Summary
Grundlæggende teknikker og finpudsninger af fryse-fraktur behandling af biologiske prøver og nanomaterialer til undersøgelse ved transmission elektronmikroskopi beskrives. Denne teknik er en foretrukken metode til at afsløre ultrastrukturelle funktioner og specialer i biologiske membraner, og for at opnå ultrastrukturel niveau dimensionelle og geodata i materialevidenskab og nanoteknologiske produkter.
Abstract
Fryse-fraktur / fryse-etch beskriver en proces, hvor prøver, typisk biologisk eller nanomateriale i naturen, er frosne, brækket, og gentages for at generere en carbon / platin "kastet" beregnet til undersøgelse ved transmission elektronmikroskopi. Prøver udsættes for ultrahurtige frysning satser, ofte i nærværelse af kryobeskyttelsesmidler at begrænse iskrystaldannelse med efterfølgende brud af prøven ved flydende kvælstof afkølede temperaturer under højt vakuum. Den resulterende brudfladen replikeres og stabiliseres ved fordampning af carbon og platin fra en vinkel, som giver overfladen tredimensionale detaljeret til afstøbningen. Denne teknik har vist sig særlig oplysende for undersøgelse af cellemembraner og deres specialer og har bidraget væsentligt til forståelsen af cellulære form relateret celle funktion. I denne rapport undersøge vi de instrumentspecifikke krav og teknisk protokol for udførelse affryse-fraktur, den tilhørende nomenklatur og egenskaber for fraktur fly, variationer på den konventionelle procedure og kriterier for fortolkning af fryse-fraktur billeder. Denne teknik har været meget anvendt til ultrastrukturel undersøgelse i mange områder af cellebiologi og lover som en ny imaging teknik til molekylær, nanoteknologi og materialevidenskab studier.
Introduction
Konceptet og praktisk anvendelse af fryse-fraktur behandling af biologiske prøver blev introduceret af Steere 1 over et halvt århundrede siden. Den tidlige apparat tilegnet forskellige komponenter i en arbejdsgruppe selvstændig enhed 1. Den oprindelige apparat blev ændret og finpudset i kommercielt tilgængelige instrumenter for at imødekomme kritiske behov for ekstern manipulation, vedligeholdelse af højt vakuum og fordampning af kulstof og metal til at producere en kopi egnet til undersøgelse ved transmission elektron mikroskopi (figur 1 og figur 2).
Den typisk instrument består af et stort vakuumkammer med prøven bord og mikrotom arm har regulerbar flydende nitrogen gennemløb (figur 1). Kammeret huser også to elektronkanoner, en for at stabilisere kulstof fordampning placeret i en 90 ° vinkel til den model scenen og den anden for Platinum / carbon shadowing på en justerbar vinkel, typisk 15 º - 45 º (figur 2). Strøm til enheden anvendes til at betjene vakuumpumpen og elektroniske paneler regulere justering og elektron temperatur pistol kontrol.
Oprindeligt tænkt som et middel til at opnå en bedre billeddannelse af vira, fryse-fraktur vundet endnu mere popularitet som en teknik til undersøgelse og analyse af cellemembraner og deres specialer 2, 3. Faktisk har denne fremgangsmåde været en integreret belyse struktur / funktions relationer i celler og væv, og mange af disse undersøgelser står som klassiske bidrag til cellebiologi og molekylær biologi 4-9. Det vigtigste mål og rationale for udvikling af fryse-fraktur teknik var at begrænse artefakter observerbare ved elektronmikroskopisk resolution fra kemisk fiksering og behandling, der anvendes i konventionel biologisk elektronmikroskopi. Her er målet at de kemiskefiksering og indefryse modellen med tilstrækkelig hastighed og ofte i nærværelse af en kryoprotektant for at begrænse iskrystaldannelse og andre indefrysning artefakter. På det seneste har denne teknik fundet en genopblussen af interesse fra molekylærbiologer og materialevidenskab efterforskere til undersøgelse af nanopartikler og nanomaterialer.
Fryse-fraktur og fryse-etch billeder udviser en tredimensionel karakter og til tider forveksles med scanningselektronmikrografer. Dog er fryse-fraktur præparater undersøgt ved transmissionselektronmikroskopi og deres store bidrag til morfologiske undersøgelser i høj opløsning er deres unikke repræsentation af struktur / funktions elementer af cellemembraner. Fryse-fraktur-behandling initieres ved frysning celler og væv med tilstrækkelig hastighed til at begrænse is krystallisation og / eller med anvendelse af kryobeskyttende midler, såsom glycerol. De prøver derefter splittet under vakuum, og en replica genereres ved fordampning af carbon og platin i brudfladen. Den oprindelige prøve fordøjes fra den replika, der er hentet på en standard EM eksemplar nettet. En anden almindelig fejlfortolkning af fryse-fraktur billeder er, at de skildrer celleoverfladerne. Men den grundlæggende forudsætning af fryse-fraktur er, at biologiske membraner er delt gennem lipiddobbeltlaget ved fraktur proces (figur 3). Denne proces i biologiske membraner giver to brudfladerne, en, der afslører tilrettelæggelsen af halvdelen af membranen tilgrænsende til cytoplasmaet, PF-ansigt, og en, der afslører halvdelen af bimolekylære indlægsseddel af membranen, der er tilstødende til det ekstracellulære milieu, er EF-ansigt. Sande celleoverflader er ikke repræsenteret i fryse-fraktur-billeder, men kun, når det efterfølgende tilsættes trin af fryse-ætsning efter bruddet procedure anvendes. For effektivt at ætse tidligere brækkede prøver at afsløre overflade detail, må prøver nedfryses i et hastigt tempo og uden unetchablecryoprotectant. Ætsning af vand fra overfladen af de frakturerede prøve afslører underliggende funktioner opnås ved at placere afkøling mikrotom armen over prøven fase skabe en temperaturforskel mellem scenen holder prøven og afkøling mikrotom arm, som bevirker, at vand sublimere fra overfladen. Når vand sublimeres fra overfladen af de frakturerede prøve under fryse-ætsning manøvre, så aspekter af faktiske celleoverflader, ekstracellulær matrix, cytoskeletale strukturer og molekylære enheder kan blive afsløret ved høj opløsning. Således fryse-fraktur og fryse-etch er ikke udskiftelige udtryk, men snarere afspejler en trinvis proces hvor sidstnævnte måske ikke nødvendig eller ønskelig, afhængigt af behovene i den pågældende undersøgelse.
Efter fryse-fraktur / fryse-etch procedurer er de brudflader underkastet styret fordamperentiv frakker af kulstof og platin med henblik på at yde støtte og billedbehandling kontrast til replika. Den platin / carbon imaging fordampning kan være ensrettede eller roterende og opnås ved enten modstand eller elektronkanoner. Envejs skygning fra en kendt vinkel, typisk 30 ° - 45 °, er nyttig ved udførelse af visse morfometriske beregninger. Prøver, der er blevet udsat for dyb-ætsning typisk roterende skygget og de resulterende billeder af disse prøver er fotografisk tilbageføres til evaluering.
Den historiske såvel som en nuværende mål for fryse-fraktur / fryse-etch teknik er at begrænse kemisk fiksering og behandling prøven artefakter, der er forbundet med flere konventionelle transmissionselektronmikroskopi procedurer. Men denne teknik giver en væsentlig fordel i dens evne til at give tre-dimensionelle detalje og dermed lette køb af morfometriske data i biologiske, materiallære, og nanotechnology prøver. Fryse-fraktur og fryse-etch procedurer er komplekse og mangesidede, og nogle aspekter af dets anvendelse er tilpasset. Denne præsentation byder på en undersøgelse betragtning af de vigtigste funktioner i processen, og læseren henvises til omfattende publicerede protokoller 10, 11 for at løse detaljerne og tilpasse processen for specifikke forskningsbehov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af biologiske prøver til Freeze-fraktur / Freeze-etch
- Brug en konventionel EM fiksativ formulering, såsom 2% glutaraldehyd + 2% paraformaldehyd i 0,1 M phosphatpuffer i 1 time. at udføre primære fiksering af biologiske væv. BEMÆRK: Selv om det kan være ønskeligt at fastfryse nogle typer af prøver uden forudgående fiksering, universelle blodbårne patogen forholdsregler mandat passende fiksering hvor prøven består af humant væv.
- Efter den primære fiksering skylles modellen i den samme buffer suppleret med 0,2 M saccharose i mere end 1 time.
- Prøven overføres til en kryobeskyttende opløsning bestående af 25% glycerol i 0,1 M phosphatpuffer for ikke mere end 1 time.
2. Frysning og opbevaring af prøverne forud for Freeze-fraktur
- Vælg guld eller kobber eksemplar Stubbefragtbrev passende størrelse og form til den enhed, der behandles (Figur 4
- Med fin pincet og / eller lille måler sprøjtekanyler position små fragmenter af prøven på toppen af en metal prøve stub.
- Reducer væskeindholdet af prøven til en klæbrig, let lim konsistens ved at trække væsken ud fra kanten af stubben med filtrerpapir.
- For enlige replikaer, bruge små gauge sprøjte nåle til at skabe en bunke af væv på stubben. For dobbelt replikaer, bland andet stub og placer det nøjagtigt over stub og placere let mod prøvens overflade skaber en sandwich (figur 5A). Tryk ikke på modellen ud fra mellem de to stubbe.
- Fyld to isolerede Dewar fartøjer med flydende nitrogen. BEMÆRK: første beholder rummer en metal stolpe indeholdende en lille brønd, som bruges til at fortætte et lille volumen af propangas fra en kommercielt tilgængelig cylinder (figur 5B). Den anden beholder er en partitioneret opbevaring / holdekar til kortvarigly opretholde frosne prøver under flydende nitrogen.
- Brug af cylinderen dyse placeret i propan godt åbne flaskeventilen og tillade gassen at strømme ind i brønden af det første skib, hvor det vil flydende. BEMÆRK: PAS !! Propan er EXPLOSIVE kan forårsage NEDFRYSNING skade ved kontakt, og ER EN røgforgiftning. Brug propan kun i en kemisk hætte certificeret til sådan brug at tage sig også for at undgå uvedkommende antændelseskilder, ved hjælp af beskyttelsestøj mod lave temperaturer, og opretholde tilstrækkelig ventilation.
- Så hurtigt som muligt, afhente modellen montere med fin kvalitet pincet og styrte det ind i den flydende gas i det første skib i flere sekunder og derefter hurtigt at overføre til den anden bedrift beholder af flydende kvælstof (figur 5B).
- Når prøverne er frosset, at opbevare under flydende nitrogen indtil den er klar overføre til fryse-fraktur anlæg. Overfør stumper til en større lagring flydende kvælstof Dewar beholder til udvidetopbevaring, hvis det ønskes, dog skal sørges for ikke at tillade stubbe til at tø.
3. Betjening af Freeze-fraktur instrument og prøvebehandling
- Henter prøver på messing holderen og ind i kammeret
- Indlæse guld prøvens stumper til et hæfte-typen dobbelt replika prøveholder eller klemme enhed under flydende nitrogen og vedligeholde der indtil den er klar til at placere i prøven kammer (figur 6).
- Når kammeret har opnået høj vakuum (ca. 2 x 10 -6 mbar), og scenen er blevet kølet til flydende nitrogen temperatur, skal du slukke for pumpen, udlufte kammeret, og placer de monterede prøvens stubbe onto modellen bordet så hurtigt som muligt .
- Tænd pumpen genoprette højvakuum, og bruge fase og arm temperatur kontrol elektronisk at justere modellen temperatur bordet til -100 ° C og direkte flydende nitrogen til mikrotomen arm og bring det til flydende nitrogens temperatur.
- Bruddet proces
- Ved at opnå en høj vakuum, en scene temperatur på -100 ° C og mikrotom arm ved flydende kvælstof temperatur åbne eksternt dobbelt replika præparatholderen derved frakturering prøverne på prøven mounts (fryse-fracture_movie1.mov).
- I tilfælde af enheder beregnet til ætsning efter fraktur, bruge et barberblad holdes i en klemme på mikrotomen arm for at barbere (dvs. fraktur) overfladen af enhederne i stedet for trin 3.2.1 (fryse-etch_movie2.mov).
- Hvis den ekstra fryse-ætsning trin skal udføres, skal du placere den afkølede mikrotomet arm over brudflader for én til flere minutter. BEMÆRK: Denne manøvre vil sublimere (dvs. etch) vand fra brudfladen. Virkningen af denne manøvre er at afsløre sande celleoverflader ekstracellulære matrix og / eller molekylære samlinger ved sublimering af vand, foruden fromcture faces passerer gennem lipiddobbeltlag membraner.
- Metal skygning og replika støtte fordampning hjælp elektronkanoner
- Aktiver platin / carbon elektron eller resistens pistol og gør det muligt at fordampe et tyndt lag (ca. 2 nm) af platin / carbon over brudfladen fra en vinkel på 30 ° - 45 °. Dette kræver typisk cirka 15 - 20 sek.
- Aktiver carbon elektron eller resistens pistol som i trin 3.3.1 og inddampes et tyndt lag af carbon til brækkede prøvens overflade fra direkte overhead (90º) for at give støtte til replika. Dette kræver typisk cirka 15 - 20 sek.
- Indhentning af replikaer
- Ved afslutningen af replikation skygning og kulstof stabilisering, slukke vakuumpumpe, udlufte kammeret, og fjerne præparatet montere fra instrumentet.
- Ved hjælp af et par fine kvalitet pincet fjerne hvert guld prøve stub fra den dobbeltereplika hæfte / klemme og lad det tø i flere sekunder før sænkes forsigtigt ned stub på en vandoverflade i en plet plade (figur 7). BEMÆRK: carbon / platin replika indeholder vedhængende prøvemateriale vil flyde på vandoverfladen.
- Manøvrere replikaer ved hjælp af enten en fin tråd sløjfe eller en traditionel kobber elektronmikroskop gitter indehaves af fin kvalitet pincet og overførsel til en anden plet plade indeholdende 5% natriumdichromat i 50% svovlsyre i en til flere timer. BEMÆRK: Dette bad fordøjer den faktiske biologiske prøvemateriale fra replika. Fuld styrke blegemiddel kan erstatte den dichromat / svovlsyreopløsning.
- Når fordøjelsen er færdig, overføre replika tilbage til en ren vandoverflade og hente på en standard kobber elektronmikroskopi nettet. (BEMÆRK: Replicas kan fragmentere i mindre stykker under fordøjelsen, men selv meget små replikaer kan indeholde væsentlige oplysninger og bør være reieved og undersøgt.) Store replika støtte net i kommercielt tilgængelige grid kasser, hvor de vil forblive stabile i år med skånsom håndtering.
4. Ultrastrukturelle Gennemgang af Freeze-fraktur / etch reproduktioner
- Se replikaer i en transmissions elektron mikroskop ved en accelererende spænding typisk 50-80 kV.
- Optag relevante billeder på standard TEM film eller med en høj opløsning digitalt kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nøglen forudsætning af fryse-fraktur tolkning er, at fraktur fly passere gennem lipiddobbeltlaget af membraner, der giver to brudfladerne, kaldet konventionelt PF-flade (plasma-fraktur-ansigt) og EF-flade (ekstracellulær fraktur-ansigt) (figur 3). PF-ansigt er halvdelen af membranlipiddobbeltlaget støder op til cellens cytoplasma og EF-ansigt er halvdelen af membranlipiddobbeltlaget støder op til det ekstracellulære miljø. Den fryse-fraktur teknik er særlig nyttig til undersøgelse af membran struktur og de to ansigter er typisk markant anderledes med PF-ansigter bliver befolket med mange membran partikler forbundet i modsætning til EF-ansigter, der indeholder færre. De cytoplasmatiske indhold fryse-brud celler er typisk grove udseende og er ikke særligt afslørende selv membranbundne organeller såsom kerner og Golgi kan let identificeres. Af særlig interesse for Investigators med denne teknik er specialisering i membran struktur, der kan tolkes til deres funktion. Disse omfatter specifikke fordelinger af membranassocierede partikler, ciliære membran specialiseringer og intercellulære vejkryds.
Cilia-associerede Konstruktioner
Bosiddende i cellemembranen på bunden af hver eukaryote cilium og flagel er en vifte af membranassocierede partikler organiseret i tråde omkranser aksel cilium og kendt som det ciliære halskæde (figur 8) 12-16. Denne struktur udviser en vis grad af morfologisk heterogenitet i forskellige arter, og det er blevet spekuleret at være multifunktionelle, idet det forekommer forud for fremkomsten af ciliære aksel under ciliogenesis og forbliver på plads i den modne cilium. Den spirende ciliær halskæde stammer fra sammenlægning og organiseringen af membran partikel arrays forud for tidspunktet af emergence af ciliære aksel under ciliogenesis tyder på mulige deltagelse i den tidlige organisering af udvikling axoneme 14.
Tight junctions og Epithelial Permeabi heden
I forskellige epitel fryse-fraktur undersøgelser afslører en sofistikeret organisering af anastomoserende streng og notkonstruktionerne omkranser den apikale del af den basolaterale grænser. Dette bælte-lignende struktur er kendt som tight junction eller zonulaoccludens (figur 9), og menes at virke som en regulator af epitelial permeabilitet for den paracellulære flux 3, 17-20. Tætte forbindelser med få tråde er blevet beskrevet som "utæt", mens dem med mere kompleks organisation er beskrevet som "stram". Denne organisation synes at passe funktionen af epithelet, som de er tilknyttet. PF-ansigter tætte forbindelser vises som tråde, mens den EF-ansigter udviser complementary riller.
Gap junctions og Intercellular Kommunikation
Gap junctions (Figur 10) vises i fryse-fraktur præparater af en række forskellige væv og er repræsenteret af tætte rækker af partikler på PF-ansigter og komplementære gruber på EF-ansigter. Disse strukturer menes at repræsentere membran sites, der letter intercellulær kommunikation. I væv, hvor de er til stede, har demonstrationer af passage af lavmolekylære fluorescerende farvestoffer og calcium flux påvist 21-24 tyder på, at de repræsenterer en fysisk vej for passage af signalmolekyler.
Figur 1. Opbygning af en kommerciel fryse-fraktur / etch anlæg. På langt tilbage, er en tryksat Dewar feeding køling flydende nitrogen med modellen scenen og køling mikrotom arm under kontrollerede forhold. I centrum er den enhed med prøvekammer og elektronisk kontrolpaneler til højre. Til højre er en yderligere flydende nitrogen tank på hvilke afgangsgassen anvendes til at bringe prøven kammeret til atmosfæren.
Figur 2. Frys-fraktur / etch plante prøvekammer med døren åbnet for at afsløre holdninger retningsbestemt rettet elektronkanoner, køling ligklæde, og prøven skrive hvor modellerne i messing indehavere er placeret. Prøver introduceres til kammeret gennem en port til venstre for kammeret.
ig6highres.jpg "width =" 500 "/> 4 / 51694fig11highres.jpg "width =" 500 "/> 
Figur 4. To typer prøve monteringer til fryse-fraktur / etch procedurer. (Venstre) En dobbelt replika prøveholder hæfte anvendes til konventionelle fryse-fraktur procedurer udføres uden ætsning. Prøven er klemt inde mellem to guld eksemplar stumper og placeret i messing hæftet. Prøven er sprunget ved at åbne hæftet under vakuum i prøven kammer (se fryse-fract ure_movie1.mov). (Højre) en holder, der hovedsagelig anvendes til fryse-ætsning. Prøven er placeret på Gold stubbe og låst fast i messing holderen. Prøven er sprunget ved blid barbering med et barberblad fastsat i microtome arm. Denne konfiguration foretrækkes til ætsning procedurer (se fryse-etch_movie2.mov). 
Figur 5. Udarbejdelse af en fastfrysning-fraktur prøve mount. Prøven er klemt inde mellem to guld mounts (A) og frosset i en brønd indeholdende flydende nitrogen afkølet propan (forgrunden) med efterfølgende overførsel til en bedrift Dewar indeholder flydende nitrogen (baggrund) ( B).
Figur 6. Demonstration af positionering af en frosne fryse-fraktur prøve i den dobbelte replika præparatholderen hæfte i forberedelse til introduktion til modellen kammer fryse-fraktur / etch anlæg. 
Figur 7. Indhentning af replikaer efter fraktur og skygger i fryse-fraktur / etch anlæg. "A" er et rent vand overflade i en plet plade. Den replika flød fra prøven stub overføres til "B" et godt indeholdende en sur opløsning af natriumdichromat eller fuld styrke blegemiddel for fordøjelsen af væv fra replika. "C" repræsenterer efterfølgende ren vandoverflader, som den rensede replika overføres forud for being hentes på en kobber elektronmikroskopi nettet. 
Figur 8. Cilia relaterede strukturer afsløret af fryse-fraktur. Hvide pile peger på specialiserede partikel membran arrays på luminale grænse af epitelceller undergår ciliogenesis. Disse partikel arrays repræsenterer vordende ciliære halskæder der er placeret på baser af emergente og modne cilier (sort pil). Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 9. Fracture gennem epitel cellemembraner afsløre ing eksempler på PF- og EF-brudfladerne. Strengen og groove organisering af stramme samlingskomplekserne er indlysende, og det intercellulære rum er markeret med pile. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 10. En fryse-fraktur billede af en gap junction i rottelever. Partikler er tydeligt på PF-ansigt og komplementære gruber er tydeligt på EF-ansigt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11. Immunhistokemisk lokalisering af en connexin ved hjælp af en kolloid guld mærket antistof på en fryse-fraktur forberedelse illustrerer specifik lokalisering på gap junction. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 12. Et eksempel hurtig nedfrysning med dyb ætsning og roterende shadowing. Epitelcellers er blevet afrevet gennem cytoplasmaet og en PF-ansigt er indlysende (pilespidser). Bag pilespidser kan ses en sand celleoverfladen afsløret ved efterfølgende ætsning. venligst CLIck her for at se en større version af dette tal. 
Figur 13. Et eksempel hurtig nedfrysning med dyb ætsning og roterende shadowing at afsløre molekylære komplekser, der omfatter et kvæg luftrør ciliaryaxoneme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I årene efter dens indførelse og kommercielle tilgængelighed, fryse-fraktur / etch procedurer blev i vid udstrækning brugt til undersøgelser af den biologiske membran struktur. Faktisk har de bedste perspektiver for nogle af de strukturelle specialiseringer af membraner blevet opnået i fryse-fraktur / etch præparater. Disse undersøgelser ikke blot har bidraget til forståelsen af den strukturelle organisering af membraner, men også indsigt i, hvordan struktur og funktion hænger sammen.
Fremkomsten af rutinemæssig biologisk elektronmikroskopi ført til en bevidsthed om, at kemiske behandlinger med aldehyd fikseringsmidler, reaktive kemikalier og tungmetaller, der er nødvendige for at give differentieret elektrontæthed til biologiske prøver selv bidraget til dannelsen af artefakt. Udviklingen af fryse-fraktur teknologi blev delvis baseret på et forsøg på at reducere behandlingstiden artefakt. Alligevel har det været anerkendt, at fryse-fraktur/ Etch indfører sit eget sæt af artefakter, en større hvoraf den ene er iskrystal skader. Væv kastet direkte i flydende nitrogen erfaring en reduceret afkølingshastighed på grund af dannelsen af et isolerende lag af nitrogengas omkring prøven, som resulterer i dannelsen af iskrystaller, der udslette ultrastrukturelle detaljer. Dette problem overvindes med anvendelse af kryobeskyttende midler, såsom glycerol og ved frysning af væv først i flydende nitrogen-afkølet propan. Historisk set blev springet frysning udført i flydende nitrogen afkølet chlorfluorcarboner, men disse materialer er blevet udfaset af brug på grund af deres negative virkninger på miljøet. Selv i de bedste kryobeskyttende betingelser, arten af processen uundgåeligt resulterer i en grov, grus lignende overflade i cytoplasmatiske frakturer; imidlertid frakturer gennem membranstrukturer afslører velorganiseret funktioner med specifikke plane organisationer i forhold til deres orientering i cellemembranen. Disse billeder erkun muligt med anvendelse af kryobeskyttende midler, såsom glycerol, der begrænser iskrystal skader og glycerol selv i visse tilfælde også kan indføre kunstig omfordeling af membranassocierede partikler. Desuden kan glycerol ikke sublimeret fra brudfladen dermed begrænse muligheden for en vellykket ætsning. Hvis den efterfølgende ætsning fremgangsmåde er ønskelig, så prøven skal enten være hurtigt nedfrosset på en måde, der begrænser iskrystal skader ved hjælp af enten flydende helium eller nitrogen sjap og / eller nærmede sig ved anvendelse af et kryobeskyttelsesmiddel, såsom acetone, der let sublimeret fra opsprækket overflader.
Selv Steer oprindelige rapport var fokuseret på billeddannelse virus, er det i membran struktur, fryse-fraktur / etch fundet mere omfattende anvendelse. Faktisk har strukturer såsom tight og gap junctions og ciliaere membran specialiseringer blevet elegant afsløret i fryse-fraktur præparater. Fryse-fraktur har grundvolded betydelig nytte at opnå en forståelse af membran differentiering under udvikling 15, 17,24 og i membranen patologi 25-30. Tidligere rapporter fra dette laboratorium, har vist mønster af differentiering af stramme samlingskomplekserne under luftvejs udvikling, forstyrrelse af membranstrukturer ciliære forbundet med eksperimentel agent eksponering smitsom, og nedbrydning af stramme forbindelsemotiver komplekser i luftvejs epitelceller forbundet med luftforurenende stoffer og tobaksrøg eksponering hos forsøgsdyr og mennesker.
Tekniske Udvidelser af Freeze-Fracture / Freeze-etch Procedure
Den afkølende metode under anvendelse af flydende propan at fryse prøver der er beskrevet her, er måske den mest almindelige metode til frysning biologiske prøver til konventionelt fryse-fraktur. Dog skal andre tilgange til frysning skal afsættes, hvis fryse-ætsning skal udførered. Da glycerol er en ikke-etchablecryoprotectant, prøver til fryse-ætsning skal indefryses på måder, der begrænser iskrystaldannelse. Dette kan opnås ved hjælp af en etchablecryoprotectant såsom acetone og / eller ved at fryse prøven monteres mod en metaloverflade køles med flydende helium eller flydende nitrogen sjap. Hurtig nedfrysning uden kryobeskyttelsesmidler kan også opnås ved anvendelse af spray frysning eller højtryk frysning i flydende propan.
De seneste bestræbelser på yderligere vedrører struktur og funktion ved hjælp af fryse-fraktur teknologi har tilegnet denne teknik i koncert med immunhistokemisk mærkning 31, 32. Her kan antistoffer til specifikke antigener effektivt og præcist lokaliseret til membran steder (figur 11).
Mens fryse-fraktur med ensrettet shadowing er langt den mest udbredte protokol, vil nogle eksperimentelle design kræver hurtig nedfrysning med lille eller begrænset cryoprotection ledsaget af ætsning af brudfladen at afsløre sande celleoverflader ekstracellulære matrix og / eller makromolekylære komplekser og roterende shadowing at formidle kontrast 16 (figur 12 og figur 13).
Der er en stigende interesse i anvendelser af fryse-fraktur i nanoteknologi, materialevidenskab, og bruge denne teknik som et billeddannende værktøj i molekylær biologi. Faktisk kan nanomaterialer på mange måder være konsekvente i deres organisation med virale strukturer, for hvilke fryse-fraktur oprindeligt var tænkt som et middel til billeddannelse. Desuden fremstillede liposomer, strukturer ligner den form for biologiske membraner, er ved at blive almindeligt undersøgt for målrettet levering af farmaceutiske midler og genterapi. Fordi deres organisation er væsentlige membran lignende kan fryse-fraktur behandling har stor nytte i at producere afslørende billeder som en komponent i udvikping disse behandlinger 33.
Sammenfattende har fryse-fraktur teknologier været historisk betydning i karakterisere organisation og funktion af cellemembraner. Dog er fryse-fraktur finde nye områder af nytte i koordination med molekylær biologi og nanoteknologi og næsten helt sikkert vil bidrage til fremskridt på disse hurtigt voksende områder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| Standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| Sodium dichromate | various suppliers | ||
| Sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Propane | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
References
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
- Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
- Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
- Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E.
- Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
- Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
- Chandler, D. E., Sharp, W. P. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).
- Severs, N. J.
- Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
- Rohatgi, R., Snell, W. J.
- Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
- Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
- Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
- Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
- Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
- Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
- Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
- Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
- Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
- Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
- Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).
