Summary
Grunnleggende teknikker og avgrensninger av fryse-brudd behandling av biologiske prøver og nanomaterialer for undersøkelse av transmisjonselektronmikroskopi er beskrevet. Denne teknikken er en foretrukket metode for å avsløre ultra funksjoner og spesialiseringer av biologiske membraner og for å få ultrastructural nivå dimensjonale og geodata i materialer fag og nanoteknologi produkter.
Abstract
Fryse-fraktur / fryse-etch beskriver en prosess der prøvene, typisk biologisk eller nanomateriale i naturen, er frosset, brukket, og gjenskapt for å generere en karbon / platinum "kastet" beregnet for undersøkelse av transmisjonselektronmikroskopi. Prøver som er utsatt for frysing ultrarapid priser, ofte i nærvær av cryobeskyttelsesmidler å begrense iskrystalldannelse, med etterfølgende oppsprekking av prøven i flytende nitrogen avkjølt temperatur under høyvakuum. Den resulterende bruddflate replikeres og stabilisert ved fordampning av karbon og platina fra en vinkel som confers overflate tredimensjonal detalj til gipsen. Denne teknikken har vist seg særlig opplysende for etterforskningen av cellemembraner og deres spesialiseringer og har bidratt vesentlig til forståelsen av celleform til relatert celle funksjon. I denne rapporten kartlegger vi de krav instrument og teknisk protokoll for å utførefryse-brudd, den tilhørende nomenklatur og karakteristikker av sprekkeplan, variasjoner på den konvensjonelle prosedyren, og kriterier for tolkning av fryse-fraktur bilder. Denne teknikken har blitt mye brukt for ultrastructural etterforskning i mange områder av cellebiologi og holder løftet som en ny avbildningsteknikk for molekylær, nanoteknologi og materialer realfag.
Introduction
Konseptet og praktisk anvendelse av fryse-brudd bearbeiding av biologiske prøver ble innført av Steere 1 over et halvt århundre siden. Den tidlige apparat bevilget ulike komponenter til en fungerende selvstendig enhet en. Den opprinnelige apparat ble modifisert og raffinert til kommersielt tilgjengelige instrumenter for å få plass til det kritiske behov for fjernmanipulering, opprettholdelse av høy-vakuum, og fordampning av karbon og metaller til å produsere en kopi egnet for undersøkelse av transmisjonselektronmikroskopi (figur 1 og figur 2).
Den typiske instrument består av et høyt vakuumkammer med prøvebord og mikrotomen arm har regulerbar gjennomstrømning flytende nitrogen (figur 1). Kammeret inneholder også to elektronkanoner, en for å stabilisere karbon fordampning plassert i en 90 ° vinkel i forhold til prøvetrinn, og den andre for platinum / carbon skygging på en justerbar vinkel, typisk 15 º - 45 º (figur 2). Strømmen til den enhet brukes til å drive vakuumpumpen og elektroniske paneler regulere temperaturregulering og elektronkanon-styring.
Opprinnelig tenkt som et middel for å oppnå forbedret avbildning av virus, fryse-brudd fikk enda mer popularitet som en teknikk for undersøkelse og analyse av cellemembraner og deres spesialiseringer 2, 3. Faktisk har denne prosedyren blitt integrert belyse struktur / funksjon relasjoner i celler og vev og mange av disse studiene stå som klassiske bidrag til celle-og molekylærbiologi 4-9. Den store mål og begrunnelsen for utviklingen av fryse-brudd teknikken var å begrense gjenstander observer ved elektronmikroskopi oppløsning som stammer fra kjemisk fiksering og behandling brukt i konvensjonell biologisk elektronmikroskopi. Her er målet å begrense kjemiskfiksering og for å fryse prøven med tilstrekkelig hastighet, og ofte i nærvær av et kryobeskyttende middel for å begrense iskrystalldannelse og andre frysing gjenstander. Mer nylig har denne teknikken funnet en fornyet interesse fra molekylærbiologer og materialvitenskap etterforskere for undersøkelse av nanopartikler og nanomaterialer.
Fryse-brudd og fryse-ets bilder utviser en tredimensjonal karakter og noen ganger er tatt for scanning elektronmikro. Imidlertid er fryse-fraktur preparater undersøkt ved transmisjonselektronmikroskopi, og er deres store bidrag til høy oppløsning morfologiske studier deres unike representasjon av struktur / funksjonselementer av cellemembraner. Fryse-fraktur behandlingen initieres ved frysing celler og vev med tilstrekkelig hastighet til å begrense is krystallisering og / eller ved anvendelse av kryobeskyttende midler så som glycerol. Prøvestykkene blir deretter brukket under vakuum, og et replica genereres ved fordampning av karbon og platina over bruddflate. Den opprinnelige prøven er fordøyd fra replika som er hentet inn på en standard EM prøven rutenett. En annen vanlig feiltolkning av fryse-brudd bildene er at de skildrer celleoverflater. Imidlertid den grunnleggende forutsetningen for fryse-fraktur er at biologiske membraner er splittet gjennom den lipide dobbeltlags ved bruddprosessen (figur 3). Denne prosessen i biologiske membraner gir to bruddflater, en som viser organiseringen av den halve av membranen tilstøtende til cytoplasma, PF-ansikt, og en som viser halvparten av den bimolekylære paknings av membranen som er tilstøtende til det ekstracellulære miljøet, EF-ansikt. Sanne celleoverflater, er ikke representert i fryse-fraktur-bilder, men kun når den etterfølgende tilsatt trinnet med fryse etsing etter at brudd prosedyre benyttes. For å effektivt etse tidligere oppsprukne prøver å avsløre overflate detail, må prøvene fryses i et hurtig tempo og uten unetchablecryoprotectant. Etsing av vann fra overflaten av de frakturerte prøven avdekker underliggende funksjoner oppnås ved å plassere kjøle mikrotomen arm over prøvetrinn opprette en temperaturdifferanse mellom den fasen som holder prøven og kjøle mikrotomen arm som fører vann til å sublimere fra overflaten. Når vann blir sublimert fra overflaten av de frakturerte prøven under fryse-etsing manøver, deretter aspekter av selve celleoverflater, ekstracellulær matrise, cytoskeletal strukturer, og molekylære sammenstillinger kan være avdekket med høy oppløsning. Dermed fryse-brudd og fryse-etch er ikke utskiftbare vilkår, men heller reflektere en trinnvis prosess sistnevnte som ikke kan være nødvendig eller ønskelig, avhengig av behovene til den aktuelle studien.
Etter fryse-fraktur / fryse-etsefremgangsmåter, er de oppsprukne overflater underkastet rettet fordamperentiv strøk av karbon og platina, for å gi støtte og avbildnings kontrast til replika. Den platina / karbon avbildning fordampning kan være ensrettet eller roterende, og blir oppnådd ved enten resistens eller elektronkanoner. Enveis skygging fra en kjent vinkel, typisk 30 º - 45 º, er nyttig i å utføre visse morfometriske beregninger. Prøver som har vært utsatt for dyp-etsning er typisk roterende skygget, og de resulterende bilder av disse prøvene er fotografisk reverseres for evaluering.
Den historiske samt en liggende mål i fryse-fraktur / fryse-ets-teknikk er å begrense kjemisk fiksering og prosessering prøve gjenstander som er forbundet med flere konvensjonelle transmisjonselektronmikroskopi prosedyrer. Imidlertid gir denne teknikken en saklig fordel i sin evne til å gi tredimensjonale detaljer og dermed legge til rette for kjøp av morfometriske data i biologiske, materialvitenskap, og nanotechnology prøver. Fryse-brudd og fryse-ets prosedyrer er komplekse og mangefasettert, og noen aspekter av sin søknad er tilpasset. Denne presentasjonen gir en undersøkelse utsikt over de viktigste funksjonene i prosessen og leseren er henvist til omfattende publiserte protokoller 10, 11 for å ta opp detaljene og tilpasse prosessen for spesifikke forskningsbehov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av biologiske prøver for Freeze-brudd / Freeze-etch
- Bruk en konvensjonell EM fiksativ formulering slik som 2% glutaraldehyd + 2% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer i 1 time. for å utføre primær fiksering av biologiske vev. MERK: Selv om det kan være ønskelig å fryse enkelte typer prøver uten forutgående fiksering, universal blodbårne patogener forholdsregler påbyr hensiktsmessig fiksering hvor prøven består av humant vev.
- Etter primær fiksering, skylling prøven i den samme buffer supplert med 0,2 M sukrose for ikke mer enn 1 time.
- Overfør prøven til en kryobeskyttende oppløsning som besto av 25% glycerol i 0,1 M fosfatbuffer for ikke mer enn 1 time.
2. Frysing og oppbevaring av prøver i forkant av Freeze-brudd
- Velg gull eller kobber prøve stubber av passende størrelse og form for prøven som bearbeides (figur 4
- Ved hjelp av finkornet tang og / eller liten sporvidde sprøyte nåler posisjons små fragmenter av prøven på toppen av en metallprøve stump.
- Reduser væskeinnholdet av prøven til en klebrig, noe lim lignende konsistens ved å trekke ut væske fra kanten av stussen med filterpapir.
- For enkle replikaer, bruker små måler sprøyte nåler for å lage en haug av vev på stussen. For dobbel kopier, invertere en annen spire og plasser den rett over stussen og plassere lett på prøveflaten skaper en sandwich (Figur 5A). Ikke trykk prøven ut fra mellom de to stubber.
- Fyll to isolerte Dewar fartøy med flytende nitrogen. MERK: Den første beholder rommer en metall-innlegg inneholdende et lite vel som brukes til å kondensere et lite volum av propangass fra en kommersielt tilgjengelig sylinder (figur 5B). Det andre fartøyet er et partisjonert lagring / oppbevaringsbeholder for kortly opprettholde frosne prøver i henhold til flytende nitrogen.
- Ved hjelp av sylinderen munnstykke plassert i propan godt, åpne sylinderventilen og tillate gass å strømme inn i brønnen fra det første fartøyet, hvor det blir flytende. MERK: FORSIKTIG !! Propan er EKSPLOSIV, kan forårsake ISKALDT SKADE PÅ CONTACT, og er en kvelende. Bruk propan bare i en kjemisk hette sertifisert for slik bruk å ta vare også for å unngå overflødig tennkilder, ved hjelp av klær beskyttende mot lave temperaturer, og opprettholde tilstrekkelig ventilasjon.
- Så raskt som mulig, plukke opp prøven beslag med finkornet pinsett og kaste den inn i den flytende gass i den første beholder i flere sekunder og deretter hurtig overført til den andre oppbevaringsbeholder for flytende nitrogen (figur 5B).
- Når prøvene er dypfryst å oppbevares under flytende nitrogen inntil den er klar til å overføre den fryse-fraktur-anlegget. Overfør stubber til en større lagrings flytende nitrogen Dewar beholder for forlengetlagring hvis ønskelig, men forsiktighet bør tas for ikke å tillate stubber å tine.
3. Drift av Freeze-brudd Instrument og Specimen Processing
- Last prøver på messing holderen og inn i kammeret
- Laste gullprøve stubber til et hefte-type dobbel kopi prøveholder eller klemme enheten under flytende nitrogen og vedlikeholde det før du er klar til å plassere i prøven kammeret (figur 6).
- Når kammeret har oppnådd høy vakuum (ca. 2 x 10 -6 mbar) og scenen har blitt avkjølt til flytende nitrogen temperatur, slå av pumpen, lufte kammeret, og plasser de monterte prøve stubber bort på prøven bordet så raskt som mulig .
- Slå på pumpen, gjenopprette høyt vakuum, og bruke elektroniske scenen og arm temperaturkontroller for å justere temperaturen prøven bordet til -100 ° C og direkte flytende nitrogen til mikrotomen arm og bring det til flytende nitrogen temperatur.
- Bruddprosessen
- Ved oppnådd høyvakuum, et stadium temperatur på -100 ° C og mikrotomen arm ved flytende nitrogentemperatur, eksternt åpne dobbelt replika prøveholder derved oppsprekking prøvene på objektfestene (fryse-fracture_movie1.mov).
- I tilfelle av prøvene beregnet for etsing etter brudd, bruke et barberblad holdes i et klammer på mikrotomen armen å barbere (dvs. brudd) på overflaten av prøvestykkene i stedet for trinn 3.2.1 (fryse-etch_movie2.mov).
- Hvis den ekstra fryse-etsing trinn skal utføres, plasseres den avkjølte mikrotomen arm over de frakturerte overflater for ett til flere minutter. MERK: Denne manøveren vil sublime (dvs. etch) vann fra bruddflate. Effekten av denne manøver er å avdekke sanne celleoverflater, ekstracellulær matriks, og / eller molekylære sammenstillinger ved sublimering av vann, i tillegg til FRActure ansikter passerer gjennom lipid-dobbeltlag av membraner.
- Metal skygging og replika støtte fordampning ved hjelp av elektronkanoner
- Aktiver platina / karbon elektron eller motstand pistol og la det fordampe et tynt lag (ca. 2 nm) av platina / karbon over bruddflate fra en vinkel på 30 º - 45 º. Dette krever vanligvis ca 15 - 20 sek.
- Aktiver karbon elektron eller motstand pistol som i trinn 3.3.1 og fordamp et tynt lag av karbon for å brukket prøveoverflaten fra direkte overliggende (90 °) for å gi støtte til replika. Dette krever vanligvis ca 15 - 20 sek.
- Gjenfinning av kopier
- Ved ferdigstillelse av replikering skygging og karbon stabilisering, slå av vakuumpumpe, lufte kammeret, og ta prøven montere fra instrumentet.
- Ved hjelp av et par fin karakter tang fjerne hver gull prøven spire fra den doblereplica hefte / klemme og la det tine i flere sekunder før senk spire på en vannoverflate i en flekk plate (figur 7). MERK: karbon / platina replika inneholder tilhenger prøvemateriale vil flyte på vannoverflaten.
- Manøvrere kopier ved hjelp av enten en fin trådsløyfe eller et konvensjonelt kobber elektronmikroskop gitteret holdes av finkornet pinsett og overføring til et annet sted plate inneholdende 5% natrium-dikromat i 50% svovelsyre i en til flere timer. MERK: Dette badet fordøyer selve biologisk prøvemateriale fra replika. Full styrke klorin kan erstatte den dikromat / svovelsyre løsning.
- Når fordøyelsen er avsluttet, overføres replika tilbake til en ren vannoverflaten og hente ut mot en standard kobberelektronmikros rutenett. (MERK: Replicas kan fragmentere i mindre biter under fordøyelsen, men selv svært små kopier kan inneholde konkret informasjon og bør være retieved og undersøkt.) Lagre kopi som støtter rister i kommersielt tilgjengelige grid kasser hvor de vil holde seg stabilt i mange år med skånsom behandling.
4. ultrastructural Undersøkelse av Freeze-brudd / Etch Replicas
- Se kopier i et transmisjonselektronmikroskop ved en akselererende spenning typisk 50-80 kV.
- Registrere relevante bilder på standard TEM film eller med en høyoppløselig digitalt kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nøkkelen forutsetningen for fryse-brudd image tolkning er at brudd flyene passere gjennom lipidbilag av membraner overdragelse to frakturoverflater, kalt av konvensjonen PF-ansikt (plasma brudd-ansikt) og EF-ansikt (ekstracellulære brudd-ansikt) (figur 3). Den PF-ansikt er halvparten av membranens lipidbilag som grenser til cytoplasma av cellen og EF-ansikt er halvparten av membranens lipidbilag som grenser til det ekstracellulære miljø. Fryse-brudd teknikken er spesielt nyttig for etterforskningen av membran struktur og de to ansikter er vanligvis særpreget og annerledes med PF-ansikter blir befolket med mange membranassosiert partikler i motsetning til EF-ansikter som inneholder færre. De cytoplasmatiske innholdet i fryse-brukket celler er vanligvis grov i utseende og er ikke spesielt avsløre selv membran bundet organeller som kjerner og Golgi lett kan identifiseres. Av spesiell interesse for INVEstigators ved hjelp av denne teknikken er spesialiseringer av membran struktur som kan tolkes for sin funksjon. Disse inkluderer spesifikke distribusjoner av membran forbundet partikler, ciliary membran spesialiseringer, og inter veikryss.
Cilia-assosiert Structures
Bosatt i cellemembranen ved foten av hver eukaryote cilium og flagellen er en rekke membran forbundet partikler organisert i tråder omkranser skaftet av cilium og kjent som ciliary halsbånd (Figur 8) 12-16. Denne strukturen viser en viss grad av morfologiske heterogenitet i ulike arter, og det har vært spekulert i å være multifunksjonelle ettersom det ser ut før fremveksten av ciliary skaftet under ciliogenesis og er fortsatt på plass i den modne cilium. Den begynnende stråle kjede stammer fra aggregering og organisering av membran partikkel arrays før tidspunktet for emergence av stråle skaftet under ciliogenesis foreslå sin mulige deltakelse i tidlig organisering av utviklings axoneme 14.
Trange veikryss og epithelial Permeabi heten
I ulike epitel, fryse-brudd studier avslører en sofistikert organisering av anastomosering tråd og fjær strukturer omkranser den apikale del av de basolateral grenser. Dette belte-lignende struktur som er kjent som tight junction eller zonulaoccludens (figur 9), og antas å fungere som en regulator av epitelial permeabilitet til paracellular flux 3, 17-20. Tett veikryss med noen få tråder er blitt beskrevet som "lekk", mens de med mer komplisert organisasjon er beskrevet som "tett". Denne organisasjonen synes å passe funksjonen av epitel til hvilket de er forbundet. PF-ansiktene tett veikryss vises som tråder mens EF-ansikter utstillings complementary grooves.
Gap veikryss og Intercellular Communication
Gap veikryss (figur 10) vises i fryse brudd forberedelser av en rekke vev og er representert av tett matriser av partikler på PF-ansikter og utfyllende groper på EF flater. Disse strukturene er tenkt å representere membransider som letter intercellulær kommunikasjon. I vev hvor de er tilstede, har demonstrasjoner av passasje av lavmolekylære fluorescerende fargestoffer og kalsium-flukser blitt demonstrert 21-24 tyder på at de representerer en fysisk rute for passering av signalmolekyler.
Figur 1. Oppsett av en kommersiell fryse-brudd / etch anlegget. På helt til venstre er en trykk Dewar feeding avkjøling av flytende nitrogen til prøvetrinn og kjøle mikrotomen arm under kontrollerte betingelser. I sentrum er enheten med prøven kammer og elektronisk kontrollpaneler til høyre. På høyre side er en ytterligere flytende nitrogen tank på hvilken gassen ventilen brukes til å bringe prøvekammeret til atmosfæren.
Figur 2. Freeze-brudd / etch anlegget prøven kammer med dør åpnes for å avsløre posisjoner retnings rettet elektronkanoner, kjøling liksvøpet, og prøven poste hvor prøvene i messing holdere er plassert. Prøvene blir introdusert til kammeret gjennom en port til venstre for kammeret.
ig6highres.jpg "width =" 500 "/> 4 / 51694fig11highres.jpg "width =" 500 "/> 
Figur 4. To typer prøve mounts for fryse-brudd / Etch prosedyrer. (Venstre) En dobbel kopi prøveholder heftet brukes til konvensjonelle fryse brudd prosedyrer utført uten etsing. Prøven er klemt mellom to gullprøve stubber og plassert i messing heftet. Prøven blir brukket ved å åpne heftet under vakuum i prøvekammeret (Se fryse-fract ure_movie1.mov). (Høyre) En monteringen som brukes primært for fryse-etsing. Prøven plasseres på gull stubber og låst inn i messing holderen. Prøven er brukket ved forsiktig barbering med en barberhøvel blad fast i mikrotom arm. Denne konfigurasjonen er foretrukket for etsing prosedyrer (se fryse-etch_movie2.mov). 
Figur 5. Fremstilling av en fryse-fraktur prøveholderen. Prøven er klemt mellom to monteringer gull (a) og frosset i en brønn inneholdende flytende nitrogen avkjølt propan (forgrunn) med etterfølgende overføring til en holder Dewar inneholdende flytende nitrogen (bakgrunn) ( B).
Figur 6. Demonstrasjon av posisjoneringen av en frossen fryse-fraktur prøven inn i den doble replika prøveholder hefte som forberedelse for innføring i prøvekammeret av fryse-fraktur / etch anlegget. 
Figur 7. Henting av kopier følgende brudd og skygging i fryse-fraktur / etch plante. "A" er en ren vannoverflaten i en flekk plate. Den replika fløt fra prøvestubben er overført til "B" en brønn inneholdende en surgjort oppløsning av natrium-dikromat eller full styrke klorin for fordøyelse av vev fra replika. "C" representerer følgende rent vann overflater til hvilke det rengjorte kopi er overført før being hentet inn en kobber elektronmikros rutenett. 
Figur 8. Cilia relaterte strukturer avslørt av fryse-brudd. Hvite piler peker til spesialiserte membran partikkel arrays på luminal grensen av epitelceller som gjennomgår ciliogenesis. Disse partikkel arrays representerer gryende ciliary halskjeder som bor på baser av emergent og moden flimmerhårene (svart pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 9. Fracture gjennom epiteliale cellemembraner avsløre ing eksempler på PF- og EF-frakturoverflater. Den tråd og fjær organisering av trange junctional komplekser er tydelig og inter feltet er merket med piler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 10. En fryse-brudd bilde av et gap junction i rottelever. Partikler er tydelig på PF-ansikt og utfyllende gropene er tydelig på EF-ansikt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11. Immunhistokjemisk lokalisering av et connexin bruker en kolloidalt gull merket antistoff på en fryse brudd forberedelse illustrerer bestemt lokalisering på gap junction. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 12. Et eksempel på rask frysing med dyp etsing og roterende skygging. Den epitelcelle har blitt brukket gjennom cytoplasma og en PF-ansikt er tydelig (pilspisser). Bak pilspisser kan sees en ekte celleoverflaten avslørt av følgende etsing. Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 13. Et eksempel på rask frysing med dyp etsing og roterende skygging å avdekke molekylære komplekser bestående av et storfe tracheal ciliaryaxoneme. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I årene etter introduksjonen og kommersiell tilgjengelighet, fryse-brudd / Etch prosedyrer ble mye benyttet for undersøkelser av biologisk membran struktur. Faktisk har de beste perspektiver av noen av de strukturelle spesialiseringer av membraner er innhentet i fryse-brudd / Etch forberedelser. Disse studiene ikke bare bidratt til forståelse av den strukturelle organiseringen av membraner, men også gitt innsikt i hvordan struktur og funksjon er i slekt.
Ankomsten av rutine biologisk elektronmikros brakt om en bevissthet om at kjemiske behandlinger med aldehyd fiksativ, reaktive kjemikalier og tungmetaller som kreves for å konferere differensial elektrontettheten til biologiske prøver seg bidratt til generering av gjenstanden. Utviklingen av fryse-brudd teknologien ble delvis basert på et forsøk på å redusere saksbehandlingstiden artefakt. Ikke desto mindre har det blitt erkjent at fryse-fraktur/ Introduserer etch sitt eget sett av gjenstander, en større hvorav den ene er iskrystall skade. Vev kastet direkte inn i flytende nitrogen opplever en redusert avkjølingshastighet på grunn av dannelsen av et isolerende lag av nitrogengass som omgir prøven, som resulterer i dannelsen av iskrystaller som utslette ultrastructural detalj. Dette problemet er overvunnet ved bruk av kryobeskyttende midler slik som glyserol, og ved å fryse vevet først i flytende nitrogenavkjølt propan. Historisk ble stupe frysing utført i flytende nitrogen avkjølt klorfluorkarboner men disse materialene har blitt faset ut av bruk på grunn av deres negative effekter på miljøet. Selv under de beste cryoprotective forhold, arten av prosessen uunngåelig resulterer i en grov, gruslignende overflate i cytoplasmatiske frakturer; imidlertid frakturer gjennom membranstrukturer viser godt organisert egenskaper med spesifikke plane organisasjoner i forhold til sin orientering i cellemembranen. Disse bildene erbare mulig ved bruk av kryobeskyttende midler slik som glyserol som begrenser iskrystall skade, og glycerol selv i noen tilfeller også kan innføre kunstig omfordeling av membran-assosiert partikler. Videre kan glycerol ikke bli sublimert fra den bruddflate og dermed begrense muligheten for vellykket etsing. Hvis den etterfølgende etsing prosedyren er ønskelig, da prøven må være enten raskt frosset på en måte som begrenser iskrystall skade enten ved hjelp av flytende helium eller nitrogen slaps og / eller nærmet ved bruk av et kryobeskyttende middel, såsom aceton som lett sublimeres fra oppsprukket overflater.
Selv om Steer første rapport ble fokusert på bildebehandling virus, er det i membranen struktur som fryse-brudd / etch gav mer omfattende søknad. Faktisk, strukturer som trange og gap veikryss og stråle membran spesialiseringer har blitt elegant avslørt i fryse brudd forberedelser. Freeze-brudd har symboliserted betydelig verktøy i å oppnå en forståelse av membran differensiering under utvikling 15, 17,24 og i membran patologi 25-30. Tidligere rapporter fra dette laboratoriet, har vist et mønster av differensiering av trange junctional komplekser under luftveis utvikling, forstyrrelse av ciliary membran strukturer knyttet til eksperimentell smittestoff eksponering, og nedbrytning av trange junctional komplekser i luftveis epitelceller forbundet med luftforurensning og tobakksrøyk eksponering i forsøksdyr og mennesker.
Tekniske Utvidelser av Freeze-Fracture / Freeze-etch Prosedyre
Slukke metode med flytende propan å fryse prøvene beskrevet her er kanskje den vanligste tilnærmingen til frysing biologiske prøver for konvensjonell fryse-brudd. Imidlertid må andre tilnærminger til frysing bevilges der fryse-etsning skal utføreed. Siden glyserol er en ikke-etchablecryoprotectant, prøver for fryse-etsing må fryses på måter som begrenser iskrystalldannelse. Dette kan oppnås ved hjelp av en etchablecryoprotectant så som aceton og / eller ved frysing av prøven montere mot en overflate av metall avkjølt med flytende helium eller flytende nitrogen sørpe. Rask frysing uten cryoprotectants også kan oppnås ved hjelp av sprøyte frysing eller høytrykks frysing i flytende propan.
Siste innsats for å videre forholde struktur og funksjon med fryse brudd teknologi har bevilget denne teknikken på konsert med immunhistokjemisk merking 31, 32. Her kan antistoffer mot spesifikke antigener bli effektivt og nøyaktig lokalisert til membransider (figur 11).
Mens fryse-brudd med enveis skygging er langt den mest brukte protokollen, vil noen eksperimentelle design ringe for rask frysing med little eller begrenset kryobeskyttelse fulgt av etsing av bruddflate for å avsløre sanne celleoverflater, ekstracellulær matriks, og / eller makromolekylære komplekser, og roterende skygging å bibringe kontrast 16 (figur 12 og figur 13).
Det er en økende interesse for anvendelser av fryse-brudd i nanoteknologi, materialvitenskap, og i å bruke denne teknikken som en avbildning verktøy i molekylærbiologi. Faktisk kan nanomaterialer på mange måter være konsekvent i sin organisasjon med virus strukturer som fryse-brudd var opprinnelig tenkt som et middel for bildebehandling. Videre produsert liposomer, strukturer like i form til biologiske membraner, blir mye studert for målrettet levering av farmasøytiske midler og regissert genterapi. Fordi deres organisasjon er egentlig membran som kan fryse-brudd behandling har betydelig nytte i å produsere avslørende bilder som en komponent i utvikledepinge disse terapi 33.
Oppsummert har fryse-brudd teknologier vært av historisk betydning for å karakterisere organisasjonen og funksjon av cellemembraner. Imidlertid er fryse-brudd finne nye anvendelsesområder i samordning med molekylærbiologi og nanoteknologi og nesten helt sikkert vil bidra til fremskritt i disse raskt voksende felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| Standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| Sodium dichromate | various suppliers | ||
| Sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Propane | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
References
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
- Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
- Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
- Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E.
- Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
- Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
- Chandler, D. E., Sharp, W. P. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).
- Severs, N. J.
- Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
- Rohatgi, R., Snell, W. J.
- Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
- Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
- Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
- Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
- Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
- Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
- Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
- Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
- Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
- Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
- Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).
