Summary
Xenopus laevis ראשנים מעדיפים שחייה בצד הלבן של טנק בשחור / לבן. התנהגות זו מונחה על ידי החזון שלהם. בהתבסס על התנהגות זו, אנו מציגים assay פשוט כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשנים.
Abstract
מדידה של תפקוד הראייה בראשנים של הצפרדע, laevis Xenopus, מאפשרת הקרנה לעיוורון בבעלי חיים. תגובת optokinetic היא, התנהגות רפלקסיבית המבוסס על חזון שכבר נצפתה בכל בעלי החוליות שנבדקו. עיני ראשן הם קטנים כל כך התגובה להעיף זנב שימשה כאמצעי חלופי, שדורש טכנאי מיומן כדי להקליט את התגובה העדינה. פיתחנו assay התנהגות חלופי המבוסס על העובדה שראשנים מעדיפים לשחות בצד הלבן של טנק כאשר הוא ממוקם בטנק עם צדדים הן בשחור לבן. Assay שהוצג כאן מהווה חלופה זולה ופשוטה שיוצרת תגובה שנמדדת בקלות. ההתקנה מורכבת מחצובה, מצלמת האינטרנט וטנקים בדיקות מקוננות, זמינה ברוב מעבדות Xenopus. מאמר זה כולל סרט המראה את התנהגותם של ראשנים, לפני ואחרי ניתוק עצב הראייה. על מנת לבדוק את התפקוד של עין אחת, אנחנו גם כוללים ייצוגיםתוצאות sentative של ראשן שבו כל עיניים עברו axotomy רשתית בימים רצופים. מחקרים עתידיים יכולים לפתח גרסה אוטומטית של assay זה לבדיקת הראייה של ראשנים רבים בבת אחת.
Introduction
laevis Xenopus שימש כאורגניזם מודל ללמוד היווצרות עין. העיניים לפתח במהירות, הולכת וגדלה לפדיון בפחות משבוע לגנים או מסלולי בדיקה שיש להם השפעה על התפתחות ותפקוד ראייה. כדי לבדוק את התפקוד חזותי, תגובת optokinetic וoptomotor נעשתה שימוש בדג זברה וראשני Xenopus, בהתאמה 1,2. בגלל העיניים של ראשני Xenopus הן קטנות יחסית לדג זברה, assay זה מחייב שימוש בציוד מיוחד וצוות מיומן לזהות את הזנב להעיף ועיני תנועת התנהגות העדינה בXenopus. התנהגות חזקה יותר בXenopus היא ההעדפה לשחייה במכל עם רקע לבן, אשר מתואר במסמך 3. בעת ביצוע ראשן במחצית טנק שחור / חצי לבן, הראשן מראש מותמרים שוחה במהירות לצד הלבן של הטנק. אנחנו השתמשנו בעבר assay זה כדי לקבוע אם נגזר תאי pluripotentעיניים היו פונקציונליות 4. כאן אנו מדווחים גרסה מפורטת של assay זה, אשר יכול לשמש כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשני Xenopus premetamorphic.
assay זה הוא פשוט יותר מאשר assay תגובת optomotor, שכן הוא רק דורש מצלמת וידאו מותקן דיגיטלית, תוכנת מצלמה דיגיטלית וציוד סטנדרטי המצוי ברוב מעבדות Xenopus. בנוסף, התגובה נרשמה לא דורשת הכשרה מיוחדת לתוצאות עולים בקנה אחד. תוצאות הנציג שלנו מראות כי אותה הקבוצה של ראשנים, שעברה axotomy כפול רשתית, לשחות באופן אקראי מסביב לטנק. כללנו גם את תוצאות assay ההתנהגות מראשן של נציג, המראה כיצד עין אחת יכולה להיבדק על תגובה חזותית. גיליון עבודה כבר כלול כך שניתן להוסיף מספרים שנרכשו במהלך assay ונותחו. גיליון עבודה זה יכול לשמש כדי לקבוע אם יש להם את הראשנים שנבדקו תגובה חזותית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיפול בבעלי חיים
Xenopus laevis ראשנים השתמשו במחקר זה גדלו, גדלו וטופלו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי IACUC לרפואה של אוניברסיטת צפון מדינת והמדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה.
1. התקנה טרום התנהגות: ראשנים
- השג עוברי Xenopus מופרים ממקור זמין באופן מסחרי או במבחנה להפרות ביציות, כפי שתואר לעיל 6.
- הנח blastula לעוברי שלב צלחת עצביים ב18 ˚ C ב60 מ"מ צלחות פטרי המכילות 0.1X MMR [10 מניית רינגר הפתרון (MMR) השתנה של X מארק (10 מ"מ MgCl 2; 20 מ"מ KCl; 20 מ"מ CaCl 2; 50 HEPES מ"מ; 1 M NaCl; מותאם pH 7.5, autoclaved ומאוחסן ב RT)] עם האנטיביוטיקה גנטמיצין 50 מיקרוגרם / מיליליטר. שינוי 0.1X MMR בכל יום ולהסיר כל עוברים מתים.
- ברגע שעובר להגיע לשלב Nieuwkoop ופייבר ~ 27-30 יולי, לעבור העוברי דואר ל0.1X MMR ללא אנטיביוטיקה כדי לאפשר התפתחות חיידקי מעיים.
- לגדל את הראשנים עד שהם מגיעים לשלב ההאכלה (שלב 45) ולהעביר אותם ל100 מ"מ צלחות פטרי מלא ב0.1X MMR. להאכיל אותם supernatant אבקת סרפד כל יום אחר במשך שבוע, שינוי MMR 0.1X ביום שחלף.
- אחרי שבוע אחד בצלחת פטרי 100 מ"מ, להעביר חיות למחצית טנקי גלון מלאים במי צפרדע [אוקיינוס מיידי 0.5 גר '/ ליטר ו -2 dibasic פוספט מ"מ נתרן (Na 2 HPO 4: MW 141.96) pH 6.8]. להאכיל אותם כמו בשלב 2.4, אבל לשנות את המים רק 2-3 פעמים בשבוע, כאשר המים עכורים. לשמור על בעלי החיים במחזור אור הכהה light/12 שעות 12 עם אורות ההפעלה ב -6 בבוקר.
- הנח את המכל חצי ליטר עם נושאי בדיקה על משטח לבן כמו underpad מעבדה ספסל, O שעה לפחות 12 / N, לפני הבדיקה.
- ראשני מבחן בשלבי 45-50 כמתואר בשלב 3 להלן.
. 2 התקנה טרום התנהגות: Equipmenלא
- מניח בצד על שטח של המעבדה עבור assay ההתנהגות. זה צריך להיות באזור עם תאורת ניאון סטנדרטית שקט, עם תנועה נמוכה.
- הכן את טנקי בדיקות לבעלי החיים.
, טנקי בדיקות חצי ליטר מקונן מורכבים משני חלקים: מיכל פנימי שיחזיק מים וראשנים; ומכל חיצוני עם הגירוי ויזואלי.- למכל הפנימי, לעשות סימן קטן בפינות בחוץ עם נוכל, 5 סנטימטר מהחלק התחתון; זה קו המים (איור 1 א, קו מקווקו ירוק).
- כמו כן, למכל הפנימי, למלא divets במכל (בפינות והמרכז) עם מתחם אינרטי, כמו אלסטומר Sylgard. הערה: הראשנים להשתהות באזורים אלה אם הם לא מלאים פנימה
- למכל החיצוני, לכסות את המחצית בדיוק אחד מחוץ לטנק אחד עם סרט שחור חשמלי ואת החצי השני עם 1B איור נייר הטישו הלבן.
- מקם את הטנקים עליחסינו פטיפון.
- התקנת מצלמות הרשת / חצובה, כך שהוא נמצא מעל למכלי הבדיקה. כוון את המצלמה כדי לאפשר הדמיה של אזור הבדיקה, כפי שמוצג באיור 1 ג.
- חבר את מצלמת האינטרנט למחשב עם תוכנת QuickTime Player המותקנת 5. הפעל את המצלמה. בQuickTime Player, תחת קובץ, בחר "חדשה סרט הקלטה." התקנת assay ההתנהגות תהיה גלויה במחשב מייד.
- לעטוף בבד כותנה קלה על כל ההתקנה כדי להפחית סימנים חיצוניים שיכול להשפיע על התנהגות ראשן, כמו גם, להפחית את האור מוחזר על פני השטח של המים.
- ודא שעוצמת ההארה באמצעי הבד בין 35-50 cd / m 2.
3. Assay ההתנהגות
- מלא את מיכל הבדיקה הפנימי לסימן המים 5 סנטימטר נעשה בשלב 1.2.1 עם מים צפרדע.
- שימוש ברשת קטנה, בעדינות להזיז את בעל החיים לתוך טנק בדיקות הפנימי.
- Q הפתוחuickTime תוכנה במחשב, ושימוש במכל החיצוני כמדריך, ודא שהמצלמה היא מסוגלת לדמיין ולהקליט את אזור הבדיקה.
- כתוב את שם החיה, תאריך ושעה על פיסת נייר ולהקליט עם המצלמה.
- הנח את מיכל הבדיקה למכל החיצוני עם הצד השחור של הטנק לאיור מימין 2.
- להתחיל להקליט את הסרט מייד לאחר הסדרת הטנק ולהגדיר טיימר למשך 2 דקות.
- כאשר צפצופי טיימר, להסיר את מיכל הבדיקה הפנימי, לסובב את המכל החיצוני 180 מעלות ומניחים את מיכל הבדיקה הפנימי בתוך הטנק החיצוני. הפעל את שעון העצר. הערה: בצד השחור צריך עכשיו להיות בצד השני.
- חזור על שלב 3.7, שמונה פעמים יותר עבור סכום כולל של עשרה ניסיונות. השתמש באיור 2 כמדריך, בודק את כל ניסוי.
- חזור על assay ההתנהגות בשני ימים נפרדים.
4. רשתית Axotomy
- הניחו לבעלי חיים בtricaine 0.02% עד שהם לא מגיביםלקמצוץ זנב עם # 3 מלקחיים.
- להמס agarose 1% ב0.1X MMR ולאחר מכן להוסיף לצלחת פטרי 60 מ"מ. לאחר המצונן, להפוך divot מלבני קטן בagarose ולהוסיף את הראשן לdivot עם tricaine 0.02% קטנים, כדי שבעל החיים הוא שקוע בחלקו בנוזל.
- פירס העור בזווית של 45 תואר מאחורי אזור הגב של העין עם מחט 25 G, בעוד מרענן החיה נגד מלקחיים בצד השני.
- נזהר שלא לגזור את הווריד, הנמצא בסמוך לעצב הראייה, להגיע בזהירות לתוך החור עם # 5 מלקחיים, לגזור את עצב הראייה ולהעיף החוצה את דרכו. אם יש דימום חמור בשל טעות לגזום את העורק, ואז למקם את מהירות של בעלי החיים בtricaine 2% להרדים. זהירות: 2% פתרון tricaine יכול לגרום לחוסר תחושה בבני אדם. פתרון זה צריך להיות מטופלים עם כפפות.
- כדי לשחזר את בעלי החיים לאחר ניתוח, למקם את בעלי החיים ב100 מ"מ צלחת פטרי עם 0.7x MMR ו50 גנטמיצין מיקרוגרם / מיליליטר עבור 20 דקות. NeXT, ראשן העברה להחלמה מיכל עם מים צפרדע. בואו O / נ שאר בעלי החיים
- למחרת בבוקר, לבדוק את תפקוד הראייה כפי שתואר לעיל (שלבים 3.1-3.9).
5. לנתח את התוצאות
- לאחר הניסויים שתסיימו, למדוד את כמות הזמן שהראשן נשאר בצד השחור של הטנק.
- באופן ידני להציג את קטעי הווידאו באמצעות תוכנה המציגה את השעה ומאפשרת השהיה תכופה. תסתכל על זמן תצוגת וידאו. רשום את תחילת המשפט של שתי דקות, וזה כאשר המכל הפנימי מקנן בהצלחה בתוך הטנק החיצוני והוא בריבוע בתצוגה של המצלמה.
- השתמש במיקום של העיניים של הראשן להגדיר באיזה צד של טנק החיות שוחות ב. הגדר חוצה את הגבול מצד אחד של הטנק האחר רק כאשר שני העיניים חצו את הקו השחור / לבן.
- רשום את ההתחלה ואת הסוף של כל מרווח זמן (בשניות) שהחיה מבלה בצד השחור. השהה ומחדשבסופו של הווידאו כדי להבטיח דיוק. סה"כ שניות בתוך כל ניסוי.
- קלט מספרים אלה לתוך גיליון ההתנהגות המצורפת. הגיליון יהיה לחשב את היחס בין הזמן שהחיה בילתה בצד הלבן על ידי הפחתת המשך הזמן על הצד השחור של הטנק מהמשפט הכולל 120 שניות ולחלק את הסך כל הזמן בשניות [(120 - שניות בסך הכל בילו על הצד השחור) / 120 שניות]. ממוצעי גיליון יחס זה על כל 10 הניסויים.
- השתמש במבחן t של סטודנט, לזווג, הפצת שני זנב כדי לקבוע אם הניסויים בין הימים הם משמעותיים (P ≤ 0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דיווחים קודמים הראו כי ראשני Xenopus premetamorphic מעדיפים לשחות בצד הלבן של טנק בשחור / לבן וקראו assay זה, assay העדפות צבע רקע 3 שינינו assay זה על מנת לבדוק את תפקוד הראייה של שני עיניים של ראשנים ב פחות משבוע. בדרך זו, ניתן לאסוף את עיניהם לבדיקה היסטולוגית.
אנחנו מראים כאן איך התגובה היא עקב רמזים חזותיים. בסרט 1, הראשנים בלוחות השמאל וימין הם אותם בעלי החיים. בצד השמאל נמצאים את החיות לפני ניתוח ועל הימין, בעלי החיים לאחר ניתוק שני עצבי הראייה. אנחנו הסתחררנו המים כדי להראות ששום דבר לא הוסיף להדוף את בעלי החיים מהצד השחור או למשוך אותם לצד הלבן. בסרט, שאנו מספקים סכמטי של הראשנים בפינות התחתונה, אשר מציגה את המצב של עצב ראייה לכל קבוצה של בעלי חיים. בסרט 1, הנורמלי, uראשני n פעלו-מגיבים לצבע רקע בפחות מ 30 שניות במכל המבחן בעת הראשנים העיוורים לשחות ללא מטרה מסביב לטנק. המהירות של הסרטים הוגדלה והקליט את הזמן בפועל בפינה הימנית העליונה.
כדי לבדוק את הראייה של עין אחת, יש לנו כלל תוצאות מבעלי חיים שעצב הראייה נותק בעין אחת ונבדק בassay שלנו. עצב הראייה בעין השנייה נותק לאחר יומיים של בדיקות, וההתנהגות מונחה הראייה נבדקת בימים הבאים שוב. באיור 3, גרף מראה את כמות הזמן שהראשן בחר לשחות בצד השחור של הטנק. זה נמדד ביום שישה איור 3A ימים רצוף. כפי שתואר לעיל, את עצב הראייה תקין נותק לאחר ההתנהגות נבדקה ביום 2 ובשמאל, לאחר בדיקת התנהגות ביום 4. הראשן העדיף את הצד הלבן של הטנק באופן אקראי ב50% 3C איור הזמן. שים לב כיimal בילה זמן רב יותר בצד הלבן של הטנק במהלך 6 הניסויים שעבר בימים 1 עד 4. כמות הזמן שבילתה בצד השחור הייתה יותר גם בימים 5 ו -6, כאשר בעלי החיים היו עיוור בשני העיניים. תוצאות מכל אחד משני הימים היו בממוצע יחד ומוצגות באיור 3C צורת גרף.
איור 1. ניסיוני הגדרה של assay התנהגות מונחה ראייה. () טנק הבדיקה הפנימי נשאר שקוף ומסומן כדי לציין רמות מים (ירוק קווים מקווקווים בפינה). (ב ') מיכל הבדיקה החיצוני מכוסה בשחור הקלטת חשמל על נייר חצי ורקמות הלבנות אחד על השני. (C) הראשנים הם דמיינו באמצעות מצלמת אינטרנט על גבי חצובה ומחוברת למחשב נייד. טנק הבדיקות שאר s על פטיפון inoculating כדי לאפשר מפנה קל בין ניסויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. סכמטי של איך assay ההתנהגות מונחה הראייה מבוצע. המלבנים מייצגים את טנק הבדיקה, המראה כיצד חצי לבן / מחצית שטחים שחורה שינויים בכל ניסוי. זה יכול להיות בשימוש במהלך assay ההתנהגות כדי לסמן את מספר המשפט. טנק הבדיקה בצד הימין הוא תקריב של הראשן וההתנהגות הצפוי שלה במהלך assay שתי דקות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הין-page = "תמיד"> 
איור 3. ניסוי נציג ספירת אחוז הזמן שחו הראשן בצד הלבן של טנק הבדיקה. (א) הסכום של שניות הראשן בילה בצד השחור של הטנק נמדד ולהציב בטבלה. (B ) השולחן במומר אחוז מהזמן בילה בצד הלבן של הטנק. הדבר נעשה על ידי הפחתת שניות בילו בצד השחור מהזמן הכולל משפט (120 שניות) וחלוקת ידי 120 שניות. ראשנים שהיו מטופלים (U), היו לי axotomy בודד (SA) ולאחר מכן axotomy כפול (DA) נבדק. (C) הגרף מייצג את אחוז הזמן הממוצע בילה בצד הלבן (פס לבן) וצד שחור ( פס שחור). השולחן המשמש לייצור הגרף מוצג למטה.g3highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1. תגובת התנהגות של בעלי חיים רואי והעיוורים בassay העדפת הרקע הלבן. הראשנים בלוחות השמאל וימין הוא אותו הדבר, אבל אלה בצד הימין עברו axotomy הכפול ברשתית. סכמטית בפינות התחתונה מציינת אם עצב הראייה הוא (פס כחול) ללא פגע או נותק. טיימר בפינה הימנית העליונה מצביע על זמן. הסרט האיץ לצפייה קלה. פעם אחת באזור הלבן, שימו לב כמה הראשנים לשחות קרוב לגבול שבין כיוון הלבן ושחור והפוך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
| Day 1 | יום 2 | יום 3 | יום 4 | יום 5 | יום 6 | |
| ניסוי 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| ניסוי 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| משפט 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| ניסוי 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| ניסוי 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 </ Td> | 0 |
| משפט 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| ניסוי 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| ניסוי 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 9 ניסיון | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| משפט 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| יחס בין הזמן מושקע בצד לבן | ||||||
| 1 יחס | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 2 יחס | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 3 יחס | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 4 יחס | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 5 יחס | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 6 יחס | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 7 יחס | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 8 יחס | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 9 יחס | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 10 יחס | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| ממוצע | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | <td> 1.00|
| יום 1 | יום 2 | יום 3 | יום 4 | יום 5 | יום 6 | |
| ניסוי 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 69 | 69 |
| ניסוי 2 | 0 | 3 | 0 | 88 | 68 | 58 |
| משפט 3 | 7 | 0 | 28 | 0 | 58 | 47 |
| ניסוי 4 | 0 | 0 | 11 | 0 | 59 | 72 |
| ניסוי 5 | 0 | 0 | 7 | 22 | 57 | 57 |
| משפט 6 | 1 | 98 | 4 | 56 | 69 | 53 |
| ניסוי 7 | 0 | 13 | 33 | 24 | 44 | 57 |
| ניסוי 8 | 0 | 113 | 38 | 24 | 36 | 64 |
| 9 ניסיון | 0 | 0 | 4 | 43 | 60 | 57 |
| משפט 10 | 1 | 21 | 0 | 32 | 63 | 80 |
| יחס בין הזמן מושקע בצד לבן > | ||||||
| 1 יחס | 100% | 100% | 100% | 100% | 43% | 43% |
| 2 יחס | 100% | 98% | 100% | 27% | 43% | 52% |
| 3 יחס | 94% | 100% | 77% | 100% | 52% | 61% |
| 4 יחס | 100% | 100% | 91% | 100% | 51% | 40% |
| 5 יחס | 100% | 100% | 94% | 82% | 53% | 53% |
| 99% | 18% | 97% | 53% | 43% | 56% | |
| 7 יחס | 100% | 89% | 73% | 80% | 63% | 53% |
| 8 יחס | 100% | 6% | 68% | 80% | 70% | 47% |
| 9 יחס | 100% | 100% | 97% | 64% | 50% | 53% |
| 10 יחס | 99% | 83% | 100% | 73% | 48% | 33% |
| ממוצע | 99% | 79% | 90% | 76% | 51% | 49% |
גיליון 1. גיליון לבן רקע העדפת assay. יש גיליון עבודה זה החישובים שנבנו בכך שניתן להשתמש בו כדי להזין מספרים ותוצאות עולים בקנה אחד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מדווחים כאן assay מודרך חזון פשוט התנהגותיים שניתן לבצע בקלות בשבוע על ידי אנשי מעבדה מינימאלי מאומנים. בעוד מבחני אחרים דורשים ציוד מיוחד ומומחיות בהתנהגות בעלי חיים, assay זה מאפשר בדיקה מהירה כדי לקבוע תפקוד ראייה. עוד assay התנהגותיות, assay ההימנעות החזותי, פותח כדי לקבוע כיצד tectum תורם לתפיסה חזותית בXenopus 10. כוונון זה אמצעי assay במרחב וברגישות לקונטרסט בתגובה להעברה לעומת רקע יציב, ובכך, יכול למדוד התנהגות מבוססת ראיה מיוחדת יותר מ assay הפשוט דיווחו כאן. התנהגות מערכת אוטומטית כבר דיווחה כי יכול למדוד את כמות הזמן המושקעת בצד אחד של הטנק 8. יש גם תוכנה זמינה באופן מסחרי (תוכנה כל מבוך למשל) שבו נעשה שימוש כדי למדוד את הכמות של דג הזברה הזמן להשקיע בסביבות כהות או בהירות 9.ssay אנו מדווחים כאן אינו דורשים הרכישה של סוגים אלה של ציוד או תוכנה יקר, אך במקום זאת מסתמך על חומרים כימיים וציוד יומיומיים כדי למדוד את התפקוד חזותי.
Assay מודרך הראייה מבוצע על חיה אחת כדי לבדוק את תפקוד הראייה שלה. כאשר משווה את תוצאות assay התנהגותיים של כמה ראשנים אחד לשני, אנחנו לא הבחנו בהבדל סטטיסטי בין בעלי חיים בקבוצות טיפול. בדקנו שלושה ראשנים בשישה ימים רצופים וגם נבדקו עוד חמישה בעלי חיים על שלושה ימים רצופים, ריצת עשרה ניסויים ליום. בכל מקרה, לא מצאנו שינויים משמעותיים מבחינה סטטיסטית בין הקבוצות שלא טופלו או axotomy יחיד (P = .2067), ובכל זאת השגתי שינוי משמעותי מבחינה סטטיסטית, כאשר בעלי החיים אלה הושוו לקבוצה הכפולה axotomy (P = 0.002). זה נמדד באמצעות תוכנת 6.0c פריזמה פועל מבחן סטטיסטי 2-way ANOVA עם המבחן של Tukey מספר השוואה (n = 8 ראשנים). כדי לקבל את המקסימוםכמות נקודות נתונים לפני הניתוח, אנו מציעים באמצעות assay ההתנהגות של שישה הימים. אם תוצאות צריכים להיות מושגת מהר יותר עם פחות ניוון של הרקמה, אנו מציעים המערכת של שלושה ימי שימוש.
assay זה ניסויים בבעלי חיים אחד בכל פעם. ביצענו מחקרי טייס כדי לראות אם שני ראשנים או יותר ניתן היה למדוד בו זמנית. כדי לקבוע אם יש שני ראשנים בטנק אחד שנפגע ההעדפה שלהם לצד הלבן של הטנק, בדקנו כל ראשן בנפרד ולאחר מכן ביחד. מאז התמונות צולמו מעל המכל, אם הראשנים שחו מעל או מתחת לאחד את השני לכל אורך זמן, מצאנו את זה קשה להבדיל ביניהם. אם היינו ראשנים בגדלים שונים, שמנו לב שאחד הגדול יותר ישפיע בו שחו אחד הקטן יותר. טכנולוגיות עתיד יכולה להיות מפותחות לראשנים גנטי סימן, אשר יאפשר מעקב טוב יותר של בעלי חיים רבים באותו הגודל.
בביצוע assay זה על עשרות tadpoles, שמנו לב שכמה ראשנים העדיפו את הצד הלבן באופן עקבי יותר מאשר לאחרים. ראשנים, שהתנהגותם הייתה שונה על ידי יותר מ 10% על שני ימים רצופים, היינו לוקח נבדקו שוב ביום שלישי לפני הניתוח. זה היה אולי בגלל תצפית נוספת: שמה לב שהצבת החיות על רקע לבן גם עשתה את הבדל בהעדפה שלהם לצד הלבן של הטנק. לאחר שיום נוסף אולי סייע להתנות כמה ראשנים להעדיף את הצד הלבן של הטנק. הגבלה של assay זה היא שזה רק בדיקות תפקוד ראייה. ההשתנות שצפינו יכולה להיות כתוצאה מפגמים התפתחותיים אחרים, מלבד תפקוד ראייה מופחת או עיוורון. מסיבה זו, בעלי חיים שהראו העדפה פחות מ 60% לפני הניתוח לא נבדקו נוסף.
גם בדקנו טווח גילים של ראשנים מראש מותמרים. מצאנו כי ראשנים צעירים משלב 45 היו קטנים מאוד ועיניהם היו קשה לעקוב אחר השימוש שBcAm. ראשנים מבוגרים (שלבי 51-55 +) היו מוסחים יותר; למרות שהם בילו יותר זמן בסופו של דבר בצד הלבן של המכל, נראה שהם לוקחים יותר זמן לשחות שם. בעלי החיים המבוגרים אלה היו גדולים יותר, ולכן, קלים יותר לעקוב אחר, אבל נדרשים בדיקות לפני הניתוח כאמור לעיל. לעומת זאת, הרוב המכריע של ראשנים בשלב 45 עד 50 התנהג כצפוי ובעלי החיים בגילים אלה יהיו הכי טובים להשתמש במחקרים עתידיים.
שינויי אור היממה הוכחו להשפיע תגובות התנהגותיות מונחה חזון בXenopus 2. עולה בקנה אחד עם תצפית זו, הבחנו כי אותו בעל החיים ששחו במהירות לצד הלבן של טנק המבחן בניסויים שנערכו בבוקר, לקחו הרבה יותר זמן במבחני התנהגות אחר הצהריים. לאחר ביצוע מספר 'חיה אותו / זמן שונה "ניסויים, קבענו את הזמן הטוב ביותר עבור assay ההתנהגות היה 06:00-13:00.
יש לנו גם השתמשתי בhandh דיגיטליישנות מצלמת וידאו מחובר באמצעות firewire כדי לבדוק את החיות בתנאי אור נמוכים 5. הבדיקות אפשרו הזה בחזון הלילה או scotopic, שבו בעלי החיים משתמשים בקולטני אור המוט שלה כדי לראות. תנאים שונו על ידי פשוט למצוא את הכמות המינימאלית של אור הדרוש לבעלי החיים כדי לבצע את assay מונחי החזון. Assay שהוצג כאן בדיקות ראיית photopic, שבו בעלי החיים בעיקר משתמשים בקולטני אור החרוט שלה כדי לראות. על ידי שילוב של גישות אלה, בשני הסוגים של חזון, scotopic וphotopic, יכולים להיבדק.
אנו משמשים assay זה כדי לבדוק את תפקוד הראייה של בעלי חיים עם עין מחוץ לרחם גדלה מתאי pluripotent ביתר גורמי שעתוק שדה עין הביעו באופן מהותי וגורם החיצוני, Noggin. עיניים המופקות מרקמות אלה היו פונקציונליות 4,11. גולגולת גם משחקת תפקיד בהתפתחות הקדמית של מערכת עצבים מרכזית אך 12 באמצעות assay מודרך חזון זה בשיתוף עם TR כובע בעלי החייםassay ansplant, תפקידה בפיתוח העין נחשף. גורמים חיצוניים אחרים המשפיעים על היווצרות עובר מוקדמת, אבל עדיין לא הוכח יש תפקיד בהתפתחות העין עלול המושרה היווצרות אב רשתית בתאי כובע בעלי החיים pluripotent 4,11. שימוש assay ההתנהגות הזה, מחקרים עתידיים יכולים לקבוע את תפקוד הראייה של עיניים שנוצרו זה עתה אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות: EY015748, EY017964 (MEZ), וEY019517 (ASV). עבודה זו נתמכה גם על ידי המחקר למניעת העיוורון החופשי גרנט למחלקת העיניים והאריות של מרכז ניו יורק. כמו כן, אנו רוצים להודות לטכנאים שלנו בעלי החיים, מתיו Mellini, לטיפולו מצוין של בעלי החיים ולדריכה בלככב בסרטון זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 Gallon Flex-Tank with Cover | eNasco | SB19271M | Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4" |
| Black electrical tape | |||
| White tissue paper | |||
| Large inoculating turntable | VWR | 50809-022 | Size: Dia 114.3 x H 76.2 mm (4 1/2 x 3") |
| Durasorb underpad | VWR | 82004-836 | Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24") |
| Kimwipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| Standard tripod | Various | ||
| iSight camera or webcam | Apple | M8817LL/A | Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see |
| Portable computer | Apple/PC | Various | We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV handycam camcorder | SONY | DCR-HC42 | Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 |
| Handycam station | SONY | DCRA-C121 | This can be used for connecting firewire to camera |
| QuickTime Player software | Quicktime | Version 10.1 | |
| 26 G Needle (5/8" length) | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Disposables | |||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | Stored at RT |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant ocean | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Stock solution = 100 g/L stored at RT |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S0876 | Stock solution = 0.4 M stored at RT |
| In vitro fertilized embryos | eNasco | LM00490MX | 100 embryos/unit |
References
- Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
- Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
- Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).
- Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
- Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
- De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
