Introduction
Dopamine (DA) neuronen te vinden in verscheidene hersengebieden, waaronder de middenhersenen, hypothalamus, retina en reukkwabben. De A9 DA neuronen in de substantia nigra pars compacta (SNpc) controle gedrag en beweging door het projecteren naar het striatum in de voorhersenen en de vorming van het extrapiramidale motorische systeem. Degeneratie van de A9 DA neuronen leidt tot de ziekte van Parkinson (PD), dat is de tweede meest voorkomende menselijke neurodegeneratieve aandoening en op dit moment ongeneeslijk. Vervangende Celtherapie is een van de meest veelbelovende strategieën voor de behandeling van PD 1, derhalve is er een grote belangstelling voor het afleiden A9 DA neuronen tegen humane pluripotente stamcellen (hPSCs) geweest, zowel humane embryonale stamcellen (hESCs) en recente humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs).
Veel onderzoek is geprobeerd om A9 DA neuronen ontlenen hPSCs met behulp van verschillende methoden. De eerste rapporten alle gegenereerde DA neuronen via een neuralerozet voorlopercellen podium. Door co-kweken met MS5 2 of PA6 3-5 stromale cellen met of zonder externe groeifactoren voor 2-4 weken, L. Studer en collega's en drie andere groepen met succes geïnduceerde hESCs neurale rozetten produceren. Vervolgens verrijkt deze rozetten met mechanische ontleding of enzymatische digestie voor verdere differentiatie. In andere rapporten, onderzoekers gegenereerd neurale rozetten door embryoid lichaam (EB) drijvende cultuur differentiatie 6-9. Later, onderzoekers werd een monolaag gebaseerd differentiatie werkwijze 10,11, waar ze uitgeplaat hESCs en hiPSCs op extracellulaire matrix, verschillende groeifactoren toegevoegd aan de kweek tot de differentiatie van hPSCs DA neuronen, die de in vivo embryonale DA neuron ontwikkeling nabootst induceren . Hoewel al deze studies verkregen tyrosine hydroxylase (TH) -expressie cellen met een aantal kenmerken van DA neuronen, het hele proces van differentiatie is tijd en arbeid consumeren,algemeen inefficiënt, en nog belangrijker, werden de A9 identiteit van deze neuronen niet aangetoond in de meeste studies behalve degene met LMX1a ectopische expressie 12. Onlangs is een nieuwe vloerplaat (FP) gebaseerde protocol ontwikkeld 13-16, waarbij de FP voorlopers met DA neuron potentiële eerst werden gegenereerd door activering van de sonic hedgehog en Wnt signaalpaden in een vroeg stadium van differentiatie, en deze FP cellen werden verder gespecificeerd naar DA neuronen. Hoewel dit protocol efficiënter, zijn er nog problemen; bijvoorbeeld, de hele differentiatieproces kost tijd (ten minste 35 dagen) en feeder celafhankelijke 15, of EB afhankelijk 16 of A9 identiteit niet aangetoond 14.
Hier, op basis van de kennis van in-vivo embryonale DA neuron ontwikkeling en de gepubliceerde resultaten van andere onderzoekers, we hebben de kweekomstandigheden voor de eff geoptimaliseerdeicient generatie DA neuronen van zowel hESCs en hiPSCs. We hebben eerst gegenereerd FP voorloper cellen door activering van het Wnt-signalering met op kleine moleculen CHIR99021 en sonic hedgehog signalering met kleine moleculen SAG en purmorphamine. Deze FP-cellen brengen FOXA2, LMX1a, CORIN, OTX2 en nestine. We hebben toen aangegeven deze FP cellen naar DA neuronen met groeifactoren zoals BDNF, GDNF, etc. De gegenereerde DA neuronen van A9 celtype als ze positief voor GIRK2 maar negatief voor Calbindin 17. Dit protocol is feeder cel of EB onafhankelijke, zeer efficiënte en reproduceerbaar. Met dit protocol kan men afleiden DA neuronen in minder dan 4 weken van hESCs of hiPSCs normale personen voor celtransplantatie, of hiPSCs PD patiënten in vitro modellen van PD of testen van potentiële therapeutische middelen voor PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Voorbereiding van Cultuur Media
- Bereid muis embryonale fibroblasten (MEF) medium door combinatie van de volgende: 445 ml DMEM, 50 ml foetaal runderserum (FBS) en 5 ml 100x penicilline / ampicilline voorraadoplossing. Houd filter gesteriliseerd bij 4 ° C gedurende ten hoogste 14 dagen.
- Bereid serumbevattend HPSC kweekmedium door combinatie van de volgende: 385 ml DMEM / F12, 100 ml knockout serum vervanging (KSR), 5 ml 100x niet-essentiële aminozuren stockoplossing, 5 ml 100x penicilline / ampicilline stockoplossing, 5 ml 100x mercaptoethanol voorraadoplossing en 10 ng / ml bFGF. Blijf filter gesteriliseerd medium bij 4 ° C gedurende maximaal 10 dagen.
- Bereid mTeSR1 serumvrij medium door combinatie van de volgende: 400 ml mTeSR1 basaal medium, 100 ml 5x supplement en 5 ml 100x penicilline / ampicilline voorraadoplossing. Bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 10 dagen.
- Bereid 10x collagenase IV stamoplossing: weeg 0,5 g collagenase IV macht, enlos het op met 50 ml DMEM / F12 en filter steriliseren. Voeg aliquots en voorraad ze bij -20 ° C gedurende maanden.
- Bereid 0,1% gelatine-oplossing: weeg 0,5 g gelatine (van runderen huid, type B) kracht en los het op met gedemineraliseerd water. Blijf autoclaaf gesteriliseerde oplossing bij kamertemperatuur weken.
- Bereid KSR differentiatiemedium door combinatie van de volgende: 410 ml DMEM, 75 ml KSR, 5 ml 100x niet-essentiële aminozuren stockoplossing, 5 ml 100x penicilline / ampicilline stockoplossing, 5 ml 100x mercaptoethanol voorraadoplossing. Blijf filter gesteriliseerd medium bij 4 ° C gedurende maximaal 10 dagen.
OPMERKING: KSR varieert van partij tot partij, die de differentiatie efficiëntie kunnen beïnvloeden. Het is daarom beter om verscheidene partijen KSR testen om de beste voor differentiatie te vinden. - Bereid N2 differentiatiemedium door het combineren van de volgende: 98 ml DMEM, 1 ml 100x N2 supplement en 1 ml 100x penicilline / ampicilline voorraad oplossing. Blijf filter gesteriliseerd bij 4° C voor niet meer dan 10 dagen.
- Bereid B27 differentiatiemedium door het combineren van de volgende: 480 ml Neurobasal medium, 10 ml 50x B27 supplement, 5 ml 100x Glutamax stockoplossing, en 5 ml 100x penicilline / ampicilline voorraad oplossing. Blijf filter gesteriliseerd medium bij 4 ° C gedurende maximaal 10 dagen.
2 Cultuur van hESC en hiPSCs op MEF feeder cellen
De H9 hESCs werden verkregen uit WiCell Research Institute en hiPSCs werden in de Reijo Pera laboratorium door-retrovirus bemiddelde transductie van Yamanaka gevestigde factoren Okt3 / 4, SOX2, KLF4, en c-MYC 18.
- Ten minste een dag vóór cel passage, bereiden wat gelatine platen door 1 ml 0,1% gelatine 1 putje van platen met 6 putjes en incubeer platen bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten.
- Na incubatie aspireren gelatine uit platen en zaad bestraling geïnactiveerd MEF cellen op de platen aan de dichtheid van 1,6 x 10 5 cellen/ Putje in MEF medium met behulp van een hemocytometer om de cellen te tellen.
OPMERKING: Eventueel bereiden MEF feeders zo vroeg als 3 dagen voor celpassage. - Passage cellen een dag na het uitplaten MEF feeders: aspireren medium van hPSCs, voeg 1 mg / ml collagenase IV cellen per 1 ml / putje en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Tijdens deze incubatie, wassen MEF feeders eenmaal met PBS, en voeg warm (37 ° C) serumbevattend HPSC kweekmedium met 1,5 ml / putje.
- Na 1 uur, tik op de cultuur plaat een paar keer, zodat het grootste deel van de ongedifferentieerde kolonies zal losmaken van de platen, terwijl de gedifferentieerde koloniën verbonden blijven. Verzamel zorgvuldig de drijvende kolonies, en breng ze in 15 ml tube.
- Voorzichtig de plaat eenmaal met warm (37 ° C) DMEM / F12 en DMEM overdragen / F12 in dezelfde 15 ml buis.
- Centrifugeer de buizen bij 179 xg gedurende 3 minuten.
- Zuig medium van de buizen, zorg dat u de pellet te verstoren. Oorlog toevoegenm HPSC kweekmedium, pipet de cellen op en neer meerdere malen om ze te breken in kleine clusters en meng ze goed.
- Breng de cellen op nieuwe MEF feeders op 1: 3-1: 6 verhouding.
- Verander het medium elke dag en passage van de cellen om de 5-6 dagen.
3 Bereiding van cellen voor differentiatie
- Ten minste een dag vóór de bereiding van cellen, bereiden wat Matrigel platen (meestal 3 wells van een 6-well plaat). Verdun de Matrigel met koud (4 ° C) DMEM / F12 om 1:40 en voeg 1 ml Matrigel per putje van platen met 6 putjes. Incubeer Matrigel platen bij 4 ° C overnacht. OPMERKING: Men kan Matrigel platen dichten met Parafilm en voorraad hen bij 4 ° C voor zo lang als een week.
- Gebruik cellen (zie stap 2) 4 dagen na de passage. Verwijder al het gedifferentieerde kolonies van de platen. Zuig medium uit de kweek plaat, voeg 1 ml Accutase per putje en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Tijdens de incubatie, bereiden wat gelAtin platen door 1 ml gelatine 1 putje van platen met 6 putjes. Plaats deze platen en de Matrigel-platen voorbereid op een dag voordat in de broedstoof.
- Na 5 min incubatie of wanneer cellen zijn semizwevende, pipet cellen en neer meerdere malen om ze te maken in enkele cellen.
- Verzamel enkele cellen in 15 ml buizen en centrifugeer bij 258 xg gedurende 3 minuten.
- Resuspendeer cellen met geschikte hoeveelheid serum bevattend HPSC kweekmedium en voeg Thiazovivin aan de uiteindelijke concentratie van 2 uM.
- Transfer cellen op gelatine beklede platen 1: 1 verhouding en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 30 minuten om MEF feeders verwijderen.
- Breng de cellen een 15 ml conische buis, voeg juiste serum bevattend medium HPSC en tel de cellen met een hemocytometer.
- Centrifugeer de cellen bij 258 g gedurende 3 minuten.
- Tijdens centrifuge, voeg Thiazovivin aan mTeSR1 medium geschikt is om een concentratie van 2 uM maken.
- Na centrifuge, eenSpirate het medium en voeg passende mTeSR1 medium met Thiazovivin zodat er 1,8 x 10 5 cellen / ml medium.
- Haal de Matrigel platen uit de incubator, zuig het Matrigel en voeg 2 ml van de gemengde cellen op 1 goed van de 6-well platen.
OPMERKING: De celdichtheid dient 3,6 x 10 4 cellen / cm 2 oppervlakte. - Zet de borden terug naar de couveuse, en laat de cellen hechten gedurende 24 uur.
- 24 uur na plating de cellen, zuigen oude medium en voeg 2 ml nieuwe mTeSR1 medium per putje en laat cellen groeien voor nog eens 24 uur voor aanvang van de differentiatie.
Cell Differentiation
- Start differentiatie 48 uur na opnieuw platen van de cellen op Matrigel platen.
- Aspireren kweekmedium van de plaat, was cellen eenmaal met PBS, en 2 ml van de volgende differentiatie medium per well: KSR differentiatie medium aangevuld met 10 pM en 100 nM SB431542 LDN-193189. markeren deze dag als D0 van differentiatie.
- Veranderen medium elke dag van D0 tot D20.
OPMERKING: Men kan medium bereiden voor maximaal 2 dagen per keer. - Gebruik de volgende medium voor D1 en D2: KSR differentiatie medium aangevuld met 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 pM SAG, 2 uM purmorphamine en 50 ng / ml FGF8b.
- Gebruik de volgende medium voor D3 en D4: KSR differentiatie medium aangevuld met 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 pM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b en 3 uM CHIR99021.
- Gebruik de volgende medium voor D5 en D6: 75% KSR differentiatie medium plus 25% N2 differentiatie medium aangevuld met 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, en 3 uM CHIR99021.
- Gebruik de volgende medium voor D7 en D8: 50% KSR differentiatie medium plus 50% N2 differentiatie medium aangevuld met 100 nM LDN-193189 en 3 uM CHIR99021.
- Gebruik de volgende medium voor D9 en D10: 25% KSR differentiatie medium plus 75% N2 differentiatie medium aangevuld met 100 nM LDN-193189 en 3 uM CHIR99021.
- Gebruik de volgende medium voor D11 en D12: B27 differentiatie medium gesupplementeerd met 3 uM CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM ascorbinezuur en 0,1 mM cAMP.
- Gebruik de volgende medium voor de rest van differentiatie: B27 differentiatie medium aangevuld met 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM ascorbinezuur en 0,1 mM cAMP.
- Rond D16 van differentiatie, bereiden wat poly-L-ornithine / laminine / fibronectine platen. Verdun Poly-L-ornithine voorraadoplossing met koud (4 ° C) PBS tot 15 ug / ml, voeg 1 ml 1 putje van platen met 6 putjes en incubeer de platen bij 37 ° C overnacht.
- Zuig het poly-L-ornithine oplossing was de platen 3 maal met steriel water en daarna aan de lucht drogen de platen.
- Verdunnen laminin voorraad solution met koud (4 ° C) PBS tot 1 ug / ml, voeg 1 ml aan een putje van platen met 6 putjes en incubeer de platen bij 37 ° C overnacht.
- Zuig het laminin oplossing, wassen de platen 3 keer met steriel water en vervolgens aan de lucht drogen de platen.
- Verdun fibronectine voorraadoplossing met koud (4 ° C) PBS tot 2 ug / ml, voeg 1 ml 1 putje van platen met 6 putjes en incubeer de platen bij 37 ° C overnacht.
- Verbinding platen met Parafilm en plaats ze bij 4 ° C gedurende wel twee weken.
- Na 20 dagen van differentiatie, replate de cellen aan de poly-L-ornithine / laminine / fibronectine platen. Zuig differentiatiemedium, voeg 1 ml warm (37 ° C) Accutase 1 putje van platen met 6 putjes en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Tijdens de incubatie plaats de poly-L-ornithine / laminine / fibronectine platen in de incubator.
- Na 5 min incubatie of wanneer cellen zijn semizwevende voorzichtig pipet cellen en neer meerdere malenze in afzonderlijke cellen.
- Verzamel de enige cellen in 15 ml conische buizen, en voeg de juiste hoeveelheid Neurobasal medium voor celtelling, die variëren afhankelijk van expansie (na 11 dagen van differentiatie, cellen 15-20 voudig vergroten). Tel de cellen met een hemocytometer.
- Centrifugeer de cellen bij 258 g gedurende 3 minuten. Zuig supernatant en resuspendeer cellen met B27 differentiatiemedium zodat de celconcentratie 1 x 10 6 cellen / ml medium.
- Zuig fibronectine uit de platen twee keer wassen met PBS, en voeg 2 ml cellen 1 putje van platen met 6 putjes.
OPMERKING: De celdichtheid voor replating moet 2 x 10 5 cellen / cm 2 oppervlakte. - Veranderen medium 24 uur later aan een losse dode cellen te verwijderen.
- Verandering medium om de dag tot de gewenste tijdstippen voor een gegeven experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van de differentiatie protocol wordt getoond in figuur 1. Het rendement van de differentiatie protocol hier gepresenteerde steunt op de status van de uitgangscellen. Daarom is het essentieel om ervoor te zorgen dat eerste verwijdert alle gedifferentieerde koloniën voor dissociëren hPSCs in enkelvoudige cellen voor differentiatie en anderzijds een put meeste, zo niet alle, de MEF feeder-cellen door de cellen te incuberen op gelatine beklede platen gedurende 30 min, en derde, de platen HPSC enkele cellen in de juiste dichtheid op Matrigel plaat. Zoals geïllustreerd in figuur 2, replated HPSC enkele cellen toeneemt naarmate clusters binnen 48 uur voor differentiatie, die ongeveer 70% samenvloeiing in de platen. Dan na differentiatie van deze cellen te bereiken volledige samenvloeiing in zo kort 3-4 dagen, en het starten van rond D16-D17, deze samenvloeiende cellen beginnen met een aantal ruimtes in de platen te maken, en sommige axonen / neurites kon alworden waargenomen in deze ruimten onder de cellagen. Na te zijn replated bij D20, de gedifferentieerde cellen bevestigd en groeide als kleine bosjes. Vervolgens gedurende de komende 5 dagen, veel intensiever en morfologisch intacte axonen / neurites komen uit de bosjes, en axonen / neurites uit verschillende groepjes te vormen sommige verbindingen. Tijdens een langdurige cultuur, neuronen in een klomp genereren van meer extensies, krijgen meer volwassen en hebben meer verbindingen met neuronen in naburige bosjes.
Na 11 dagen van differentiatie kan hPSCs efficiënt worden omgezet FP precursoren, en zoals geïllustreerd in figuur 3, bijna alle cellen brengen de FP precursor cel markers nestine en FOXA2, en meer dan 90% van de cellen tot expressie nog drie markers CORIN, OTX2 en LMX1a. Dan na meerdere dagen van differentiatie, de FP voorloper cellen worden gespecificeerd naar DA neuronen als ze uiten TUJ1 en TH (Figuur 4A). Deze DA neuronen van A9 identiteit als ze express GIRK2 terwijl zijn negatief voor Calbindin (Figuur 4B). Immunokleuring experimenten tonen ook aan dat er geen GFAP + astrocyten en weinig GABAerge neuronen (Figuur 4C), wat aangeeft dat de differentiatie uitsluitend gespecificeerd naar de DA neuron lineage.
Figuur 1 Overzicht van de differentiatie protocol, met groeifactoren / kleine moleculen en kweekmedium gebruikt voor elke dag. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 Morphological verandert tijdens differentiatie. H9 hESCs werden uitgeplaat als enkele cellen in de geschikte celdichtheid beschreven, en 48 uur daarna deze cellen bereiken ongeveer 70% samenvloeiing in de plaat als kolonies (D0). Gedurende de eerste enkele dagen van differentiatie, de cellen snel uit te breiden tot meer dan 90% confluentie na 24 uur van differentiatie (D1), en vervolgens confluentie worden na nog 48 uur (D3). De meeste van deze cellen nog vertonen typisch hESC morfologie met grote kern naar cytoplasma verhouding (D3). Differentiatie gaat, cellen uit te breiden meer en verliezen geleidelijk hESC morfologie. Eind D11 van differentiatie, zijn er meerdere cellagen in vele delen van de plaat, zoals blijkt uit donkere kleur van cellen in bepaalde gebieden buiten de andere (D11). Vanaf ongeveer D17 tot D20, sommige cellen stierven, waardoor sommige ruimtes in de plaat, en enkele neuron projecties kon al worden waargenomen in deze ruimten eennd soms onder de cellaag (D20). Na cel replating eind D20 om meer ruimte te maken voor cellen groeien en differentiatie, cellen aggregeren als kleine clusters, veel meer axonen / neurieten hieruit ook clusters en axonen / neurieten uit verschillende clusters aantal verbindingen in zo kort 4-5 dagen (D25). Schaal bar, 200 pm.
Figuur 3 Immunokleuring voor FP markers in een vroeg stadium van differentiatie. H9 hESC 'werden onderscheiden voor 11 dagen met behulp van de hier beschreven protocol. Cellen werden vervolgens gefixeerd met 4% paraformaldehyde, gepermeabiliseerd met Triton X-100, geblokkeerd met ezel serum en daarna gekleurd voor FP precursor cel markers. Zoals hier getoond, vrijwel alle cellen tot expressie FOXA2 en nestine en meer dan 90% van de cellen tot expressie LMX1a, CORIN enOTX2, wat wijst op een zeer hoog rendement conversie van hESCs aan FP cellen. Schaal bar, 200 pm.
Figuur 4 Immunokleuring voor DA neuron markers in late stadia van differentiatie. (A) H9 hESCs werden gedifferentieerd voor 25 dagen, en de cellen werden onderworpen aan immuunkleuring voor de pan-neuron marker TUJ1 en de meest gebruikte DA neuron marker TH. Zoals hier getoond, hoewel er meer TUJ1 positieve cellen dan TH positieve cellen, de TH-expressie brengende cellen residu in het TUJ1 expressie brengen, en TH-expressie brengende cellen ten minste de helft van alle cellen. (B). De H9 hESCs werden verder gedifferentieerd voor nog eens 25 dagen (totaal 50 dagen) en dan de cellen werden onderworpen aan immunostaining. De resultaten toonden dat er een hoger percentage van TH-cellen tot expressie theen die bij d25. Bijna al deze TH-expressie brengen ook uiten GIRK2 terwijl de meeste van hen zijn negatief voor Calbindin, met vermelding van de A9 subtype identiteit van de gegenereerde DA neuronen, wat is het type cel dat verloren gaat in de PD. (C) Immunokleuring voor cellen bij D25 differentiatie bleek dat er geen cellen die GFAP en zeer weinig cellen tot expressie GABA. Schaal bar, 200 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Humane pluripotente stamcellen (zowel hESCs en hiPSCs) kunnen worden gedifferentieerd in vitro te genereren meeste, zo niet alle celtypen van het lichaam waaronder DA neuronen, die is aangetoond in eerdere studies 19. Hier, op basis van kennis van embryonale dopaminerge ontwikkeling 20 en gepubliceerde protocollen van andere laboratoria 14,15, optimaliseerden we de kweekomstandigheden voor de productie van DA neuronen in hESCs en hiPSCs. Dit protocol is efficiënt, reproduceerbare en we hebben met succes dit protocol hier beschreven H1 en H9 hESC lijnen en de hiPSC lijnen van zowel de PD-patiënten en onaangetast controles toegepast.
In ons protocol, zijn er drie belangrijke stappen om de grote differentiatie rendement te bereiken: Ten eerste moet er geen gedifferentieerde HPSC kolonies in de cellen voor gerichte differentiatie. Spontane differentiatie alle weefsels wordt vaak gezien in hPSC cultuur, is het belangrijk om deze gedifferentieerde koloniën te verwijderen voordat dissociëren deze hPSCs in enkele cellen. Ten tweede moet MEF feeders worden uitgeput uit de gedissocieerde hPSCs, zoals eerdere rapporten is gebleken dat MEF cellen kan geheim factoren die zelf-vernieuwing stimuleren en remmen differentiatie 21. Daartoe incuberen van de HPSC en MEF celmengsels on-gelatine beklede platen gedurende 30 min mogen hebben bijna alle MEF cellen verwijderen. Ten derde moet de interne hPSCs worden uitgeplaat op de juiste celdichtheid voor differentiatie. Het verhogen van de celdichtheid zal leiden tot de dood van de meeste cellen rond D11 van differentiatie, terwijl het verlagen van de celdichtheid leidt tot het losmaken en de dood van cellen in het midden van de plaat zo kort minder dan 7 dagen, hoewel cellen op de rand zal goed onderscheid (gegevens niet getoond). Als observeert deze drie criteria, is het gemakkelijk om DA neuronen efficiënt verkrijgen van hPSCs ons stapsgewijze protocol.
De hier gepresenteerde protocol is voornamelijk gebaseerd op een eerder rapport van L. Studer en collega's 14, met enkele wijzigingen. Ten eerste, de differentiatie hier was begonnen 48 uur na een enkele cel plating wanneer cellen bereiken slechts ongeveer 70% samenvloeiing, terwijl in hun verslag, werd differentiatie gestart wanneer de cellen vol samenvloeiing (3 of meer dagen van de cultuur na enkele cel plating) te bereiken. In onze ervaring, te beginnen differentiatie van samenvloeiende cellen zonder celpassage tot en met dag 20 leidt tot ernstige celdood tijdens het proces van differentiatie. Ten tweede, vervangen we de dure SHH eiwit in hun studie met SAG, een-chlorobenzothiophene met kleine molecule agonist voor HH pad 22. Daarom is, in vergelijking met eerder gepubliceerde protocollen, deze hier beschreven is feeder cel en neurale rozet onafhankelijk, en is vooral gebaseerd op kleine moleculen voor FP-specificatie; het is dus goedkoper en minder tijd en werk kost. Natuurlijk, de limitation van dit protocol is het gebruik van KSR de eerste dagen van differentiatie. KSR varieert van partij tot partij, die de differentiatie efficiëntie kunnen beïnvloeden. Daarom moet men verschillende batches van KSR testen om degene die het beste werkt in het induceren van FP voorlopers na 11 dagen van differentiatie te krijgen.
Samenvattend moet de differentiatie protocol here descried vergemakkelijken: (1) het genereren van DA neuronen in hESCs of hiPSCs normale personen voor celvervangingstherapie voor PD; (2) het genereren van DA neuronen in PD patiënten iPSCs in vitro modelleren en testen van potentiële therapeutische middelen voor PD; (3) de studie van de genen / signaalwegen reguleren menselijke DA neuron ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| penicillin/ampicillin | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| Non-essential amino acid | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Collagenase IV | Life Technologies | 17104-019 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Growth factor reduced matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-beta3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Mouse anti human NESTIN antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human OTX2 antibody | Millipore | AB9566 | 1/2,000 dilutiion |
| Goat anti human FOXA2 antibody | R&D Systems | AF2400 | 1/200 dilution |
| rabbit anti human LMX1a antibody | Millipore | AB10533 | 1/1,000 dilution |
| Rabbit anti human TH antibody | Pel Freez | P40101 | 1/500 dilution |
| Chicken anti human TH antibody | Millipore | AB9702 | 1/500 dilution |
| Mouse anti human TUJ1 antibody | Covance | MMS-435P | 1/,2000 dilution |
| Rabbit anti human GIRK2 antibody | Abcam | ab30738 | 1/300 dilution |
| Rabbit anti human Calbindin antibody | Abcam | ab25085 | 1/400 dilution |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 |
References
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 12543-12548 (2004).
- Park, C. H., et al. In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. Journal of Neurochemistry. 92, 1265-1276 (2005).
- Buytaert-Hoefen, K. A., Alvarez, E., Freed, C. R. Generation of tyrosine hydroxylase positive neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and exposure to GDNF. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 669-674 (2004).
- Zeng, X., et al. Dopaminergic differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells. 22, Dayton, Ohio 925-940 (2004).
- Yan, Y., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Schulz, T. C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells. 22, 1218-1238 (2004).
- Park, S., et al. Generation of dopaminergic neurons in vitro from human embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neuroscience Letters. 359, 99-103 (2004).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3392-3397 (2008).
- Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Molecular and Cellular Neurosciences. 45, 258-266 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, 275-280 (2009).
- Sanchez-Danes, A., et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Human Gene Therapy. 23, 56-69 (2012).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6, 336-347 (2010).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
- Xi, J., et al. Specification of midbrain dopamine neurons from primate pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 1655-1663 (2012).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1, 703-714 (2012).
- Mendez, I., et al. Cell type analysis of functional fetal dopamine cell suspension transplants in the striatum and substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Brain: a Journal of Neurology. 128, 1498-1510 (2005).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nishimura, K., Takahashi, J. Therapeutic application of stem cell technology toward the treatment of Parkinson's disease. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 36, 171-175 (2013).
- Smidt, M. P., Burbach, J. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nature Reviews. Neuroscience. 8, 21-32 (2007).
- Wang, G., et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochemical and Biophysical Research Communications. 330, 934-942 (2005).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14071-14076 (2002).
