av blodceller, dvs ingen aktiv kärl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kärl i solida tumörer är känd för att skilja sig avsevärt från normal blodtillförsel, visar större grader av slingrighet och högre Intervascular avstånden 13. Följaktligen blodflödesspår i experimentella lung bröstcancer och sarkom metastaser har oregelbundna former och stora Intervascular luckor (Figur 2A, lägre två paneler) jämfört med den normala lungmikrocirkulation (Figur 2A, övre panelen). I en tidigare studie förmåga lungfönstermetoden visat att utföra automatiserade mätningar av förändringar i blodflödet hastigheten i normala lungor 10. För att undersöka om lungfönstermetoden även kan mäta en ökning av blodflödet hastighet i lungmetastaser, läkemedelskombination av sympatomimetiska läkemedel efedrin och endotelin blockerare ambrisentan som nyligen har visat sig öka mikrovaskulära cirkulationen hos friska lungor,tillämpades här (data som granskas på annat håll). I denna studie, är förmågan hos den metod som visas för att detektera en ökning av blodflödeshastighet i pulmonära metastaser av mus sarkom, orsakas genom dosering med kombinationen av efedrin (20 mg / kg) och den endotelinreceptorantagonist ambrisentan (0,5 mg / kg, båda läkemedlen intraperitonealt, Figur 2B). Varje datapunkt representerar de poolade enskilda medelvärden av tre mätningar med fem minuters mellanrum, medelvärde över de uppgifter som erhållits i fem djur. Den första injektionen signifikant (p <0,01) ökade blodflödeshastighet i tumörområdet från 0,61 ± 0,12 mm / s till 0,74 ± 0,19, medan den andra injektionen upprätthålls den förhöjda flödeshastigheten vid 0,74 ± 0,19 mm / s (). Den andra injektionen utlöste ingen ytterligare ökning av blodflödet hastighet. N = 5, all statistik: upprepade mätningar ANOVA.
Figur 1:. Förfarande för att framställa en lungmetastaser bärande råtta för live mikroskopi avbildning (A) microCT bilden av en råtta lagerlungmetastaser (pil) (B) Lungfönsterramen (C) Råtta med bröstkorgen perforering och lung fönstret.. bifogas. (D) besöksförbud anordning för att begränsa Z riktad bröströrelsen. (E) Råtta med fönster kammare och bemästrande enhet under fluorescensmikroskop. Obs: panel C och E visar hår bär Sprague Dawley, inte atymiska nakna råttor.
Figur 2: Kvantifiering av ökningar av blodflödet i lungmetastaser. (A) blodflödesriktning och hastighet i en normallunga och en cancer metastaser från MDAMB-231 och mus sarkom. Kolumnen till vänster innehåller snap shots från bildserien av fluorescensmikrofotografier. Alveolae kan identifieras som en del av bakgrundsfluorescens mönster i normala lungor (övre panelen). Metastaser kan lokaliseras av fluorescens orsakad av endogena fluorescerande proteiner av de injicerade cancerceller (streckad linje). Kolumnerna till höger:. Färgkodade kartor av blodflödesriktningen (färgindikator hjulet markerar riktningen mot vilka celler flöde) och flödeshastighet, mätt i mm / sekund (B) Förändringar i blodcirkulationens blodflödet efter upprepad injektion av kombinerad efedrin och ambrisentan (20 och 0,1 mg / kg per injektion). En betydande ökning av den totala flödeshastigheten (upprepade mätningar ANOVA, p <0,01) observerades efter den första injektionen, men inte efter den andra (N = 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En modell presenteras som är möjligt att bildförändringar blodcirkulationens blodflödet och andra dynamiska processer i lungmetastaser av råttor, med hjälp intravital mikroskopi och beräkningsanalys blodflödet. Medan andra metoder finns för att utföra mikroskopi på utsatta lungor i öppna bröstkorgar av gnagare, är denna modell också den första att avbilda lungmetastaser genom en bröstväggen perforering i en miljö med sluten bröstet. Med denna metod är möjligheten visat att mäta farmakologiskt inducerade förändringar i blodcirkulationens blodflödet av lungmetastaser.
Två grundläggande metoder finns för att bilden lungorna av levande gnagare som perfusion genom spontan blodflöde, med direktkontakt till lungan ytan: öppna bröst modellerna eliminera problemet med ständig rörelse i lungan på grund av andnings- och hjärtaktivitet genom att tillämpa ett sug fönster till ytan av lungan, att samtidigt som resten av hjärt komplexet expoch och kontrakt inom en öppen brösthålan 7,14. Även om denna metod ger utmärkt experimentell tillgång, de öppna bröstförhållanden och sug fönster introducerar artefakter jämfört med villkoren i en intakt lunga 8. Alternativt förfaranden slutna bröst som lämnar bröstkorgen i stort sett intakt bär löftet om att bevara de ursprungliga villkoren i intakt brösthålan, såsom den ömsesidiga påverkan av hjärt- och lung motion om varandras blodflöde dynamisk. Dessa modeller innefattar typiskt en ram med ett fönster som sys fast i bröstväggen 15, eller ett transparent membran som bringas i direkt kontakt med lungytan för att förhindra uttorkning av vävnaden 9. Svårigheten att förhandla fram hjärt rörelse för att rymma och möjliggöra mikroskopi avbildning är en stor teknisk utmaning förfaranden slutna bröst, och förmodligen är ansvarig för den låga totala spridningen av denna teknik. I vårt fall, kombinationen avett fast fönster hållande ram och en Z-riktningshållande anordning har visat effektivt för att tillräckligt eliminera rörelse i sidled lungan att tillåta automatiserade blodflödesmätningar av lungcirkulationen i en sluten kista fönstret 10.
En vanlig metod för att mäta blodflödet hastighet från intravital mikroskopi bildstaplar är användningen av rumsliga matchning av blodflödesmönster i rad bilder av en viss kärlsegment 14. För att minska den tid ansträngning i samband med analysen av fartyg enstaka blod har ett blodflöde avbildning algoritm införts som producerar blodflödeshastighets kartor över hela den optiska fält 11. Förutom tidsfördel, denna metod medger också samtidig rumslig analys av blodflödet i hela optiska fältet, oberoende av vaskulär morfologi eller förgreningspunkter. Detta är särskilt viktigt när man studerar tumören mikromiljö, där fartyg flera blod ContriBute till tillförsel status för en viss tumörområdet 13,16,17. I själva verket kan den kända slingrigheten hos tumörvaskulatur och förekomsten av stora Intervascular luckor tydligt ses i både metastatiska cancertyper som har undersökts, (Figur 2A). Den lungfönstermetoden har också testats för sin förmåga att rapportera förändringar i blodflödet hastighet i metastaser lesionen, genom att mäta effekten av en farmakologisk behandling som nyligen har visat sig öka blodflödet hastighet i lungkretsloppet: den hypertensiva drogen efedrin ökar hjärtminutvolym, medan endotelin-receptorblockerare ambrisentan minskar pre-kapillär arteriolär ton, vilket resulterar, när läkemedlen ges i kombination, i ökat blodflöde hastighet i lung kapillärer. Även om dessa uppgifter är för närvarande föremål för översyn på andra håll, förmågan av kombinationen av en hypertensiv läkemedel och en endotelinreceptorantagonist öka perifer muskulärperfusion har publicerats oberoende 18. Även under normala förhållanden, kan en dosberoende ökning av blodflödet hastighet efter båda injektioner, kan det faktum att den andra injektionen inte leder till en ytterligare ökning av flödeshastighet i sarkom metastaser bero på att maximal tumörkärlen vasodilatation har redan nåtts efter den första kombinerade injektionen av efedrin och ambrisentan.
Följande begränsningar gäller för den teknik som presenteras här: Detta protokoll är tillämpligt på råttor (och teoretiskt, liknande storlek däggdjur) från cirka 180 till 300 g eller mer. Mindre däggdjur såsom möss kommer att kräva speciell modifikation för att rymma den skörare anatomi och fysiologi av bröstkorgen. Den maximala spatiala upplösning som kan uppnås med den presenterade tekniken teoretiskt endast begränsas av den numeriska bländar av målet och tjockleken av täck bild som används (~ 0.08 till 0,1 mikrometer i standard varumärken), till 100X mål, med användning av olja nedsänkning. I praktiken kan dock den återstående rörelse lungan begränsa användningen av målen högupplösta bortom 20X. Om allt autonom rörelse av lungan elimineras, är den temporala upplösningen av tekniken begränsas endast av bildrutehastighet kameran, och signalstyrkan för den fluorescerande märkningen, som bestämmer den tid exponeringen, till cirka 100 bilder per sekund. Följande ytterligare begränsningar gäller för den presenterade tekniken: den ena sidan tillåter den nuvarande mikroskopiska och beräknings inställning endast analysen av ytan av en given metastaser. Användningen av djuppenetrerande mikroskopi, såsom avancerade bildbehandlingsstrategier konfokal mikroskopi, kan i framtiden möjliggöra mätning av blodflödeshastigheten i tre dimensioner. Även den presenterade tekniken kan inte, i sin nuvarande form, användas för att visualisera lesioner längre in i lungparenkym. Tredje, insättning av en glass fönster i direkt kontakt med kärl aktiva blod har viss potential att störa den mikrovaskulära flöde av sig själv, genom spatial komprimering av blodkärl, eller genom att påverka lokoregional temperatur. För det fjärde har användningen av en extern respirator och positivt tryck i lungan även potential att ändra lung mikrocirkulatorisk blodflöde. Dessutom, endast begränsade områden av bröstkorgen är praktiskt tillgängliga för de beskrivna, relativt okomplicerade kirurgiska procedurer. Andra områden av lungytan, såsom medial-ventrala eller dorsala tillgång skulle kräva mer avancerade kirurgiska tekniker, tillsammans med djupgående störningar av biomekanik bröstkorgen. På grund av bristen på alternativ till mikroskopi avbildning för att studera mikrocirkulationen blodflödet, kan viktiga utvecklingar förväntas inom en snar framtid för att övervinna dessa hinder och studera maligniteter vid hög temporal-rumsliga upplösningen i alla delar av gnagare lungan.
Sammanfattningsvis är en metod presterade att mäta mönster av, och förändringar i, mikrovaskulära blodflödet hastighet i ytan metastaser i råttlunga. Kombinera en akut sluten kista kirurgisk modell med en automatiserad metod för mätning blodflödet hastigheten i hela mikroskopiska optiska fältet, erbjuder denna teknik relativt bevarande av den fysiologiska miljön i lungan, kan upptäcka förändringar i den totala hastighets blodcirkulationens blodflöde och riktning är och relativt lätt att använda. Det kan förväntas att denna teknik kommer att vara till stor nytta för alla grupper som studerar mikrocirkulationen av lungmetastaser och andra dynamiska processer i denna sjukdom inställning i gnagarmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Athymic nude rats | Charles River | Strain code 316 | Female 10 week-old athymic nude rats |
| micro-CT/micro-Irradiator | Precision X-ray Inc. | Xrad 225Cx | Use MicroCT to detect metastases |
| DiI (1,1=-dioctadecyl-3,3,3=,3=-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Mix 100 ul packed red blood cells with 100 ul of 0.5 mg/ml DiI in 200 proof ethanol, 2 ml of 5% dextrose solution in water, and fill up to a 10-ml final volume with saline |
| Rodent ventilator | Kent Scientific | TOPO Small Animal Ventilator | Device is important to maintain positive lung pressure after application of pneumothorax |
| Zeiss Axioskop fluorescence microscope upright | Zeiss | Axioskop | Microscope for intravital imaging |
| Andor CCD camera | Andor | iXonEM 885 | CCD camera for live imaging of blood flow |
| Pulse oximeter | StarrLife | MouseOx | Pulse oximeter |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop | Fluorescence microscope |
References
- Billingsley, K. G., et al. Pulmonary metastases from soft tissue sarcoma: analysis of patterns of diseases and postmetastasis survival. Ann Surg. 229, 602-610 (1999).
- Rashid, O. M., Takabe, K. The evolution of the role of surgery in the management of breast cancer lung metastasis. J Thorac Dis. 4, 420-424 (2012).
- Mayer, A., Vaupel, P. Hypoxia, lactate accumulation, and acidosis: siblings or accomplices driving tumor progression and resistance to therapy. Advances in experimental medicine and biology. 789, 203-209 (2013).
- Okunieff, P., O'Dell, W., Zhang, M., Zhang, L., Maguire, D. Tumor oxygen measurements and personalized medicine. Advances in experimental medicine and biology. 765, 195-201 (2013).
- Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nature protocols. 6, 1355-1366 (2011).
- Palmer, G. M., et al. Optical imaging of tumor hypoxia dynamics. Journal of biomedical optics. 15, (2010).
- Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59, 361-367 (2000).
- Kuebler, W. M. Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses. Proc Am Thorac Soc. 8, 458-465 (2011).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. Am J Respir Crit Care Med. 188, 474-481 (2013).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 304, 86-91 (2013).
- Fontanella, A. N., et al. Quantitative mapping of hemodynamics in the lung, brain, and dorsal window chamber-grown tumors using a novel, automated algorithm. Microcirculation. , (2013).
- Newton, J., et al. Commissioning a small-field biological irradiator using point, 2D, and 3D dosimetry techniques. Medical physics. 38, 6754-6762 (2011).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in radiation oncology. 14, 198-206 (2004).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57, 385-393 (1994).
- Manzoor, A. A., Schroeder, T., Dewhirst, M. W. One-stop-shop tumor imaging: buy hypoxia, get lactate free. The Journal of clinical investigation. 118, 1616-1619 (2008).
- Evans, S. M., et al. Imaging and analytical methods as applied to the evaluation of vasculature and hypoxia in human brain tumors. Radiation research. 170, 677-690 (2008).
- Radiloff, D. R., et al. The combination of theophylline and endothelin receptor antagonism improves exercise performance of rats under simulated high altitude. Journal of applied physiology. 113, 1243-1252 (2012).
