Summary
Xenopus laevis haletudser foretrækker svømning på den hvide side af en sort / hvid tank. Denne adfærd er styret af deres vision. Baseret på denne adfærd, præsenterer vi en simpel analyse for at teste den visuelle funktion af haletudser.
Abstract
Måling af den visuelle funktion i haletudser af frøen, Xenopus laevis, muliggør screening for blindhed i levende dyr. Den optokinetic svar er en vision-baseret, refleksiv adfærd, der er blevet observeret i alle testede hvirveldyr. Haletudse øjne er små, så halen flip respons blev anvendt som alternativ foranstaltning, som kræver en uddannet tekniker til at registrere subtile svar. Vi har udviklet en alternativ adfærd assay baseret på den kendsgerning, at haletudser foretrækker at svømme på hvide side af en tank, når de anbringes i en tank med både sorte og hvide sider. Assayet præsenteres her, er en billig, enkel alternativ, der skaber en reaktion, der er let måles. Opsætningen består af et stativ, webcam og indlejrede test tanke let tilgængelig i de fleste Xenopus laboratorier. Denne artikel indeholder en film, der viser adfærd haletudser, før og efter overskæring af synsnerven. For at teste funktionen af det ene øje, inkluderer vi også repræsenrepræsentative resultater af en haletudse, hvor hvert øje undergik retinal axotomi på hinanden følgende dage. Fremtidige undersøgelser kunne udvikle en automatiseret version af denne analyse til at teste visionen om mange haletudser på én gang.
Introduction
Xenopus laevis er blevet anvendt som en model organisme for at studere øjet formation. Øjnene udvikle sig hurtigt, vokser til modenhed på mindre end en uge til at teste gener eller veje, der har en effekt på visuelle udvikling og funktion. For at teste synsfunktionen har optokinetic og optomotor respons blevet brugt i zebrafisk og Xenopus haletudser henholdsvis 1,2. Fordi øjnene af Xenopus haletudser er relativt mindre end zebrafisk, denne analyse kræver brug af specialudstyr og uddannet personale til at opdage den subtile hale-flip og eye-bevægelse adfærd i Xenopus. En mere robust adfærd i Xenopus er præferencen for svømning i en tank med en hvid baggrund, der er beskrevet heri 3. Når du placerer en haletudse i et halvt sort / halvt hvid tank, pre-metamorfe haletudse hurtigt svømmer til den hvide side af tanken. Vi har tidligere anvendt dette assay til at bestemme, om pluripotente celleafledtøjne var funktionelle 4.. Her rapporterer vi en detaljeret version af dette assay, som kan anvendes til at teste den visuelle funktion premetamorphic Xenopus haletudser.
Denne analyse er enklere end den optomotor respons analysen, da det kun kræver et monteret digitalt videokamera, et digitalt kamera-software og standard udstyr findes i de fleste Xenopus laboratorier. Desuden noteres reaktion kræver ingen særlig uddannelse til optælling resultater. Vores repræsentative resultater viser, at den samme gruppe af haletudser, efter at have gennemgået en dobbelt retinal axotomi, svømme tilfældigt rundt i akvariet. Vi har også inkluderet den adfærd analyseresultaterne fra en repræsentativ haletudse, der viser, hvordan det ene øje kan testes for visuel respons. Et regneark er medtaget, således at tallene er erhvervet under analysen kan indsættes og analyseres. Dette arbejdsark kan bruges til at afgøre, om de testede haletudser have en visuel reaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal Care
Xenopus laevis haletudser anvendt i denne undersøgelse blev dyrket, opdrættet og behandlet i henhold til procedurer, der er godkendt af Upstate Medical University IACUC og vejledning til pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
. 1. Pre-adfærd Setup: Tadpoles
- Opnå befrugtede Xenopus embryoner fra en kommercielt tilgængelig kilde eller in vitro befrugtning af oocyter, som tidligere beskrevet 6.
- Placer blastula til neurale plade embryoer ved 18 ˚ C i 60 mm petriskåle indeholdende 0,1 x MMR [10 X Marc Modified Ringers (MFR) løsning lager (10 mM MgCl2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES; 1 M NaCI; justeret til pH 7,5, autoklaveret og opbevaret ved stuetemperatur)] med 50 ug / ml gentamicin antibiotikum. Skift 0.1X MMR hver dag og fjerne eventuelle døde fostre.
- Når embryonerne nå Nieuwkoop og Faber scene ~ 27-30 juli, skifte the embryoner i 0,1 X MMR uden antibiotika for at tillade gut bakterievækst.
- Dyrk de haletudser, indtil de når fodring (stadium 45) og flytte dem ind i 100 mm petriskåle fyldt med 0,1 x MMR. Fodre dem brændenælde pulver supernatanten hver anden dag i en uge, ændre 0.1X MFR for den intervenerende dag.
- Efter en uge i 100 mm petriskål, flytte dyrene til halv gallon tanke fyldt med frø vand [0,5 g / L øjeblikkelig havet og 2 mM natrium dibasisk (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Fodre dem som i trin 2.4, men ændre vand kun 2-3 gange om ugen, når vandet er grumset. Vedligehold dyrene på en 12 hr light/12 mørk lys cyklus med lysene tænde ved 6 am.
- Placer den halve gallon tank med forsøgspersonerne på en hvid overflade som en lab bænk inkontinensunderlaget, mindst 12 timer O / N, før testning.
- Test haletudser på trin 45 til 50, som beskrevet i trin 3 nedenfor.
. 2. Pre-adfærd Setup: Equipment
- Afsæt et område af laboratoriet for adfærden assay. Det bør være i en rolig, lav trafik område med standard lysstofrør.
- Forbered test tanke til dyrene.
De indlejrede, halv gallon test tanke er sammensat af to dele: en indre tank, der vil holde vand og haletudser; og en ydre tank med den visuelle stimulus.- For den indre beholder, lave et lille mærke på de udvendige hjørner med en Sharpie, 5 cm fra bunden; dette er vandlinjen (figur 1A, grøn stiplet linje).
- Også for den indre beholder, fylde divets i tanken (i hjørnerne og midten) med et inaktivt stof, ligesom Sylgard elastomer. Bemærk: haletudser vil drysse i disse områder, hvis de ikke er udfyldt
- For den ydre beholder dække nøjagtigt halvdelen af ydersiden af en tank med sort elektrisk tape, og den anden halvdel med det hvide silkepapir Figur 1B.
- Placer tankene påpode drejeskive.
- Opsætning webcam / stativ, så det er over test tanke. Indstil kameraet til at tillade visualisering af testområdet, som vist i figur 1C.
- Slut webcam til en computer med QuickTime Player installeret 5.. Tænd for kameraet. I QuickTime Player, under Filer, vælg 'Ny filmoptagelse. Den opførsel assay setup vil være synlig på computeren med det samme.
- Drapere en letvægts bomuld klud over hele opsætningen at nedbringe de eksterne signaler, som kan påvirke haletudse adfærd, samt reducere reflekteret lys på overfladen af vandet.
- Sørg for, at luminans under klud foranstaltninger mellem 35-50 cd / m 2.
3.. Opførsel Assay
- Fyld den indre test tanken til 5 cm vand mærke foretaget i trin 1.2.1 med frø vand.
- Ved hjælp af en lille net, forsigtigt flytte dyret ind i den indre test tank.
- Open QuickTime software på computeren, og ved hjælp af den ydre beholder som en guide, skal du sørge for, at kameraet er i stand til at visualisere og registrere testområdet.
- Skriv dyret navn, dato og klokkeslæt på et stykke papir og optage med kameraet.
- Anbring prøven tanken i den ydre beholder med den sorte side af tanken til højre Figur 2.
- Start optagelse filmen umiddelbart efter at arrangere tanken og sæt timeren til 2 min.
- Når timeren bipper, fjerne den indre test tank, dreje den ydre beholder 180 ° og placere den indre test beholder ind i den ydre tank. Starte timeren. Bemærk: den sorte side skal nu ligge på den anden side.
- Gentag trin 3.7, otte gange mere for i alt ti forsøg. Brug figur 2 som en guide, kontrol fra hvert forsøg.
- Gentag adfærd analysen på to forskellige dage.
4.. Retinal axotomi
- Placer dyr i 0,02% tricaine indtil de reagerer ikketil en hale knivspids med en # 3 pincet.
- Smelt 1% agarose i 0,1 x MMR og derefter tilføje til en 60 mm petriskål. Når afkølet, fyldes en lille rektangulært divot i agarose og tilføje haletudse til divot med lidt 0.02% tricaine, således at dyret er delvist nedsænket i væsken.
- Gennembore huden på en 45 graders vinkel bag rygregionen af øjet med en 25 G-nål, mens afstivning dyret mod pincet på den modsatte side.
- Pas på ikke at klippe venen, der ligger ved siden af den optiske nerve, forsigtigt hånden ind i hullet med # 5 pincet, snip synsnerven og vend det ud af vejen. Hvis der er alvorlig blødning skyldes et uheld snipping arterien, derefter hurtigt placere dyret i 2% tricaine at aflive. ADVARSEL: 2% tricaine opløsning kan forårsage følelsesløshed i mennesker. Denne løsning bør håndteres med handsker.
- At gendanne dyret efter operationen, placere dyr i 100 mm petriskål med 0,7 X MFR og 50 pg / ml gentamicin i 20 min. Next, overførsel haletudse til genindvindingstanken med frø vand. Lad dyr hvile O / N.
- Den næste morgen, teste den visuelle funktion som beskrevet ovenfor (trin 3,1-3,9).
5.. Analyser Resultater
- Efter forsøgene er færdig, måle mængden af tid haletudse forbliver på sorte side af tanken.
- Manuelt se videoerne ved hjælp af software, der viser tid og giver hyppige pauser. Kig på video display tid. Notér starten af de to-minutters forsøget, der er, når den indre beholder korrekt reder ind i den ydre tank og kvadreres i kameraets synsfelt.
- Brug position haletudsens øjne til at definere, hvilken side af tanken dyrene svømning på. Definer krydser over fra den ene side af tanken til den anden, når begge øjne har krydset den sorte / hvide linje.
- Skriv ned i begyndelsen og slutningen af hvert interval (i sekunder), som dyret tilbringer på den sorte side. Pause og revind på videoen for at sikre nøjagtigheden. Alt det sek inden hvert forsøg.
- Input disse tal i vedlagte Behavior Regneark. Regnearket beregner forholdet mellem tid at dyret brugt på den hvide side ved at trække den tid på den sorte side af tanken fra den samlede 120 sek forsøg og dividere med den samlede tid i sek [(120 - total sekunder brugt på den sorte side) / 120 sec]. Gennemsnit regnearket dette forhold i løbet af alle 10 forsøg.
- Brug en student t-test, parret, tosidet fordeling at afgøre, om retssagerne mellem dage er signifikant (P ≤ 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidligere rapporter har vist, at premetamorphic Xenopus haletudser foretrækker at svømme på hvide side af en sort / hvid tank og kaldte denne analyse, Background Preference Color Assay 3 Vi har ændret denne analyse for at teste den visuelle funktion af enten øjet af haletudser i mindre end en uge. På denne måde kan deres øjne indsamles til histologisk undersøgelse.
Vi viser her, hvordan responsen skyldes visuelle referencer. I Movie 1, haletudserne i venstre og højre paneler er de samme dyr. Til venstre er dyrene før kirurgi og til højre, af dyrene efter overskæring begge optiske nerver. Vi hvirvlede vandet for at vise, at der tilføjes noget at frastøde dyrene fra den sorte side eller tiltrække dem til den hvide side. I filmen, vi giver en skematisk af haletudser i de nederste hjørner, som viser tilstanden af synsnerven for hvert sæt af dyr. I Movie 1, normal, un-drevne haletudser reagere på baggrundsfarven på mindre end 30 sek i testen tanken mens blinde haletudser svømmer formålsløst rundt tanken. Hastigheden af de film blev øget, og den faktiske tid, der registreres i øverste højre hjørne.
For at teste synet af det ene øje, har vi inkluderet resultaterne fra et dyr, hvis synsnerve blev brudt på det ene øje og testet i vores analyse. Synsnerven i det andet øje blev afbrudt efter to dages test, og visionen-styrede adfærd testet på følgende dage igen. I figur 3 en graf viser mængden af tid, haletudse svömmede på den sorte side af tanken. Dette blev målt på seks på hinanden følgende dage figur 3A. Som beskrevet ovenfor blev den højre synsnerve afbrudt efter adfærd blev testet på dag 2 og venstre efter adfærd test på dag 4. Haletudse foretrækkes den hvide side af tanken tilfældigt til 50% af den tid, figur 3C. Bemærk, at enimal brugt mere tid på den hvide side af tanken i løbet af de sidste 6 forsøg på dag 1 til 4. Mængden af tid brugt på den sorte side var mere selv på dage 5 og 6, da dyret var blind på begge øjne. Resultaterne fra hver af de to dage var gennemsnit sammen og præsenteres i en grafisk form figur 3C.
Figur 1.. Eksperimentel opsætning af vision-styrede adfærd assay. (A) Den inderste test tanken forbliver gennemsigtig og markeres for at angive vandstande (grøn stiplede linjer på hjørnet). (B) Den ydre test tanken er dækket i sort elektrisk tape på den ene halvdel og hvid silkepapir på den anden. (C) De haletudser visualiseres ved hjælp af et webcam placeret på et stativ og er forbundet til en bærbar computer. Afprøvningen tankens hvile på en pode drejeskive at give mulighed for nem drejning mellem forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Skematisk af, hvordan visionen-styrede adfærd analysen udføres. De rektangler repræsenterer test tank, der viser, hvordan den halve hvid / halv sort område ændres med hvert forsøg. Dette kan anvendes under adfærd assay for at markere prøvenummer. Testen tank på højre er et close-up af haletudse og dets forventede adfærd under to min analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
hin-side = "altid"> 
Fig. 3. Et repræsentativt eksperiment optælling den procentdel af tiden, haletudse svømmede på den hvide side af testen tanken. (A) Størrelsen af sek haletudse brugt på den sorte side af tanken måles og anbringes i en tabel. (B ) Tabellen i A omdannes til den procentdel af tiden brugt på den hvide side af tanken. Dette gøres ved at trække sek brugt på sorte side fra den samlede forsøgstiden (120 sek) og dividere med 120 sek. Haletudser, der var ubehandlet (U), havde en enkelt axotomi (SA) og derefter en dobbelt axotomi (DA) blev testet. (C) Grafen repræsenterer den gennemsnitlige procentdel af tid brugt i den hvide side (hvid bar) og sort side ( sort bjælke). Tabellen, der anvendes til at gøre grafen er vist nedenfor.g3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1. Behavioral reaktion seende og blinde dyr i den hvide baggrund præference assay. Tadpoles i venstre og højre paneler er den samme, men dem til højre har gennemgået dobbelt retinal axotomi. En skematisk i de nederste hjørner angiver, om synsnerven er intakt eller udskilles (blå bar). Timeren i øverste højre hjørne indikerer tid. Filmen er drønede op for nemmere at se. Når i det hvide område, læg mærke til hvordan de haletudser svømmer tæt på grænsen mellem hvid og sort og baglæns. Klik her for at se denne video.
| Day 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | |
| Forsøg 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Forsøg 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Forsøg 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Forsøg 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 </ Td> | 0 |
| Trial 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Forholdet mellem tid brugt på hvide side | ||||||
| Forhold 1 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Forhold 2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 3 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 4 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 5 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Forhold 6 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Forhold 7 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 8 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 9 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 10 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Gennemsnitlig | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | <td> 1.00|
| Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | |
| Forsøg 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 69 | 69 |
| Forsøg 2 | 0 | 3 | 0 | 88 | 68 | 58 |
| Forsøg 3 | 7 | 0 | 28 | 0 | 58 | 47 |
| Forsøg 4 | 0 | 0 | 11 | 0 | 59 | 72 |
| Trial 5 | 0 | 0 | 7 | 22 | 57 | 57 |
| Trial 6 | 1 | 98 | 4. | 56 | 69 | 53 |
| Trial 7 | 0 | 13 | 33 | 24 | 44 | 57 |
| Trial 8 | 0 | 113 | 38 | 24 | 36 | 64 |
| Trial 9 | 0 | 0 | 4. | 43 | 60 | 57 |
| Trial 10 | 1 | 21 | 0 | 32 | 63 | 80 |
| Forholdet mellem tid brugt på hvide side > | ||||||
| Forhold 1 | 100% | 100% | 100% | 100% | 43% | 43% |
| Forhold 2 | 100% | 98% | 100% | 27% | 43% | 52% |
| Ratio 3 | 94% | 100% | 77% | 100% | 52% | 61% |
| Ratio 4 | 100% | 100% | 91% | 100% | 51% | 40% |
| Ratio 5 | 100% | 100% | 94% | 82% | 53% | 53% |
| 99% | 18% | 97% | 53% | 43% | 56% | |
| Forhold 7 | 100% | 89% | 73% | 80% | 63% | 53% |
| Ratio 8 | 100% | 6% | 68% | 80% | 70% | 47% |
| Ratio 9 | 100% | 100% | 97% | 64% | 50% | 53% |
| Ratio 10 | 99% | 83% | 100% | 73% | 48% | 33% |
| Gennemsnitlig | 99% | 79% | 90% | 76% | 51% | 4.9% |
Opgaveark 1. Hvid baggrund præference assay regneark. Dette arbejdsark har beregningerne indbygget, så den kan bruges til at indtaste tal og optælling resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterer her en simpel vision guidet adfærdsmæssige assay, som let kan udføres i henhold til en uge ved minimalt uddannet lab personale. Mens andre analyser kræver specialiseret udstyr og ekspertise i dyreadfærd, denne analyse giver mulighed for en hurtig test for at afgøre visuel funktion. En anden adfærdsmæssige analyse, Visual undgåelse analysen, er udviklet til at bestemme, hvordan tectum bidrager til visuel perception i Xenopus 10.. Dette assay måler rumlig tuning og kontrast følsomhed i respons på en bevægende versus stabil baggrund, og dermed kan måle mere specialiseret visionbaseret adfærd end blot assay rapporteret her. Et automatiseret adfærd er blevet rapporteret, der kan måle mængden af tid brugt på den ene side af tanken 8. Der er også kommercielt tilgængeligt software (fx ANY-labyrint software), der er blevet anvendt til at måle mængden af tid zebrafisk tilbringer i mørke eller lyse omgivelser 9. Den assay rapporterer vi her ikke kræver køb af disse typer af dyrt udstyr eller software, men i stedet er afhængig af hverdagens reagenser og udstyr til måling af visuel funktion.
Visionen guidet analysen udføres på et dyr til at teste sin visuelle funktion. Når man sammenligner de adfærdsmæssige analyseresultater fra flere haletudser til hinanden, vi observeret nogen statistisk forskel mellem dyr indenfor behandlingsgrupper. Vi testede tre haletudser på seks dage i træk og også testet yderligere fem dyr på tre dage i træk, kører ti forsøg per dag. I begge tilfælde fandt vi ingen statistisk signifikante ændringer blandt de ubehandlede eller enkelt axotomi grupper (P = 0,2067), men opnået en statistisk signifikant ændring, når disse dyr blev sammenlignet med den dobbelte axotomi-gruppen (P = 0,002). Dette blev målt ved anvendelse af Prism 6.0c software, der kører en 2-vejs ANOVA statistisk test med en Tukeys multiple sammenligningstest (n = 8 haletudser). For at få den maksimalemængde datapunkter før operationen, foreslår vi, ved hjælp af seks-dages opførsel analyse. Hvis resultaterne skal opnås hurtigere med mindre forandringer i vævet, foreslår vi, ved hjælp af tre-dages-system.
Dette assay tester et dyr ad gangen. Vi udførte pilotundersøgelser for at se, om der kunne måles to haletudser eller flere samtidig. At afgøre, om at have to haletudser i en tank påvirket deres præference for den hvide side af tanken, vi testede hver haletudse separat og derefter sammen. Da billederne blev taget over tanken, hvis haletudser svømmede over eller under hinanden i længere tid, fandt vi det vanskeligt at skelne dem fra hinanden. Hvis vi brugte haletudser i forskellige størrelser, bemærkede vi, at de større en vil påvirke, hvor mindre én svømmede. Fremtidige teknologier kan udvikles til at genetisk mark haletudser, hvilket vil give mulighed for bedre sporing af flere dyr af samme størrelse.
Ved udførelsen af denne analyse på snesevis af tadpoles, vi observeret, at nogle haletudser foretrak den hvide side mere konsekvent end andre. Haletudser, hvis adfærd varieres med mere end 10% i to på hinanden følgende dage, ville vi blev testet igen på tredje dag før operation. Dette kan have været på grund af en anden observation: Vi har bemærket, at anbringe dyrene på en hvid baggrund også gjort en forskel i deres præference for den hvide side af tanken. At have det ekstra dag kan have hjulpet betinge nogle haletudser til at foretrække den hvide side af tanken. En begrænsning ved dette assay er, at det kun tester synsfunktion. Den variation vi observerede kunne skyldes andre udviklingsmæssige defekter, foruden reduceret visuel funktion eller blindhed. Derfor blev dyr, der viste mindre end 60% præference før operation ikke testet yderligere.
Vi testede også en række aldre af præ-metamorfe haletudser. Vi fandt, at haletudser yngre end trin 45 var meget lille, og deres øjne var vanskelige at spore ved hjælp af vores viBCAM. Ældre haletudser (iscenesætter 51-55 +) var mere distraheret; selv om de i sidste ende brugt mere tid på den hvide side af tanken, synes de at tage længere tid at svømme der. Disse ældre dyr var større, og derfor er lettere at spore, men havde brug for at teste forud for operationen som anført ovenfor. I modsætning hertil er de fleste af haletudser på trin 45 op til 50 opførte sig, som forventet, og dyr af disse aldre ville være bedst at bruge i fremtidige undersøgelser.
Har vist døgnrytmen lys ændres til at påvirke vision-guidede adfærdsmæssige reaktioner i Xenopus 2. I overensstemmelse med denne observation, bemærkede vi, at det samme dyr, der hurtigt svømmede til den hvide side af testen tank i forsøg, der gennemføres i morgen, tog meget længere i løbet af eftermiddagen adfærd tests. Efter at have foretaget en række »samme dyr / anderledes Time 'forsøg vi bestemt den bedste tid for adfærden assay var fra 06:00 til 01:00.
Vi har også brugt en digital handheld camcorder forbundet med firewire at teste dyrene under dårlige lysforhold 5. Dette tillod afprøvning af natten eller scotopic vision, hvor dyret bruger sine stang fotoreceptorer at se. Betingelser blev ændret ved blot at finde den mindste mængde lys, der kræves for dyret til at udføre syn-styret assay. Analysen præsenteres her tester fotopisk syn, hvor dyret meste bruger de kegleformede fotoreceptorer at se. Ved at kombinere disse metoder, begge typer af vision, scotopic og fotopisk, kan testes.
Vi brugte denne analyse til at teste den visuelle funktion af dyr med en ektopisk øje vokset fra pluripotente celler, der overudtrykker uløseligt udtrykte øje transskription felt faktorer og den ydre faktor, Noggin. Øjne genereret fra disse væv var funktionelle 4,11. Noggin spiller også en rolle i forreste centralnervesystemet udvikling 12, men ved hjælp af denne vision-styret assay i forbindelse med dyret cap transplant assay, var dens rolle i øjet udvikling afdækket. Andre ydre faktorer, der påvirker dannelsen tidligt embryo, men har endnu ikke vist sig at have en rolle i øjet udvikling, kan induceret retinal progenitor dannelse i pluripotente dyr cap celler 4,11. Ved hjælp af denne adfærdsmæssige assay kan fremtidige undersøgelser bestemme den visuelle funktion af disse nyligt genererede øjne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra National Institutes of Health: EY015748, EY017964 (MEZ) og EY019517 (ASV). Dette arbejde blev også støttet af Forskningsrådet for at forebygge blindhed ubegrænset bevilling til Oftalmologi afdeling og løver i det centrale New York. Vi vil også gerne takke vores dyr tekniker, Matthew Mellini, for hans fremragende pleje af dyrene og for at træde til med stjerne i denne video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 Gallon Flex-Tank with Cover | eNasco | SB19271M | Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4" |
| Black electrical tape | |||
| White tissue paper | |||
| Large inoculating turntable | VWR | 50809-022 | Size: Dia 114.3 x H 76.2 mm (4 1/2 x 3") |
| Durasorb underpad | VWR | 82004-836 | Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24") |
| Kimwipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| Standard tripod | Various | ||
| iSight camera or webcam | Apple | M8817LL/A | Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see |
| Portable computer | Apple/PC | Various | We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV handycam camcorder | SONY | DCR-HC42 | Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 |
| Handycam station | SONY | DCRA-C121 | This can be used for connecting firewire to camera |
| QuickTime Player software | Quicktime | Version 10.1 | |
| 26 G Needle (5/8" length) | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Disposables | |||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | Stored at RT |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant ocean | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Stock solution = 100 g/L stored at RT |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S0876 | Stock solution = 0.4 M stored at RT |
| In vitro fertilized embryos | eNasco | LM00490MX | 100 embryos/unit |
References
- Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
- Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
- Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).
- Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
- Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
- De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
