Summary
Основные методы и уточнения обработки замораживания-разрушения биологических образцов и наноматериалов для обследования с помощью просвечивающей электронной микроскопии описаны. Эта техника является предпочтительным методом для выявления ультраструктурные особенности и специализации биологических мембран и для получения мерных и пространственные данные ультраструктурным уровня в материаловедении и нанотехнологической продукции.
Abstract
Замерзание перелом / заморозить травления описывает процесс, при котором образцы, как правило, биологические или наноматериал в природе, заморожены, перелом, и воспроизведены в генерировать углерода / платина "бросить", предназначенный для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии. Образцы подвергают сверхбыстрой ставок замораживания, часто в присутствии криопротекторов, чтобы ограничить образование кристаллов льда, с последующим разрыва образца при охлаждаемым жидким азотом температуру в высоком вакууме. Полученный перелом поверхность тиражируется и стабилизируется испарения углерода и платины под углом, что придает поверхности трехмерной детали к броску. Эта техника оказалась особенно поучительно для исследования клеточных мембран и их специализаций и внес значительный вклад в понимание клеточных форме к соответствующей функции клеток. В этом докладе, мы рассматриваем требования инструмента и технический протокол для выполнениясублимационной перелом, связанный номенклатура и характеристики самолетов разрушения, вариации на обычной процедуры и критерии интерпретации замораживанием перелом изображений. Эта техника широко используется для ультраструктурным расследования во многих областях клеточной биологии и перспективен как новой техники визуализации для молекулярной, нанотехнологии, и материаловедение исследования.
Introduction
Понятие и практическое применение обработки замораживания-разрушения биологических образцов было введено Стир 1 более полувека назад. Ранняя аппарат присвоил разрозненные компоненты в рабочую автономного блока 1. Оригинальный аппарат был изменен и перерабатывается в коммерчески доступных инструментов для того, чтобы учесть крайнюю необходимость удаленного манипулирования, поддержания высокого вакуума, и испарение углерода и металлов для производства реплику подходящий для обследования с помощью просвечивающей электронной микроскопии (рисунок 1 и рисунок 2).
Типичный прибор состоит из высокой вакуумной камере с образцом таблицы и микротома руку, имеющей регулируемые жидкие пропускную азота (рисунок 1). Камера также находятся два электронных пушек, один для стабилизации углерода испарения расположенный на 90 ° углом к сцене образца, а другой для Platiкол / углерода слежки в регулируемым углом, обычно 15 ° - 45 ° (рисунок 2). Питание ресивера применяется для работы вакуумного насоса и электронные панели регулировать регулировки температуры и электронный контроль над огнестрельным оружием.
Первоначально задуманный как средство для достижения улучшенной визуализации вирусов, заморозить-перелом, полученный еще большую популярность в качестве метода для проверки и анализа клеточных мембран и их специализаций 2, 3. В самом деле, эта процедура является неотъемлемой частью выяснения структуры / функции отношения в клетках и тканях, и многие из этих исследований стоят как классических вкладов в клеточной и молекулярной биологии 4-9. Основная цель и обоснование для развития техники сублимационной перелома в том, чтобы ограничить артефакты, наблюдаемые в электронно-микроскопического разрешения, вытекающие из химической фиксации и обработки, используемой в обычных биологических электронной микроскопии. Здесь цель состоит в том, чтобы ограничить химическуюфиксация и заморозить образца с достаточной скоростью и часто в присутствии криопротекторов в того, чтобы ограничить образование кристаллов льда и других замораживание артефакты. Совсем недавно, эта техника нашла всплеск интереса от молекулярных биологов и материаловедения следователей для изучения наночастиц и наноматериалов.
Мораторий-перелом и заморозить травления изображения демонстрируют трехмерный характер и иногда ошибочно принимают за сканирующем электронном микроскопе. Тем не менее, замораживанием перелом препараты рассматриваются с помощью просвечивающей электронной микроскопии и их большой вклад в морфологических исследований с высоким разрешением является их уникальный представление структуры / функциональных элементов клеточных мембран. Замораживание-перелом обработки инициируется замораживание клеток и тканей с достаточной скоростью, чтобы ограничить кристаллизации льда и / или с использованием криопротекторов агентов, таких как глицерин. Затем образцы перелом в вакууме и репутациейLICA порождается испарения углерода и платины над поверхности излома. Оригинальный экземпляр переваривается из реплики, которые извлекается на стандартную EM образца сетки. Еще одна распространенная неправильная интерпретация замораживанием перелом изображений является то, что они изображают поверхности клеток. Однако основная предпосылка сублимационной перелома в том, что биологические мембраны разделены через липидный бислой в процессе разрушения (рисунок 3). Этот процесс в биологических мембранах дает два лица разрушения, один, который показывает организацию половины мембраны, прилегающей к цитоплазме, ПФ-лица, и один, который показывает половину бимолекулярного листовки мембраны, которая примыкает к внеклеточной среда, EF-лицо. Истинные клеточные поверхности, не представлены в замораживанием перелом изображений, но появляются только тогда, когда последующий добавил шаг сублимационной травления в соответствии с процедурой разрушения используется. Для того, чтобы эффективно травления ранее перелом образцы по выявлению поверхностные Detaiл, образцы должны быть заморожены с большой скоростью и без unetchablecryoprotectant. Травление воды с поверхности образца трещиноватых, раскрывающих, лежащие в основе функции достигается путем установки охлаждения микротомных руку над стадии образца, создавая разность температур между стадии, удерживающий образец и охлаждающей микротомных рычаг, который заставляет воду, чтобы сублимировать с поверхности. Когда вода сублимируется с поверхности образца разрушенных во время замораживания-травления маневра, то аспекты реальных поверхностей клеток, внеклеточный матрикс, цитоскелета структур и молекулярных агрегатов могут быть выявлены с высоким разрешением. Таким образом сублимационной перелом и заморозить травления не взаимозаменяемые термины, а скорее отражают поэтапный процесс последний из которых не может быть необходимым или желательным в зависимости от нужд конкретного исследования.
После ледостава перелома / стоп-травления процедуры, сломанные поверхности подвергаются направленных evaporaного слоя углерода и платины в целях обеспечения поддержки и изображений контраст с репликой. / Углерода испарения изображений платина может быть однонаправленным или поворотные и осуществляется либо сопротивление или электронных пушек. Однонаправленный затенение от известным углом, обычно 30º - 45 °, полезно при выполнении отдельных расчеты морфометрических. Образцы, которые были подвергнуты глубокой травления обычно поворотные тени и полученные образы этих образцов фотографически вспять для оценки.
Историческая, а также присутствует цель сублимационной перелома / заморозить травления техники является ограничение химическую фиксацию и обработку образца артефактов, которые связаны с более традиционными передачи процедур электронной микроскопии. Тем не менее, этот метод обеспечивает существенную преимущество в его способности придавать трехмерную деталь и тем самым облегчить приобретение морфометрических данных в биологических, материаловедения, и нanotechnology образцы. Мораторий-перелом и заморозить травления процедуры сложны и многогранны и некоторые аспекты его применения настроены. Эта презентация открывается вид обследования из главных особенностей процесса и отсылаем читателя к комплексным опубликованных протоколов 10, 11 в целях решения детали и настроить процесс для конкретных потребностей в области исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Подготовка биологических образцов для замерзания перелома / Зафиксированные-травления
- Использование обычного EM фиксирующий препарат, такой как 2% глутарового альдегида + 2% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере в течение 1 часа. выполнить первичную фиксацию биологических тканей. Примечание: В то время как может быть желательно заморозить некоторые виды образцов без предварительного фиксации, универсальные через кровь патогенных меры предосторожности мандат соответствующую фиксацию, где образец состоит из тканей человека.
- После первичной фиксации, промыть образца в том же буфере с добавлением 0,2 М сахарозы в течение не более 1 часа.
- Передача образца к криопротекторов раствора, состоящего из 25% глицерина в 0,1 М фосфатном буфере в течение не более 1 часа.
2 замораживания и хранения образцов заранее сублимационной перелома
- Выбор золота или меди образца заглушки соответствующего размера и формы для образца обрабатывается (фиг.4
- Использование щипцов прекрасные сорта и / или небольшой калибр шприцев иглы позиции небольшие фрагменты образца на вершине металла образца заглушки.
- Уменьшите содержание жидкости образца, чтобы липкая, слегка приклеить консистенции на отвода жидкости от края заглушки с фильтровальной бумагой.
- Для одиночных реплик, использовать маленькие иглы калибра шприцев создать насыпь ткани на пенек. Для двойного реплик, инвертировать другой окурок и расположите его точно над пенек и поместите слегка на поверхности образца, создавая многослойную (рисунок 5А). Не нажимайте образец из между двумя заглушками.
- Заполните два изолированных сосудах Дьюара с жидким азотом. Примечание: первое судно вмещает металлическую штангу, содержащий небольшое скважины, которая используется для разжижения небольшой объем газа пропана из коммерчески доступного цилиндра (фиг.5В). Второе судно является разделенная хранения / удерживающей емкости для краткоголы поддержания замороженные образцы в жидком азоте.
- Использование сопла цилиндра, расположенную в скважине пропан, открыть клапан баллона, и позволить газу поступать в скважину первого судна, где она будет сжижения. ПРИМЕЧАНИЕ: ВНИМАНИЕ !! Пропан взрывчатых веществ, могут привести к замерзанию ТРАВМЫ на контакт, и является удушающие. Используйте пропан только в химическом капотом сертифицированных для такого использования заботиться также, чтобы избежать посторонних источников воспламенения, используя одежды защитные от низких температур, и поддержанию достаточной вентиляцией.
- Как можно быстрее, забрать образец установки щипцами мелких классов и вонзить его в сжиженного газа в первом сосуде в течение нескольких секунд, а затем быстро передать второй холдинга судна жидкого азота (Рисунок 5Б).
- После того, как образцы замораживаются, магазин под жидким азотом до готовности передать на завод сублимационной перелома. Перенести заглушки на больше для хранения жидкого азота сосуд Дьюара для продленхранение при желании, однако следует позаботиться, чтобы не допустить окурки таять.
3 Эксплуатация замораживанием перелома инструмента и образца Обработка
- Загрузка образцов на держателе из латуни и в камеру
- Загрузите золотого образца окурки в буклет типа двойной реплик держатель образца или зажать устройство под жидким азотом и не поддерживать там до готовности на позицию в образце камеры (Рисунок 6).
- Когда камера добилась высокого вакуума (примерно 2 х 10 -6 мбар) и этап был охлажден до температуры жидкого азота, выключить насос, вентиляционные камеры, и позиционировать смонтированные образцами заглушек на стол образца как можно быстрее .
- Включите насос, восстановить высокий вакуум, и использовать электронные системы управления сценические и температуры рука, чтобы отрегулировать температуру образца таблицы до -100 ° С и прямой жидкого азота к микротома руку и бринг его до температуры жидкого азота.
- Процесс разрушения
- После достижения высокого вакуума, температуры сценический -100 ° С и микротоме руку при температуре жидкого азота, дистанционно открыть двойной держатель реплики образца таким гидроразрыва образцов на образец крепления (сублимационной fracture_movie1.mov).
- В случае образцов, предназначенных для травления после переломов, использовать лезвие поддерживается в зажиме на микротома рычага для бритья (например, перелом) поверхность образцов вместо этапа 3.2.1 (сублимационной etch_movie2.mov).
- Если добавленное замораживания-травления шаг должен быть выполнен, положение охлажденного микротомных руку над трещиноватых поверхностей для одного до нескольких минут. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот маневр будет сублимировать (т.е., травление) вода из поверхности излома. Эффект этого маневра, чтобы выявить истинные клеточные поверхности, внеклеточный матрикс и / или молекулярные сборки путем сублимации воды, в дополнение к FRActure лица, проходящий через липидный бислой мембраны.
- Металл затенение и поддержка реплики испарение с помощью электронных пушек
- Активируйте платины / углерода электронов или сопротивления пистолет и дать ей испариться тонким слоем (примерно 2 нм) платины / углерода над переломом поверхности от угла 30º - 45 °. Обычно для этого требуется около 15 - 20 сек.
- Активируйте углерода электрон или сопротивления пистолет, как в шаге 3.3.1 и испаряется тонкий слой углерода на поверхности излома образца из прямо над головой (90 °), чтобы оказать поддержку реплики. Обычно для этого требуется около 15 - 20 сек.
- Извлечение реплик
- По окончании слежки репликации и стабилизации углерода, выключите вакуумный насос, вентиляционные камеры, и удалить образец установки от инструмента.
- Используя пару щипцов мелких классов удалить каждый золото образца окурок от двойнойкопия буклета / зажим и позволяют таять в течение нескольких секунд, прежде чем осторожно опуская окурок на поверхности воды в пятне пластины (рисунок 7). Примечание: углерод / платины реплики, содержащий адгезивный материал образца будет плавать на поверхности воды.
- Маневр реплик, используя либо штраф проволочную петлю или обычный медный электронном микроскопе сеткой, на тонких щипцов и передачи в другое место пластины, содержащей 5% бихромата натрия в 50% серной кислоты для одного до нескольких часов класса. ПРИМЕЧАНИЕ: Эта ванна переваривает фактического биологического материала образца из реплики. Полная прочность бытовой отбеливатель может быть заменен на дихромата / раствора серной кислоты.
- Когда пищеварение завершена, передать копию обратно в чистую поверхность воды и извлечения на стандартную микроскопии сетки меди электронов. (ПРИМЕЧАНИЕ: Реплики могут распадаться на более мелкие куски в процессе пищеварения, но даже очень малые копии могут содержать существенную информацию и должны быть RETRieved и рассмотрены.) Магазин реплики поддержки сеток в коммерчески доступных для распределительных коробок, где они будут оставаться стабильными в течение многих лет с бережное обращение.
4 Ультраструктурный Экспертиза замерзания разрушения / травления реплик
- Вид реплики в просвечивающем электронном микроскопе при ускоряющем напряжении обычно от 50 - 80 кВ.
- Запишите соответствующие изображения на стандартный ТЕМ фильма или с цифровой камерой высокого разрешения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ключ предпосылка сублимационной перелома интерпретации изображений является то, что самолеты разрушения проходят через липидный бислой мембран, дающих два лица разрушения, называемого конвенции PF-лицевой (плазма поверхности разрыва) и EF-лица (внеклеточный поверхности разрыва) (рис 3). ПФ-лицо половина липидный бислой мембраны, прилегающей к цитоплазме клетки и EF-лица является половина липидный бислой мембраны, прилегающей к внеклеточную среду. Методика замораживания-перелом особенно полезен для исследования структуры мембраны и два лица, как правило, заметно отличается с PF-лица заполняются со многими мембранных связанных частиц в отличие от EF-граней, которые содержат меньше. Цитоплазматические содержание замораживанием перелом клеток, как правило, грубые на вид и особо не открывая хотя мембраной органеллы, такие как ядер и Гольджи могут быть легко идентифицированы. Особый интерес к INVEstigators применяющие этот метод, являются специализациями мембранной структуры, которые могут быть интерпретированы для их функционирования. К ним относятся конкретные распределения мембранных связано частиц, ресничные мембранные специализации и межклеточные.
Cilia-ассоциированных структур
Проживающих в клеточной мембране у основания каждого эукариотической реснички и жгутика представляет собой массив из мембранных связан частиц организованы в нитей, окружающих вал реснички и известен как цилиарной ожерелье (фиг.8) 12-16. Эта структура обладает определенной степенью морфологической гетерогенности в различных видов и было предположение, чтобы быть многофункциональным, поскольку она появляется перед появлением мерцательной вала во время цилиогенеза и остается на месте в зрелом реснички. Зарождающееся ожерелье цилиарного происходит от агрегации и организации мембранных массивов частиц до времени еСлияние цилиарной вала во время цилиогенеза предлагая его возможное участие в начале организации развивающегося аксонемы 14.
Плотных контактов и эпителиальных Permeabi LITY
В различных эпителиев, сублимированные перелом исследования показывают сложную организацию анастомоза пряди и канавок, окружающие верхушечный аспект базолатеральных границ. Эта структура пояса как известно как плотного контакта или zonulaoccludens (рисунок 9) и, как полагают, действуют как регулятор эпителиальной проницаемости к потоку парацеллюлярной 3, 17-20. Плотные соединения с нескольких прядей были описаны как "дырявая" в то время как те, с более сложной организации описываются как "жесткой". Эта организация по-видимому, соответствуют функции эпителия, к которым они связаны. В PF-лики плотных контактов отображаются как жил в то время как EF-грани обнаруживают complemeПищеварительный канавки.
Щелевые контакты и межклеточной коммуникации
Щелевые соединения (Рисунок 10) появляются в замораживанием перелом препаратов различных тканей и представлены плотных массивов частиц на PF-граней и дополнительных ямы на EF-граней. Эти структуры, как полагают, представляют мембранные сайты, которые облегчают межклеточную коммуникацию. В тканях, где они присутствуют, демонстрации прохождения низкомолекулярных флуоресцентных красителей и потоков кальция были продемонстрированы 21-24 предполагая, что они представляют собой физический маршрут для прохождения сигнальных молекул.
Рис.1 Схема коммерческой сублимационной перелома / травления завода. В крайне левых давлением Дьюара еeeding охлаждения жидкого азота до стадии образцом и охлаждение микротомных руку в контролируемых условиях. В центре находится блок с образцом камеры и электронные пульты управления с правой стороны. В правом дополнительный бак жидкого азота, на котором используется отходящий газ, чтобы довести образца камеру с атмосферой.
Рисунок 2 замерзания перелом / травление завод образец камера с открытой дверью, чтобы выявить позиции направленно направленных электронных пушек, охлаждения саван, и образец прикреплять где образцы в держателей латунных расположены. Образцы вводятся в камеру через порт слева от камера.
ig6highres.jpg "ширина =" 500 "/> 4 / 51694fig11highres.jpg "ширина =" 500 "/> 
Рисунок 4 два типа образцов монтирует для сублимационной перелома / процедур травления. (Левый) двойной копией образца держатель буклет используется для обычных замораживанием перелом процедур, выполняемых без травления. Образец помещают между двумя золотыми образцов окурков и позиционируется в латунной буклета. Образец перелом, открыв буклет под вакуумом в образце камеры (См заморозить-Fract ure_movie1.mov). (Справа) крепление используется в основном для сублимационной травления. Образец помещается на золотых окурков и заперли в держатель из латуни. Образец треснул по нежной бритья с лезвием бритвы, зафиксированной в микротома руку. Эта конфигурация является предпочтительным для травления процедур (см сублимационной etch_movie2.mov). 
Рисунок 5 Подготовка к замораживанию-разрушения образца смонтировать. Образец зажат между двух золотых гор (а) и замораживали в лунку, содержащую охлаждением жидким азотом и пропан (переднего плана) с последующим переводом в сборный сосуд Дьюара с жидким азотом (фон) ( Б).
Рисунок 6 Демонстрация позиционирования замороженные замораживанием перелом образца в двойной копией образца держателя буклета в рамках подготовки к введению к образцу палаты сублимационной перелома / травления завода. 
Рисунок 7 Извлечение реплик следующих перелом и затенения в сублимационной перелома / травления завода. "" Является чистой поверхности воды в месте пластины. Реплика плавали от образца заглушки передается "B" также содержащий подкисленный раствор дихромата натрия или бытовое дезинфицирующее для переваривания ткани от реплики. "С" означает последующие чистой водной поверхности, к которой очищенный реплики передается до бEing извлечены на микроскопии сетки меди электронов. 
Рисунок 8 Реснички связанные структуры, выявленные сублимационной перелома. Белые стрелки указывают на специализированных массивов мембрана частиц на люминальной границе эпителиальных клеток, подвергающихся цилиогенеза. Эти массивы частиц представляют зарождающиеся ресничные ожерелья, которые проживают на базах выходящего и зрелой ресничек (черная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 9 Перелом через эпителиальные клеточные мембраны выявить числе примеры pF- и EF-разрушения лицах. Прядь и паз организация узких соединительных комплексов очевидна и межклеточное пространство отмечены стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Фигура 10 изображений сублимационной перелом щелевых контактов в печени крыс. Частицы очевидны на PF-лица и дополнительные ямы очевидны на EF-лица. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 11 Иммуногистохимический локализация коннексин использованием коллоидного золота помечены антитела на подготовке сублимационной перелома иллюстрирующий конкретный локализацию на щелевых контактов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 12 Пример быстрого замораживания с глубокого травления и поворотного слежки. Эпителиальных клеток была сломана через цитоплазму и PF-лицо очевидные (наконечники стрел). За стрелок можно увидеть истинное поверхности клеток, выявленных последующим травлением. Пожалуйста CLIобы здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 13 Пример быстрого замораживания с глубокого травления и поворотного слежки выявить молекулярные комплексы, содержащие бычий трахеи ciliaryaxoneme. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В годы после его введения и коммерческой доступности, сублимационной перелом / травления процедуры были широко использованы для исследования биологической структуры мембраны. В самом деле, лучшие перспективы некоторых структурных специализации мембран были получены в вымораживанием разрушение / травления препаратов. Эти исследования не только способствовали пониманию структурной организации мембран, но и при условии, понимание того, как структура и функция связаны.
Появление стандартного биологического электронной микроскопии привели осознанием того, что химическая обработка с альдегидных фиксаторов, химически активных веществ и тяжелых металлов, необходимых для придания дифференциальное электронную плотность с биологическими образцами, сами способствовали генерации артефакта. Развитие технологии сублимационной перелома была частично основана на усилиях по сокращению обработки артефакт. Тем не менее, она была признана, что стоп-перелом/ Травление вводит свой собственный набор артефактов, главным из которых является повреждение кристаллов льда. Ткани погрузился прямо в опыте жидкого азота пониженную скорость охлаждения за счет формирования изолирующего слоя газообразного азота, окружающей образец, который приводит к образованию кристаллов льда, что уничтожить ультраструктурную деталь. Эта проблема преодолена с использованием криопротекторов, такие как глицерин и замораживание ткани сначала в жидком пропане азота охлаждением. Исторически сложилось так, окунуться замораживание проводили в охлаждаемым жидким азотом хлорфторуглеродов, но эти материалы уже были ликвидированы использования в связи с их пагубного воздействия на окружающую среду. Даже в самых лучших условий криопротекторных, природа процесса неизбежно приводит к грубой, гравий, как поверхности в цитоплазматических переломов; Тем не менее, переломы через мембранные структуры показывают также организованные функции, имеющие конкретные плоские организации по отношению к их ориентации в клеточной мембране. Эти изображениявозможно только с использованием криопротекторов агентов, таких как глицерин, которые ограничивают фразу повреждения кристалла, и самой глицерина в некоторых случаях также может ввести следов искусственной перераспределение мембранных связано частиц. Кроме того, глицерин не может быть сублимированной от поверхности излома ограничивая тем самым возможность для успешного травления. Если последующая процедура травления желательно, то образец должен быть быстро замораживают в моде, что ограничивает повреждение кристаллов льда с использованием либо жидкий гелий или азот слякоть и / или подошел с использованием криопротектора, такие как ацетон, который легко сублимированной из раздробленной поверхности.
Хотя первоначальный доклад рулить было сосредоточено на визуализации вирусы, он находится в мембранной структуры, что стоп-перелом / травление нашли более широкое применение. Действительно, структуры, такие как жесткие и щелевые контакты и мерцательная мембранных специализаций были элегантно раскрывается в замораживанием перелом препаратов. Замораживание-перелом имеет Founд значительная утилита в достижении понимания мембраны дифференциации в процессе разработки 15 17,24 и в мембранной патологии 25-30. В предыдущих докладах этой лаборатории, показали картину дифференциации узких соединительных комплексов во время развития дыхательных путей, нарушение цилиарных мембранных структур, связанных с экспериментального воздействия инфекционного агента, и деградации узких соединительных комплексов в эпителиальных клетках дыхательных путей, связанных с загрязнителей воздуха и табачного воздействию табачного дыма у экспериментальных животных и людях.
Технические Расширения Фриз-Перелом / Замораживание травления Порядок
Метод закалки с помощью сжиженного пропан заморозить образцы, описанные здесь, пожалуй, самый распространенный подход к замораживанию биологических образцов для обычной сублимационной перелома. Тем не менее, другие подходы к замораживанию должны быть присвоены где замораживание-травление будет выполнятьред. Поскольку глицерин не является etchablecryoprotectant, образцы для сублимационной травления должны быть заморожены в отношениях, которые ограничивают образование кристаллов льда. Это может быть достигнуто с помощью etchablecryoprotectant, такие как ацетон и / или путем замораживания образец крепление к металлической поверхности, охлаждаемой жидким гелием или жидкой азотной шуги. Быстрое замораживание без криопротекторами также может быть выполнена с использованием замораживания спрей или высокое давление замораживание в сжиженного пропана.
Недавние усилия по дальнейшему относятся структуры и функции с использованием технологии сублимационной разрушения присвоили эту технику в концерте с иммуногистохимического маркировки 31, 32. Здесь, антитела к специфическим антигенам может быть эффективно и точно локализованы в мембранных участков (рисунок 11).
В то время как замораживание-перелом с однонаправленной слежки на сегодняшний день является наиболее широко используемого протокола, некоторые экспериментальные проекты будут призывать к быстрого замораживания с Литтлэлектронной или ограничено криозащиты, сопровождается травления поверхности излома выявить истинные поверхности клеток, внеклеточный матрикс и / или высокомолекулярные комплексы, и вращательное слежку для придания контраста 16 (Рисунок 12 и Рисунок 13).
Существует растущий интерес к применению сублимационной перелома в области нанотехнологий, материаловедения, и в использовании этой техники в качестве инструмента визуализации в области молекулярной биологии. В самом деле, наноматериалы во многом может быть последовательным в их организации с вирусных структур, для которых вымораживанием перелом был первоначально предусмотренных в качестве средства для визуализации. Кроме того, изготовленные липосомы, структуры, подобные по форме биологических мембран, широко изучаются для адресной доставки фармацевтических агентов и направленной генной терапии. Потому что их организация существенно мембраны как, обработка стоп-перелом может иметь значительное применение в производстве, раскрывающие образы в качестве компонента в развитпинговать эти терапии 33.
Таким образом, стоп-перелом технологии были историческое значение для характеристики организации и функционирования клеточных мембран. Тем не менее, замораживание-перелом находит новые сферы полезности в координации с молекулярной биологии и нанотехнологий, а почти наверняка будет способствовать прогрессу в этих быстро развивающихся областях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| Standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| Sodium dichromate | various suppliers | ||
| Sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Propane | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
References
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
- Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
- Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
- Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E.
- Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
- Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
- Chandler, D. E., Sharp, W. P. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).
- Severs, N. J.
- Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
- Rohatgi, R., Snell, W. J.
- Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
- Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
- Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
- Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
- Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
- Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
- Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
- Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
- Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
- Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
- Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).
